17β-雌二醇聯合苯并芘異常激活人肺腺癌A549細胞中AHR/PD-L1軸*

馮昊， 曹伯雄， 昝自亮， 賀澤民， 黃浩， 皇改改， 魏強△

17β-雌二醇聯合苯并芘異常激活人肺腺癌A549細胞中AHR/PD-L1軸*

馮昊1， 曹伯雄1， 昝自亮1， 賀澤民1， 黃浩1， 皇改改2， 魏強1△

（1成都市雙流區第一人民醫院胸外科，四川 成都 610000；2成都市雙流區第一人民醫院醫學檢驗科，四川 成都 610000）

探討17β-雌二醇（17β-estradiol， E2）和苯并芘（benzopyrene， BaP）對人肺腺癌A549細胞程序性死亡配體1（programmed death ligand 1， PD-L1）表達的影響及其潛在分子機制。分別選用濃度梯度為1～1 000 nmol/L的E2和濃度梯度為0.008～5 μmol/L的BaP處理A549細胞，篩選出最適濃度；實驗分為對照組、E2組、BaP和E2+BaP組，每組實驗重復3次。RT-qPCR檢測PD-L1的mRNA水平；Western blot檢測PD-L1、芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor， AHR）和缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α）表達水平，以及蛋白激酶B（protein kinase B， PKB/AKT）和細胞外信號調節激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2， ERK1/2）的磷酸化水平。分別加入AKT特異性抑制劑LY294002和ERK1/2特異性抑制劑PD98059進行反向驗證，觀察PD-L1表達的變化。與E2組和BaP組相比，E2+BaP組A549細胞中PD-L1的mRNA和蛋白表達水平均顯著上調（<0.05）；AHR、HIF-1α、p-AKT和p-ERK1/2蛋白水平均顯著高于其他各組（<0.05）；LY294002和PD98059能夠逆轉E2+BaP對A549細胞PD-L1表達的上調作用（<0.05）。E2聯合BaP可能通過異常激活AHR-AKT-ERK1/2信號通路誘導人肺腺癌A549細胞PD-L1表達升高。

雌二醇；苯并芘；程序性死亡配體1；非小細胞肺癌；AHR-AKT-ERK1/2信號通路

肺癌是常見的惡性腫瘤疾病，發病率在全球范圍內持續上升，非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer， NSCLC）約占肺癌的85%［1］。吸煙是促進NSCLC的獨立危險因素，大量研究充分證明煙草煙霧會促進NSCLC的發展［2-4］。早期研究顯示男性吸煙者罹患肺癌的風險顯著高于女性吸煙者，然而隨著研究不斷深入，逐漸觀察到在全世界范圍內男性NSCLC的發病率和死亡率開始有所下降，而女性的發病率和死亡率卻逐年上升［5-6］；更進一步的研究指出，診斷為NSCLC的女性平均吸煙量要比男性低20%～25%［7-8］；同時幾項大型病例對照研究也表明，在同等吸煙水平下，女性患NSCLC的風險幾乎是男性的3倍［5-6， 9］。雖然暴露于煙霧的女性NSCLC的發病率顯著增加已經開始受到廣泛關注，但我們對其發病機制卻仍知之甚少。

雌激素是類固醇激素，在體內主要以17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）的生物活性形式存在。越來越多的研究顯示雌激素可以促進乳腺癌［10］、子宮內膜癌［11］、肺癌［12］等多種腫瘤的發生發展；不僅如此，還有研究指出，雌激素可以通過調控免疫檢查點促進腫瘤免疫逃逸［13］。免疫檢查點是指在免疫細胞上表達并且能調節免疫激活程度的一系列分子，可防止免疫系統過度活化。免疫檢查點的表達或功能失常是許多疾病發生的重要原因之一。腫瘤細胞免疫檢查點通常處于激活狀態，通過抑制T淋巴細胞的活化，誘導腫瘤細胞免疫耐受，從而促進腫瘤免疫逃逸。目前已經證實細胞程序性死亡受體1（programmed death-1， PD-1）/程序性死亡配體1（programmed death ligand 1， PD-L1）信號通路是多種惡性腫瘤疾病的有效治療靶點［14-15］。PD-1/PD-L1阻斷治療可以在一定程度上延長患者的生存率［16-18］。盡管雌激素對多種腫瘤細胞PD-1/PD-L1均有調節作用，例如目前有研究指出雌激素可以顯著上調雌激素受體（estrogen receptor， ER）陽性的子宮內膜癌細胞和乳腺癌細胞PD-L1蛋白表達［15］，但是雌激素對肺癌細胞PD-L1影響的研究卻鮮有報道。因此雌激素是否可以促使肺癌腫瘤細胞逃脫免疫監測進而促進NSCLC的發生發展仍有待進一步研究。

