基于腦小血管病臨床腦血流特點構建并評估不完全性全腦缺血再灌注大鼠模型*

王珊珊， 徐昊， 侯培媚， 李澤康， 周麗娟， 葛金文△

· 實驗技術 ·

基于腦小血管病臨床腦血流特點構建并評估不完全性全腦缺血再灌注大鼠模型*

王珊珊1，2， 徐昊1，2， 侯培媚2，3， 李澤康2，4， 周麗娟1，2， 葛金文1，2△

（1湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙 410208；2湖南中醫藥大學中西醫結合防治心腦血管疾病湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；3湖南中醫藥大學針灸推拿與康復學院，湖南 長沙 410208；4湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208）

基于腦小血管病（CSVD）的腦血流特點構建和評估不完全性全腦缺血再灌注大鼠模型，以期為CSVD等缺血性腦血管疾病的基礎研究提供理想的大鼠實驗模型。將126只雄性SD大鼠隨機分為假手術（sham）組、輕損傷模型組（minor組）和重損傷模型組（serious組），每組42只。采用雙側頸總動脈夾閉-開放循環操作的方法，構建大鼠不完全性全腦缺血再灌注模型，激光散斑血流成像系統評估腦血流實時變化；于造模后2、24和72 h，評估造模動物存活率和動物行為學（平衡木實驗，BBT）評分；于造模2、24和72 h取材，采用HE染色觀察大鼠不同腦區組織病理形態改變；并運用非靶向代謝組學分析模型大鼠血漿和腦皮質區差異代謝物，評估模型損傷程度。（1）與sham組比較，minor組和serious組大鼠總存活率平均值分別為83.2%和73.7%（<0.05）；（2）殘存腦血流量平均值分別為56.3%和40.9%；（3）神經功能檢查顯示，與sham組比較，minor組和serious組造模后2、24和72 h的BBT評分均顯著升高（<0.05）；（4）HE染色鏡下可見廣泛腦皮質（M1區和RSA區最為明顯）、腹內測下丘腦腹外側部（VMHvl）和海馬C2區神經細胞形態發生不同程度改變。（5）非靶向代謝組學結果顯示，sham組和serious組大鼠血漿差異性代謝物總數45個，上調代謝物總數33個，下調代謝物總數12個；腦皮質RSA區差異性代謝物總數19個，上調代謝物總數6個，下調代謝物總數13個，提示造模導致了大鼠神經-內分泌功能的紊亂。雙側頸總動脈夾閉-開放循環造模方法可導致大鼠腦皮質、VMHvl和海馬C2區散在性廣泛損傷，其損傷機制可能與代謝紊亂、氧化應激損傷等有關。該模型為研究CSVD反復缺血再灌注損傷提供了新的大鼠實驗模型。

腦小血管病；缺血性腦卒中；缺血再灌注損傷；動物模型

腦小血管病（cerebral small vessel disease， CSVD）是由各致病因素導致腦內微循環發生病理改變的一種臨床綜合征，可進展為缺血性腦卒中（ischemic stroke， IS）［1］。其發病隱匿，臨床診斷主要依靠影像學檢查，無特異性藥物，病人往往進展至IS才進行溶栓或抗凝干預，但其伴發的嚴重并發癥使臨床獲益受限，因此，提前防治CSVD，延緩病程發展意義重大。大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion， MCAO）模型是研究IS等缺血性腦血管疾病的經典動物模型，是通過從頸內靜脈插入線栓至大腦基底動脈環實現阻斷血流供應的目的（數小時后拔出栓線模擬缺血再灌注損傷），該方式造模后TTC染色可見腦缺血灶，可還原病人IS發生后腦組織的病理損傷，對IS的防治研究具有重要意義。然而，IS的發病是復雜的病理生理學過程，CSVD由于內皮損傷和微血栓形成使得病人多經過漫長而反復的短暫腦缺血過程［2］，這種全腦反復缺血再灌注損傷是MCAO模型不能模擬的。

