貝萊斯芽孢桿菌HN-2次生代謝產物處理下黃單胞菌（Xoo）的轉錄組分析

高 雪，勞廣術，譚 崢，方渝凱，劉文波，靳鵬飛，繆衛國

（海南大學 植物保護學院/熱帶農林生物災害綠色防控教育部重點實驗室，海口 570228）

水稻（Oryza sativaL.）白葉枯病是一種由黃單胞菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo）引起的細菌性病害，在各水稻種植區均有發生，并且危害嚴重，是我國水稻重要病害之一[1]。發病后葉片產生黃綠色病斑，最終變黃枯死，每年造成水稻產量減少20%～30%，嚴重時減產50%，甚至絕收[2]。雖然目前有一些抗病品種，但是抗病性易隨著時間而逐漸減弱。防治白葉枯病的化學藥劑有銅制劑、有機磷、有機氮、噻唑類等[3-8]，這些藥劑大部分在田間使用時易使病菌產生抗藥性，對環境有影響。如噻枯唑在田間已有明顯抗性[9]；5-氧吩嗪類藥劑持效期短，病害易復發，水稻白葉枯病的防治形勢依舊嚴峻。

生物防治是一種高效且對環境友好的策略，可以用于植物病害的治理[10]。生防芽孢桿菌是目前應用最廣泛的生防細菌之一，對各種真菌、細菌和病毒的侵染造成的植物病害，都能夠有效地抑制[11]，并且還具有良好的促進植物增產、誘導植物抗病的能力。目前，越來越多生防芽孢桿菌被開發成農藥，得到商品化產品[12]。芽孢桿菌能夠產生次級代謝物質來抑制和殺滅有害微生物，這些活性代謝物質主要包括酶類、細菌素類，以及受到關注最多的脂肽類等[13-14]，如地衣形芽孢桿菌（Bacillus licheni formus）可以發酵產生一種具有良好的抑制細菌活性的脂肽類物質——桿菌肽。桿菌肽目前作為一種多肽類抗生素已經被廣泛地應用于醫學[15]。有研究[16]表明芽胞桿菌屬（Bacillusspp.）能夠產生具有較強拮抗Xoo的脂肽類活性物質。Bacillusstrain D13可以產生一種揮發性物質，該揮發性物質具有較好的抑制Xoo的活性[17]。解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensFZB42分泌的抗生素類物質bacilysin和difficidin對水稻黃單胞菌Xoo具有顯著的抑菌作用[18]。筆者所在實驗室的研究[19]發現，貝萊斯芽孢桿菌HN-2產生的C15surfactin A對Xoo具有較強抗菌活性，能抑制Xoo的生長，并通過介導抗氧化劑相關酶的活性而引發過敏性反應，有效地誘導水稻對Xoo的抗性。雖然目前已經有一些關于芽孢桿菌抑制Xoo的研究，然而貝萊斯芽孢桿菌抑制Xoo的作用機制尚不明確。因此，本研究以HN-2菌株發酵液正丁醇提取物處理12 h后的Xoo為研究對象，進行轉錄組測序和分析，擬求得Xoo應對HN-2抑菌活性成分的代謝途徑基因表達差異圖譜，為后續進一步揭示貝萊斯芽孢桿菌HN-2的抑植物病原細菌Xoo機理提供前期數據和理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及樣品準備貝萊斯芽孢桿菌HN-2為本實驗室從土壤中分離保存，稻黃單胞菌Xoo（PXO99A）由筆者所在的實驗室提供保存。桿菌肽（98%，分析純）購自日本和光純藥株式會社有限公司。（1）HN-2發酵活性物質的提取：接種HN-2菌株于LB培養基37 ℃，180 r·min-1振蕩培養48 h后，離心10 min棄去菌體，得到HN-2發酵液上清液。等比例并充分混合正丁醇和HN-2發酵上清液后，室溫下靜置過夜，用分液漏斗分離有機相得到上層正丁醇萃取液。在67 ℃下將得到的上層正丁醇萃取液進行旋轉蒸發濃縮，蒸發濃縮后的沉淀用少量甲醇充分溶解并進行冷凍干燥12 h，得到HN-2抑菌活性成分粉末粗提物，-80 ℃保存備用，使用前稱取0.01 g粗提物加入1 mL的超純水充分溶解，并用一次性細菌過濾器過濾。（2）樣品處理：從平板上挑取黃單胞菌的單菌落接種至PSA液體培養基中，共接種9瓶，在28℃，180 r·min-1振蕩培養至生長對數期（OD600=0.300）。此時向第一組菌液中加入HN-2正丁醇提取物至終濃度為MIC50值（2.36 mg·mL-1），第二組菌液加入桿菌肽至終濃度為MIC50值（11.96 mg·mL-1），第三組菌液不做任何處理，繼續振蕩培養12 h，3次重復，將HN-2正丁醇提取物處理12 h的樣品命名為“Xoo-HN-2”，桿菌肽處理12 h的樣品命名為“Xoo-G”，對照組命名為“Xoo-CK”。