因此我們推測雌激素可能誘導了一種肺癌細胞免疫逃逸的反應機制，由此我們假設雌激素可以調節肺癌細胞免疫檢查點，并且在煙霧的刺激下對肺癌細胞免疫檢查點的調節可能具有協同作用，從而進一步促進腫瘤細胞免疫逃逸。為了驗證上述假設，我們在體外實驗中評估了煙草煙霧的主要成分苯并芘（benzopyrene， BaP）和E2單獨及聯合作用對人肺腺癌A549細胞PD-L1表達的影響及其分子機制，以期為肺癌免疫治療提供參考依據。

材料和方法

1　細胞

人肺腺癌細胞株A549來源于中國科學院（上海）細胞庫。

2　主要試劑

E2、BaP、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）、含EDTA的胰蛋白酶和1×磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline， PBS）均為Sigma產品；DMEM培養液為HyClone產品；澳洲優級胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）購自CellMax；PD-L1、芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor， AHR）和缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α）兔抗多克隆抗體購自Santa Cruz；蛋白激酶B（protein kinase B， PKB/AKT）、磷酸化AKT（phosphorylated AKT， p-AKT）、細胞外信號調節激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2， ERK1/2）和磷酸化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2， p-ERK1/2）兔抗多克隆抗體均購自Cell Signaling Technology；GAPDH鼠抗多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠/兔IgG試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride， PVDF）膜和化學發光試劑盒均購自Millipore；Trizol試劑和PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉錄試劑盒均購自TaKaRa；RT-qPCR引物由深圳華大基因公司合成。其他試劑均為進口分裝或國產分析純。

3　主要方法

3.1細胞培養和傳代用含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養液培養A549細胞，細胞培養箱的條件是37 ℃、5% CO2，隔日更換培養液；細胞密度達70%～80%融合進行細胞傳代。每天觀察和記錄細胞的生長狀態。

3.2BaP和E2處理A549細胞及實驗分組取對數生長期的A549細胞置于培養液中，待細胞密度至30%～50%時，分別選用濃度梯度為1～1 000 nmol/L的E2和濃度梯度為0.008～5 μmol/L的BaP處理A549細胞，篩選出最適濃度。實驗分為對照（control， Ctrl）組、E2組（最適濃度為100 nmol/L）、BaP組（最適濃度為0.2 μmol/L）和E2+BaP組。每組實驗重復3次。處理12～24 h后提取細胞總RNA，用于后續RT-qPCR檢測；處理48～72 h后提取細胞總蛋白，用于后續Western blot檢測。

3.3RT-qPCR法檢測PD-L1 mRNA采用Trizol法分離純化各組細胞的總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。使用PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。總反應體積20.0 μL，其中包括5× RT-PCR buffer 5.0 μL、dNTP Mix 1.0 μL、RT-PCR Enzyme Mix 2.0 μL、RNA 2.0 μg和引物0.6 μmol/L。逆轉錄條件如下： 37 ℃ 15 min； 85 ℃ 5 s。RT-qPCR在CFX Connect Real-Time PCR Detection System （Bio-Rad）中進行。樣品混合物由5 μL SYBR、0.8 μL引物、1 μL cDNA和3.2 μL ddH2O組成。熱循環條件如下： 95 ℃ 10 min； 95 ℃ 20 s， 56 ℃ 10 s，將溫度降低3 ℃/循環，共35個循環； 95 ℃ 20 s； 55 ℃ 20 s。引物序列見表1。以GAPDH為內參照，檢測各組細胞PD-L1的表達水平，采用2-ΔΔCt法統計分析相對表達量。實驗重復3次。