CSVD目前有4種主流的動物模型：低灌注損傷模型、高血壓相關性模型、基因修飾相關模型和微小栓子栓塞模型［3］。雖然造模后動物可出現神經行為學改變和學習記憶力受損，腦組織形態損傷集中于大腦皮質及海馬區［4］，但這些造模方式主要模擬的是實驗動物腦組織血流持續性灌注不足，未考慮再灌注引起的二次損傷，因此更適用于研究低灌注引起的血管性癡呆。加之，大多數造模方式損傷程度不一，對操作者手術技能要求高，動物死亡率較高，不利于中醫藥防治研究，且與CSVD一過性血流中斷后再灌注不完全相符。本項目在傳統的雙側頸動脈結扎（bilateral carotid artery ligation， BCAL）模型的實驗基礎上設計了一種不完全性全腦缺血再灌注模型，旨在模擬CSVD發病前的反復一過性缺血再灌注損傷，試圖闡明該模型下大鼠腦組織形態學和代謝組學變化，為CSVD基礎研究提供大鼠實驗模型。

材料和方法

1　動物

4～6周齡SPF級雄性SD大鼠，體重（220±20） g，購自湖南斯萊克景達有限公司，合格證號：SCXK（湘）2019-0004。本實驗獲湖南中醫藥大學實驗動物中心倫理委員會批準，倫理審批號為：LL2019092009。

2　主要試劑

4%多聚甲醛（貨號：G1101-500ML）和HE染色試劑盒（貨號：GP1031）購自Servicebio；TissueFAXS PLUS型全景組織掃描成像系統（TissueGnostics GmbH）；多普勒激光散斑血流儀（Moor FLPI-2）。

3　主要方法

3.1動物實驗分組126只SPF級SD大鼠，隨機分為3組：假手術（sham）組、輕損傷模型（minor）組和重損傷模型（serious）組，每組42只。

3.2動物模型制備4周齡雄性SD大鼠于（26±2） ℃適應性喂養12 h，使用25%烏拉坦和10%水合氯醛1∶1復配，腹腔注射麻醉，劑量為4.5 mL/kg。在低灌注損傷模型的基礎上建立不完全性全腦缺血再灌注模型［4-5］。sham組：分離雙側頸總動脈后縫合傷口；minor組：分離雙側頸總動脈，在激光散斑血流成像系統下，連續操作5次動脈夾夾閉1 min后放開1 min，縫合皮膚；serious組：分離雙側頸總動脈，在激光散斑血流成像系統下，連續操作10次動脈夾夾閉1.5 min后放開1 min，縫合皮膚。各組分別于造模后2、24和72 h處死取材。激光散斑血流成像系統記錄實時血流量，殘存腦血流量（%）=造模后腦血量/初始腦血量×100%。

3.3存活率計算存活率（%）=對應時點剩余動物數/（組內動物總數-上一時點死亡動物數）×100%。

3.4平衡木實驗（beam balance test， BBT）評分測試時，將大鼠放于寬1.5 cm木條上，一端懸空，一端固定于40×40 cm平板中心，記錄大鼠2 min測試時間內平衡能力。評分標準：在木條上站穩，無搖晃，持續2 min記1分；在木條上站穩，左右搖晃，未滑下，持續2 min記2分；在木條上站立，下滑至一側，未掉下，持續2 min記3分；在木條上站立不到2 min即從木條上掉下記4分；試圖在木條上站穩、但在數秒鐘即掉下記5分；無任何站立能力記6分。

3.5腦組織病理學觀察2、24和72 h進行BBT評分后，采用相同方法麻醉，仰臥位固定，沿腹正中切口暴露腹主動脈，采血收集入肝素管直至大鼠死亡；剪開下腔靜脈，沿心臟左心室進針，4%多聚甲醛灌注直至肝臟呈粉紅色，斷頸，冰上取全腦，入4%多聚甲醛固定，行石蠟包埋、切片、脫蠟后HE染色。