1.2 轉錄組測序和生物信息學分析樣品Xoo總RNA的提取使用天根RNA提取試劑盒，并將提取的RNA送到廣州基地奧生物科技公司進行質檢，以保證所有樣品最終都獲得高質量的總RNA。利用Illumina HiSeq X Ten 測序平臺（Illumina Inc, CA, USA）進行轉錄組建庫測序及分析。步驟：（1）去除核糖體RNA；（2）RNA隨機打斷為200 nt片段；（3）加入六堿基隨機引物、緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA聚合酶Ⅰ合成cDNA第一條鏈；（4）使用dUTP代替dTTP，合成cDNA第二條鏈；（5）末端修復3′、5′端，加A尾，連接接頭；（6）使用UNG酶降解cDNA第二條鏈，以保留RNA方向信息；（7）PCR擴增產生DNA的聚集片段，完成文庫制備；（8）利用Illumina測序平臺對構建好的文庫進行雙末端測序，將所得數據過濾后用于后續的轉錄組分析[20]。

1.3 差異基因表達分析對樣品中的Mapped reads數目和轉錄本長度進行歸一化處理，使用RAEM軟件，采用FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）作為衡量轉錄本的指標[21]，采用皮爾森相關系數（Pearson Correlation Coefficient，PCC）法檢測重復樣品之間的相關性，并利用DESeq R包分析不同處理后Xoo的差異表達基因。為進一步控制該過程中的錯誤發現率（false discovery rate，FDR），使用edgeR[22]軟件對不同樣品間差異表達基因定量分析。采用FDR（false discovery rate）與log2(FoldChange)（log2FC）來作為差異表達基因篩選的關鍵指標，篩選條件為FDR＜0.05且|log2FC|＞1。

1.4 基因功能富集分析將篩選得到的差異基因進行GO富集分析，用特定的GO terms給差異表達基因的表達模式注釋；利用KEGG數據庫找出在差異表達基因中，富集最顯著的前20條代謝通路畫圖展示。

2 結果與分析

2.1 RNA-seq數據質控結果轉錄組原始數據質控過濾前后的黃單胞菌Xoo（PXO99A）轉錄組測序數據統計情況見表1。由表1可見，CK組、HN-2組、桿菌肽組的樣本通過測序獲得的原始堿基數（Raw Data）分別為3 669 218 400、3 356 470 200和5 089 554 000。3組原始序列經過質控后獲得的Clean data分別為3 490 096 417、3 232 110 301和502 049 243。過濾后的總堿基數占原始序列的比例分別為98.55%、98.53%和97.32%，Q20分別為98.03%、98.03%和97.32%，Q30分別為94.89%、94.89%和92.0%，GC含量分別為61.61%、61.06%和60.93%，這些結果表明過濾后所獲得的序列質量較好，可靠性高，Clean reads可以用于后續的生物信息學分析。

表1 Reads過濾前后堿基信息統計結果

2.2 樣品重復性相關性檢測本實驗共有3個樣本（CK組，HN-2組，G組），通過主成分分析（PCA）可以評價樣品重復性、找出離群樣品、評估組間差異等。使用R語言獲得各個樣本在第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）2個綜合變量中的數值大小，作二維坐標圖。如圖1所示，PC1可以解釋原所有基因的表達量總體方差的71.3%，PC2可以解釋原所有基因的表達量總體方差的28.7%，PC1與PC2共可以解釋總體方差的100%，表明樣品重復性高，組間差異小。通過R計算3個樣本及每個樣本的3個生物學重復間的皮爾森相關系數（Pearson Correlation Coefficient，PCC）。如圖2所示，可以看到每個樣本的3個生物學重復之間的相關系數呈對角線分布，表明測序數據具有較強的重復性和較高的可信度，可以用于后續的差異表達分析。

圖1 主成分分析PCA圖

圖2 相關性熱圖

2.3 差異基因表達統計分析如圖3所示，HN-2組和桿菌肽組相比，共篩選到1 226個差異基因，其中有612個基因在HN-2組中上調，614個基因在HN-2組中下調。桿菌肽組和CK組相比，共篩選到1 146個差異基因，其中，有730個基因在桿菌肽組中上調，416個基因在桿菌肽組中下調。HN-2組和CK組相比，共篩選到1 512個差異基因，其中有871個基因在HN-2組中上調，641個基因在HN-2組中下調。此外無論是加入HN-2還是桿菌肽，上調表達基因都多于下調表達基因，并且HN-2組表達差異的表達基因總數多于桿菌肽組，說明經HN-2處理后，Xoo有更多的基因被調控來參與到對HN-2處理后的適應過程中。本研究重點關注的是不同處理之間的差異，因此對兩兩比較的差異基因繪制了韋恩圖（圖4）。圖4可見，與桿菌肽組相比，HN-2組有275個差異表達基因為其特有，是HN-2提取物與桿菌肽抑菌機制不同導致，這些HN-2組特有的差異基因有助于進一步研究HN-2對Xoo的作用機理。因此，在后續對于HN-2組的差異表達基因定性分析時，這275個差異基因將作為重點研究分析對象。