表1　引物序列

3.4Western blot法檢測PD-L1、AHR、HIF-1α、AKT、p-AKT、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白水平首先使用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液來制備細胞裂解液，PBS清洗各組細胞，細胞刮刷收集后加入RIPA裂解液，BCA法測定蛋白濃度。250 μg為標準計算蛋白上樣體積，10% SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，首先是在濃縮膠中90 V恒壓濃縮30 min，然后在分離膠中120 V恒壓分離90 min，電泳完成后，進行轉膜，轉膜條件為210 mA恒流，轉膜時間根據蛋白分子量大小調整，轉膜完成后將轉含有蛋白質的PVDF膜放于在5%牛血清白蛋白中37 ℃封閉2 h，封閉結束后，加入Ⅰ抗（PD-L1抗體，1∶500； AHR抗體，1∶500； HIF-1α抗體，1∶500； p-AKT抗體，1∶1 000； AKT抗體，1∶1 000； p-ERK1/2抗體，1∶1 000； ERK1/2抗體，1∶1 000； GAPDH抗體，1∶1 000），4 ℃孵育過夜，14 h后將膜取出，用1× TBST洗滌3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記的小鼠/兔IgG（1∶3 000） Ⅱ抗并在37 ℃孵育1 h，1× TBST洗滌3次后通過化學發光法顯影。ImageJ軟件計算各電泳條帶的灰度值，以GAPDH為內參照，相比較后計算各組蛋白的表達水平。實驗重復3次。

4　統計學處理

采用SPSS 27.0和GraphPad Prism 9軟件對實驗數據進行統計分析。所有實驗數據用均數±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，各組之間差異的兩兩比較用LSD-檢驗。以<0.05為差異有統計學意義。

結果

1　BaP對A549細胞PD-L1表達的影響

不同濃度的BaP誘導A549細胞3 d，Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，0.008～1 μmol/L BaP均可以誘導免疫檢查點蛋白PD-L1表達升高（<0.05或<0.01），當BaP濃度為0.2 μmol/L時，PD-L1表達升高最為顯著（<0.01），見圖1。

Figure 1.　Effect of benzopyrene （BaP） on PD-L1 expression in A549 cells was detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs Ctrl group.

2　E2對A549細胞PD-L1表達的影響

不同濃度的E2誘導A549細胞3 d，Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，10～1 000 nmol/L E2均可誘導免疫檢測點蛋白PD-L1表達升高（<0.05或<0.01），當E2濃度為100 nmol/L時，PD-L1表達升高最為顯著（<0.01），見圖2。

Figure 2.　Effect of 17β-estradiol （E2） on PD-L1 expression in A549 cells was detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs Ctrl group.

3　E2聯合BaP對A549細胞PD-L1表達的影響

根據分組采用不同條件誘導A549細胞3 d，Western blot檢測結果顯示，在A549細胞中，與單獨使用E2（濃度為100 nmol/L）組和單獨使用BaP（濃度為0.2 μmol/L）組相比，E2+BaP組PD-L1蛋白表達水平顯著升高（<0.05），見圖3A。根據分組采用不同條件誘導A549細胞1 d，RT-qPCR結果顯示，與單獨使用E2（濃度為100 nmol/L）組和單獨使用BaP（濃度為0.2 μmol/L）組相比，E2+BaP組PD-L1的mRNA表達水平顯著升高（<0.05），見圖3B。

Figure 3.　Effects of 17β-estradiol （E2） combined with benzopyrene （BaP） on PD-L1 protein （A） and mRNA （B） expression in A549 cells were detected by Western blot and RT-qPCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs Ctrl group； #P<0.05 vs E2+BaP group.