3.6血漿和腦皮質非靶向代謝組學檢測sham組和serious組于術后72 h采用相同方法麻醉、取血后，剪開下腔靜脈，沿心臟左心室進針，預冷生理鹽水灌注直至肝臟呈粉紅色，斷頸，冰上取全腦，分離額、顳葉部腦皮質入液氮急凍后-80 ℃保存。代謝組學檢測上機前，取sham組和serious組存于液氮中、經研磨后的腦皮質組織樣品各100 mg（或取血漿樣品各100 μL），置于EP管中，加入500 μL的80%甲醇水溶液；渦旋震蕩，冰浴靜置5 min，15 000×、4 ℃離心20 min；取一定量的上清液，加質譜級水稀釋至甲醇含量為53%；15 000×、4 ℃離心20 min，收集上清液，進樣LC-MS分析。上機條件如下：Hyperil Gold C18色譜柱，正離子模式下，流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）；負離子模式下，流動相為pH 9的5 mmol/L醋酸銨（A）-甲醇（B）；梯度洗脫：0～1.5 min，98% A；1.5～3 min，98%～0 A；3～10 min，0 A；10～10.1 min，0～98% A；1.01～12 min，98% A；柱溫40 ℃；體積流量0.2 mL/min。

4　統計學處理

4.1常規實驗數據分析使用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析。結果以均數±標準差（mean±SD）表示。數據兩組間比較，滿足正態性者采用檢驗；多組間比較，滿足正態性和方差齊性者采用單因素方差分析，方差不齊者采用秩和檢驗。以<0.05為差異有統計學意義。

4.2非靶向代謝組學分析上機數據導出為raw格式，使用諾禾致源Novomagic云平臺進行數據分析。使用KEGG數據庫（https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）、HMDB數據庫（https：//hmdb.ca/metabolites）和LIPIDMaps數據庫（http：//www.lipidmaps.org/）對鑒定到的代謝物進行注釋。

結果

1　各組大鼠的存活率

sham組大鼠術后2、24和72 h的存活率平均值分別為96.3%、100%和100%，總存活率平均為97.2%；minor組大鼠造模后2、24和72 h的存活率平均值分別為89.1%、96.7%和96.7%，總存活率平均為83.2%；serious組大鼠造模后2、24和72 h的存活率平均值分別為86.3%、94.2%和90.6%，總存活率平均為73.7%。與sham組比較，minor組和serious組2 h和總死亡率顯著增升高（<0.05）。見表1。

表1　不同時點各組大鼠存活率的變化

*<0.05sham group.

2　各組大鼠行為學變化

術中大鼠可見呼吸加深加快；術后24 h即可見大鼠左右眼大小改變，左右肢肌張力減退，部分重損傷動物可見走路不穩，身體傾斜，轉圈，見圖1。

Figure 1.　Typical muscle （orbicularis oculi） weakness changes of the rats in each group 72 h after surgery （n=42）.

sham組大鼠操作后2、24和72 h的BBT評分平均值分別為1.67、1.25和1.33；minor組大鼠造模后2、24和72 h的BBT評分平均值分別為3.63、2.80和2.63；serious組大鼠造模后2、24和72 h的BBT評分平均值分別為3.67、2.83和2.70。與sham組比較，minor組和serious組2、24和72 h的BBT得分均顯著升高（<0.05）。見表2。

表2　不同時點各組大鼠BBT評分

*<0.05sham group.

3　各組大鼠腦血流量變化

minor組造模后腦實時血流平均降低至基線的（56.3±4.5）%，serious組造模后腦實時血流平均降低至基線的（40.9±9.2）%，見圖2。

Figure 2.　Cerebral blood flow monitoring in the rats of each group before and after modeling using a laser speckle blood flow imaging system （n=15）.