4　E2聯合BaP對AHR-AKT-ERK1/2信號通路的影響

根據分組采用不同條件誘導A549細胞3 d，Western blot檢測AHR和HIF-1α的蛋白表達水平，結果顯示，E2+BaP組蛋白表達水平顯著高于E2和BaP組（<0.05）；根據分組采用不同條件誘導A549細胞8 h，Western blot檢測p-AKT和p-ERK1/2蛋白水平，結果顯示，E2+BaP組AKT和ERK1/2的磷酸化水平均顯著升高（<0.05）；而細胞總AKT和ERK1/2表達量各組之間沒有顯著差異，見圖4A。加入AKT信號通路抑制劑LY294002（10 mmol/L）和ERK1/2信號通路抑制劑PD98059（10 mmol/L），Western blot結果顯示，與E2+BaP組相比，E2+BaP+LY294002組PD-L1蛋白表達水平顯著降低（<0.05）；同樣，與E2+BaP組相比，E2+BaP+PD98059組PD-L1蛋白表達水平亦顯著降低（<0.05），見圖4B。

Figure 4.　The role of AHR-AKT-ERK1/2 signaling pathway in A549 cells treated with 17β-estradiol （E2）+benzopyrene （BaP）. A： the protein levels of AHR， HIF-1α， p-AKT and p-ERK1/2 in A549 cells were detected by Western blot； B： PD-L1 protein levels were analyzed by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs Ctrl group； #P<0.05 vs E2+BaP group.

討論

吸煙女性的NSCLC發病率正逐年增加［19］，然而在煙霧的暴露下，雌激素可能誘導腫瘤細胞免疫逃逸的反應機制仍需要詳細闡明。我們的數據表明E2可以增強A549細胞AHR/PD-L1的表達，并且我們的結果顯示在BaP與E2協同作用下，A549細胞AHR/PD-L1的表達水平有更為顯著的升高。這些檢測結果為雌激素促進腫瘤細胞免疫逃逸提供了新的證據。

吸煙是促進NSCLC發生發展的獨立危險因素，煙霧中誘發肺癌的致癌物至少有50種，BaP是常見的導致肺癌的有害成分［20-21］，既往大量研究證明，BaP可以促進腫瘤細胞增殖、轉移以及抑制其凋亡［2-3］。Wang等［22］在研究中指出，BaP可以通過上調免疫檢查點PD-1/PD-L1促使NSCLC細胞發生免疫逃避，并且可以促進小鼠肺腺癌細胞的增殖。我們的結果顯示0.2 μmol/L BaP可以顯著上調PD-L1的蛋白水平，這一結果與先前的研究結果相一致［2-3，22］，提示BaP可以促進A549細胞PD-L1的表達升高。

既往研究表明內環境中炎癥因子、外泌體、微小RNA等均可以調節細胞免疫檢查點，從而介導腫瘤細胞發生免疫逃逸［23-25］。目前越來越多的證據指出雌激素同樣可能對促進腫瘤細胞免疫逃逸起著重要作用。Yang等［15］在研究中指出，E2通過調控AKT信號通路促進ER表達陽性的子宮內膜癌細胞和乳腺癌細胞的PD-L1的升高，Williams等［26］也觀察到E2在突變型乳腺癌中可能通過激活ER和干擾素刺激基因上調腫瘤細胞及巨噬細胞PD-L1的表達水平。不僅在腫瘤領域，E2在抗磷脂綜合征等自身免疫性疾病、子宮內膜異位等疾病中可以通上調CD4+、CD8+T細胞以及腫瘤壞死因子α、白細胞介素6從而促進PD-L1的表達［27-28］。然而E2對NSCLC細胞的免疫檢查點的調節機制卻仍有待進一步闡明。我們的研究結果顯示E2以劑量依賴的形式上調PD-L1，進一步研究顯示，BaP與E2對于A549細胞PD-L1的表達上調具有協同作用，提示BaP與E2可能對誘導NSCLC細胞的免疫逃逸具有協同作用。