4　各組大鼠腦組織HE染色

HE染色結果顯示，sham組大鼠腦組織結構正常，未見病理改變；minor組和serious組大鼠初級運動皮質（primary motor cortex， M1）、壓后無顆粒皮質（retrosplenial agranular cortex， RSA）和腹內側下丘腦腹外側部（ventrolateral part of ventromedial hypothalamus， VMHvl）均可見不同程度的細胞深染和胞質融合，細胞核消失，部分細胞核固縮，胞質成空泡狀，細胞形態改變，邊界不清，紋理紊亂，相同腦區細胞密度改變，但不同腦區的損傷程度和進程不統一；serious組在海馬C2區也可見細胞深染、胞質融合和紋理紊亂，提示腦組織病理改變，見圖3。

Figure 3.　Pathological changes in different encephalic regions of the rats in each group at each time point （HE staining， scale bar=20 μm）. M1： primary motor cortex； RSA： retrosplenial agranular cortex； VMHvl： ventrolateral part of ventromedial hypothalamus； C2： hippocampal C2 region.

5　各組大鼠血漿和腦皮質代謝物變化

sham組和serious組大鼠血漿共鑒定692個共有代謝物，其中差異性代謝物總數45個，上調代謝物總數33個，下調代謝物總數12個，見圖4及表3、4。

Figure 4.　Volcanic map of plasma differential metabolites in the rats of each group. Red： up-regulated metabolites in serious group vs sham group； green： down-regulated metabolites in serious group vs sham group； grey： no difference （ND）. n=3. Variable importance in projection （VIP）>1.0， fold change （FC）>1.2 or FC<0.833， and P<0.05.

Figure 5.　Volcanic map of cerebral cortex differential metabolites in the rats of each group. Red： up-regulated metabolites in serious group vs sham group； green： down-regulated metabolites in serious group vs sham group； grey： no difference （ND）. n=3. Variable importance in projection （VIP）>1.0， fold change （FC）>1.2 or FC<0.833， and P<0.05.

表3　各組大鼠血漿差異代謝物（第1～29號）

表4　各組大鼠血漿差異代謝物（第30～45號）

sham組和serious組大鼠腦皮質共鑒定440個共有代謝物，其中差異性代謝物總數19個，上調代謝物總數6個，下調代謝物總數13個，見圖5及表5。

表5　各組大鼠腦皮質差異代謝物

討論

IS嚴重影響人類健康，預防的現實意義遠大于治療。近年來針對IS的發病機制研究逐年顯著增加，其中動脈粥樣硬化導致的CSVD是一種主要的IS發病前狀態。由于臨床起病隱匿，患者無或僅有輕微臨床表現，導致其診斷和防治受限，而無代表性的動物模型又使得其臨床前基礎研究受限。CSVD關鍵病因是動脈粥樣硬化，動脈粥樣硬化可導致血管內皮損傷增生狹窄，微血管自身調節減弱，各種致病因素引起血管短暫收縮或痙攣使腦微循環血流供應不足可頻繁發生一過性腦缺血，而隨著致病因素的解除或減弱，微循環又可恢復血流供應而出現再灌注損傷。而且患者顱腦CT未見明顯梗死灶，常出現一過性頭暈、疲乏等癥狀。本項目組構建和評估了這種不完全性全腦缺血再灌注模型，擬為CSVD等缺血性腦血管疾病防治提供基礎研究大鼠模型。

目前CSVD基礎實驗常用的MCAO和BCAL模型僅反映了缺血環節損傷，不能體現再灌注二次損傷，又受創傷性大、死亡率較高、術后恢復較差的影響［5］，提高了對實驗者操作手法要求和研究成本。本實驗設計的大鼠模型死亡多發生在2 h內（含sham），除造模損傷外還考慮麻藥不耐受或聯合作用引起，但整體死亡率不超過27%，顯著優于MCAO和BCAL模型。腦血流量、動物行為學和組織病理形態是腦損傷動物模型評價的重要指標。多普勒激光散斑結果顯示，造模后大鼠即時腦血流量顯著降低，提示模型成功。造模后動物出現乏力、進食量減少、步態不穩、部分大鼠出現肌無力（主要表現為眼輪匝肌和下肢屈肌肌群）。BBT結果顯示，造模后2、24和72 h，minor組和serious組評分較sham組均顯著升高，但2 h sham組評分也高于其24 h和72 h，考慮2 h這一時點麻藥的持續性效果可能影響了神經功能評估。而24和72 h的結果顯示，隨著恢復期時間延長，神經功能評分逐漸降低，提示該模型損傷程度較輕，對行為學改變有一定自愈性，適用于短期或預防性用藥的藥效學評估。有研究顯示，雙側頸總動脈結扎主要引起大鼠額葉皮質和海馬區局部血流明顯下降，隨著缺血時間延長，神經元出現水腫、凝固性壞死和微空泡形成［6］。本研究的HE染色結果顯示，造模后可見廣泛腦神經元損傷，受損的腦區涉及到自主運動、嗅覺感知、空間記憶、學習社交、短期記憶等，可能與大鼠表現單側眼瞼下垂、肌張力降低、食欲減退有關。腦皮質區損傷程度上與造模次數無關，但與造模時間相關。損傷最明顯的是腦皮質M1和RSA，造模24 h即可見細胞水腫、排列紊亂，72 h則見大量神經元核固縮、軸突消失、小膠質細胞增生和微空泡形成，提示在無干預情況下神經元損傷不可逆。而VHMvl和海馬C2區損傷程度與造模次數密切相關，其病理改變僅在serious組造模24 h后可見細胞間隙增寬、神經元丟失、核固縮等。以上結果提示不同造模方式引起的腦損傷區略為不同，而在無干預條件下，受損神經元72 h內不可恢復。

代謝組學可反映已發生的病理損傷情況，本實驗對serious組和sham組血漿和RSA腦區的代謝組學進行了分析，結果提示該模型可導致腦內神經細胞能量代謝障礙、氧化應激損傷、興奮性毒性及血小板功能障礙等。其中，檸檬酸和異檸檬酸含量增加提示三羧酸循環、二醛酸和二羧酸代謝異常，能量供應和線粒體功能障礙；還原性谷胱甘肽通過谷胱甘肽過氧化物酶催化過氧化氫和脂質過氧化物的還原并形成氧化型谷胱甘肽以防御氧化應激［7］，其降低提示細胞對抗氧化應激損傷能力減弱；5-磷酸吡哆按減少提示維生素B6代謝障礙，抑制能量物質的生物合成代謝；前列腺素E1降低，前列腺素F2α升高，提示內皮功能障礙，微循環血管舒縮不良；苯基丙酮酸增加，苯丙氨酸減少提示丙氨酸羥化酶缺乏，多巴生成障礙。RSA腦區代謝組學結果整體。

進一步鑒定分析血漿代謝物差異，結果顯示，與sham組比較，serious組血漿中有33個代謝物上調，12個代謝物下調。其模型動物代謝異常與CSVD、IS患者或tMCAO模型動物代謝紊亂相似［8-11］。其中，α-酮戊二酸、檸檬酸、蘋果酸和異檸檬酸升高提示腦內能量代謝障礙導致了代謝物在血液中進一步堆積，氫醌增加提示氧化應激損傷；花生四烯酸是一種ω-6多不飽和脂肪酸，與膜蛋白相互維持細胞膜的流動性，通過環氧合酶途徑可介導下游底物前列腺素增加，其消耗、腦內前列腺素E1降低和前列腺素F2α升高均提示腦微循環內皮細胞受損，促凝和炎性物質增加。血漿代謝組學結果提示造模導致的腦損傷已影響到全身能量供應、氨基酸代謝、氧化應激和磷脂代謝等功能；盡管血漿中有部分代謝物對細胞自我修復有益（富馬酸和硫辛酸），提示模型動物在造模后可能有一系列調節機制以代償缺血缺氧及再灌注所引起的細胞損傷，但代謝物間功效抵消和代謝物自身堆積可能只會引起更進一步的細胞受損［12］。