AHR在腫瘤的免疫逃逸中扮演了重要角色［22］。AHR是一種最早被檢測的環境污染物多環芳香烴類（polycyclic aromatic hydrocarbons， PAHs）的受體［29］。這種受體在人胎盤、肺、胸腺、腎臟、肝臟等幾乎所有組織中均有表達［30-31］，與其配體結合并易位至細胞核后，通過調控HIF-1α核蛋白，不僅能調節下游涉及MAPK/PI3K/AKT、ERK1/2、NF-κB［22， 32］等多種配體特異性靶基因的表達，甚至在調節免疫應答［31］中也起重要作用。Wang等［22］的研究也指出，在NSCLC中AHR介導了BaP對肺癌細胞的促進作用，并且通過阻斷PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制BaP誘導的肺癌發展，說明PD-L1與AHR之間可能存在一定聯系。我們的結果顯示BaP聯合E2可以顯著提高A549細胞AHR/HIF-1α的表達水平。通過進一步研究，我們的結果還顯示在BaP和E2聯合作用下p-AKT和p-ERK1/2蛋白水平均顯著提高，并且在加入ATK信號通路抑制劑LY294002和ERK1/2信號通路抑制劑PD98059后，PD-L1的表達水平顯著降低，這些結果提示BaP和E2聯合作用可能通過激活AKT和ERK1/2信號通路從而促進PD-L1的表達。

綜上所述，E2聯合BaP共同作用A549細胞，通過上調AHR/HIF-1α水平，激活AKT和ERK1/2信號通路，從而顯著增強PD-L1表達。由此推測，在煙霧的刺激下，E2可能是增強NSCLC細胞免疫逃逸的重要調節因子。因此E2-AHR-AKT-ERK1/2-PD-L1軸可能成為NSCLC的潛在治療靶點，我們在后續體內、體外實驗中會進一步探究E2調節的AHR-AKT-ERK1/2信號通路上下游分子機制。盡管具有一定局限性，但本研究顯示E2聯合BaP能促進A549細胞中PD-L1的表達，此機制可能參與了NSCLC細胞的免疫逃逸過程。

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17β-Estradiol combined with benzopyrene abnormally activates AHR/PD-L1 axis in human lung adenocarcinoma A549 cells

FENG Hao1， CAO Boxiong1， ZAN Ziliang1， HE Zemin1， HUANG Hao1， HUANG Gaigai2， WEI Qiang1△

（1，，610000，；2，，610000，）

To investigate the effects of 17β-estradiol （E2） and benzopyrene （BaP） on programmed death ligand 1 （PD-L1） expression in human lung adenocarcinoma A549 cells and their potential molecular mechanisms.The A549 cells were treated with 1～1 000 nmol/L E2and 0.008～5 μmol/L BaP， and the optimal concentrations were identified. The cells were divided into control group， E2group， BaP group， and E2+BaP group. Each set of experiments was repeated 3 times. RT-qPCR was used to determine the mRNA level of PD-L1. Western blot was used to detect the expression levels of PD-L1， aryl hydrocarbon receptor （AHR） and hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α）， as well as the phosphorylation levels of protein kinase B （PKB/AKT） and extracellular signal-regulated kinase 1/2 （ERK1/2）. The AKT-specific inhibitor LY294002 and ERK1/2-specific inhibitor PD98059 were used for reverse verification， and the changes in PD-L1 expression were observed.Compared with E2group and BaP group， the mRNA and protein levels of PD-L1 in the A549 cells of E2+BaP group were significantly up-regulated （<0.05）. The protein levels of AHR， HIF-1α， p-AKT and p-ERK1/2 in E2+BaP group were significantly higher than those in other groups （<0.05）. LY294002 and PD98059 reversed the up-regulation of PD-L1 induced by E2+BaP （<0.05）.E2combined with BaP up-regulates PD-L1 expression in human lung adenocarcinoma A549 cells through abnormal activation of the AHR-AKT-ERK1/2 signaling pathway.

estradiol； benzopyrene； programmed death ligand-1； non-small-cell lung cancer； AHR-AKT-ERK1/2 signaling pathway

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.07.003

［基金項目］成都市衛生健康委員會醫學科研基金資助項目（No. 2021104）

R363.2； R734.2

A

1000-4718（2023）07-1174-07

2023-04-12

2023-06-16

18180692239； E-mail： weiqiang011732@126.com

（責任編輯：余小慧，李淑媛）