綜上所述，這種通過反復夾閉-開放頸總動脈造模的不完全性全腦缺血再灌注模型主要模擬CSVD反復缺血再灌注的腦血流特點，不同造模次數對腦區損傷的程度和時程不一，可根據研究腦區的不同設置造模條件。本研究為CSVD防治的基礎研究提供了大鼠實驗模型。

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Construction and evaluation of an incomplete global cerebral ischemia-reperfusion rat model based on hemodynamic characteristics of cerebral small vessel disease

WANG Shanshan1，2， XU Hao1，2， HOU Peimei2，3， LI Zekang2，4， ZHOU Lijuan1，2， GE Jinwen1，2△

（1，，410208，；2，，410208，；3，，，410208，；4，，410208，）

To construct and evaluate an incomplete global cerebral ischemia-reperfusion rat model based on the hemodynamic characteristics of cerebral small vessel disease （CSVD）， so as to provide an ideal rat model for investigating ischemic cerebrovascular diseases such as CSVD.A total of 126 male SD rats were divided into sham， minor， and serious groups （=42）. The bilateral common carotid artery clamp-open circulation operation was used to construct the incomplete global cerebral ischemia-reperfusion rat model， and real-time changes of cerebral hemodynamics were assessed by a laser speckle blood flow imaging system. At 2， 24 and 72 h after the model was constructed， the survival rate and animal behavior （beam balance test， BBT） score were evaluated， and the materials of the model animals were taken. HE staining was used to observe the histopathological changes in different brain regions of the rats， and non-targeted metabonomics was utilized to analyze the different metabolites in the rat plasma and cerebral cortex， thus evaluating the damage degree.The average survival rates of rats in minor and serious groups were 83.2% and 73.7% （<0.05）， and the mean residual cerebral blood flow rates were 56.3% and 40.9%， respectively. The BBT scores at 2， 24 and 72 h after modeling in minor and serious groups were higher than those in sham group （<0.05）. The HE staining results showed that the neurons in the extensive cerebral cortex （especially in M1 and RSA）， ventrolateral part of ventromedial hypothalamus （VMHvl） and hippocampal C2 region showed morphological changes at different degrees. The non-targeted metabonomics analysis revealed a total of 45 differential metabolites in the plasma of sham and serious groups， comprising 33 up-regulated and 12 down-regulated metabolites. In addition， the RSA exhibited 19 differential metabolites， including 6 up-regulated and 13 down-regulated metabolites. This finding suggests that the modeling disrupted neuroendocrine function in the rats.The bilateral common carotid artery occlusion and open circulation model can lead to diffuse and extensive damage to the cerebral cortex， VMHvl， and hippocampal C2 region in rats， and the injury mechanism may be linked to metabolic disorders， oxidative stress damage， and other factors. This model provides a new experimental model for investigating repeated ischemia-reperfusion injury in rats with CSVD.

cerebral small vessel disease； ischemic stroke； ischemia-reperfusion injury； rat model

1000-4718（2023）07-1330-09

2022-09-30

2023-03-24

0731-88458257； E-mail： 68761083@qq.com

R363； R743； R-33

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.07.022

［基金項目］湖南省自然科學基金資助項目（No. 2020JJ5424）；湖南省教育廳青年基金資助項目（No. 21B0386）；湖南中醫藥大學中西醫結合“雙一流”學科開放基金資助項目（No. 2020ZXYJH08）

（責任編輯：李淑媛，羅森）