圖3 樣品間差異基因統計

圖4 差異表達基因韋恩圖

2.4 GO功能分析和KEGG通路分析

2.4.1 差異表達基因的GO統計從圖5～7中可以看出，在生物過程中，HN-2組的差異基因主要集中在單體有機體過程、代謝過程和細胞進程等功能條目中，其中，單體有機體過程包含33個差異基因，代謝過程包含35個差異基因；細胞進程中包含20個差異基因，在細胞組分中，HN-2組的差異基因主要富集在細胞、細胞成分和大分子復合物等功能條目中，其中，細胞核細胞成分均包含17個差異基因；在分子功能中，HN-2組的差異基因主要富集在結合、催化活性和結構分子活性等功能條目中，其中，結合過程包含26個差異基因，催化活性包含24個差異基因，結構分子活性包含9個差異基因。此外，可以看到雖然HN-2組和桿菌肽組的富集結果大致相似，但是HN-2組的差異基因數目（共148個差異基因）顯著多于桿菌肽組的差異基因數目（共117個差異基因）。

圖5 樣品間差異基因GO分類圖（CK vs 桿菌肽）

圖6 樣品間差異基因GO分類圖（CK vs HN-2）

圖7 樣品間差異基因GO分類圖（桿菌肽vs HN-2）

2.4.2 轉錄組數據的KEGG通路分析對桿菌肽與HN-2正丁醇提取物處理后，菌株Xoo的代謝通路顯著性富集分析，選取了富集最為顯著的20條代謝通路畫圖（圖8～10）展示。圖8表明，與對照組相比，桿菌肽處理后，富集程度較高、富集較為顯著且包含差異基因數目較多的途徑有鞭毛組裝、核糖體途徑、細菌趨化性和雙組分系統氧化磷酸化等；圖9表明，與對照組相比，HN-2正丁醇提取物處理后，核糖體途徑所包含的差異表達基因富集的程度最高、富集最顯著且差異表達基因的數目最多，其余主要參與的代謝途徑有淀粉和蔗糖代謝、苯甲酸降解、甘油磷脂降解、細菌趨化性等。因此，在后續對相關代謝途徑的生物學驗證中，可以重點關注和研究核糖體途徑的淀粉蔗糖代謝中的差異表達基因。

圖8 差異表達基因KEGG 顯著富集通路結果圖（CK vs 桿菌肽）

圖9 差異表達基因KEGG 顯著富集通路結果圖（CK vs HN-2）

圖10 差異表達基因KEGG 顯著富集通路結果圖（桿菌肽 vs HN-2）

3 討 論

黃單胞菌能夠引起的水稻白葉枯病，是水稻生產上的一類重要細菌病害[1]。生防細菌貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis由Ruiz-Garcia等[23]發現并命名，因其具有對人畜和環境友好，菌株不易產生抗藥性、在自然環境中易降解等特點而受到廣泛的研究和關注[24]。貝萊斯芽孢桿菌具有優越的抑制細菌能力，它能夠產生許多抑菌活性物質，其中關注度最高的是脂肽類物質[15]。本實驗室的前期研究結果發現，貝萊斯芽孢桿菌HN-2菌株發酵液的正丁醇提取物對Xoo具有很強的抑菌活性，通過分離純化，得到了正丁醇提取物中的主要活性成分，并利用高效液相色譜-質譜/質譜聯用(HPLC-MS/MS)技術對其結構進行了鑒定，結果表明貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）HN-2正丁醇提取物中的C15surfactin A對Xoo具有較強抗菌活性，能抑制Xoo的生長[19]，但其具體的抑菌機制尚不明確。

已有研究通過對藥劑處理前后轉錄組測序來探究抑菌物質對Xoo的作用機理，如Fan等[25]對鄰香豆酸處理30 min、1 h、3 h、6 h的Xoo菌與DMSO對照處理的Xoo菌進行轉錄組測序，KEGG聚類分析結果表明：在處理30 min后，差異表達基因沒有明顯聚類，主要都集中在代謝途徑方面；處理1 h后，氧化磷酸化途徑富集最顯著；處理3 h后，差異表達基因聚類在氧化磷酸化和蛋白質合成途徑中；處理6 h后，差異表達基因集中在糖代謝途徑、組氨酸代謝途徑和細菌趨化性等方面。并且還發現，MarR家族蛋白基因簇在4個時間段內都顯著上調表達。據報道[25]MarR家族蛋白與病原細菌轉運抗生素有關。Liang等[26]對經過噻枯唑處理4.5 h和9 h后的Xoo轉錄組進行分析，發現Xoo的組氨酸代謝途徑顯著被噻枯唑所抑制。Chen等[27]為了研究褪黑激素作為抗生素如何抑制黃單胞菌的生長，分析了200 μg·mL-1濃度褪黑素處理21 h的Xoo的轉錄組數據，結果表明，138個基因的mRNA轉錄水平發生了變化，以應對褪黑激素的攻擊。上調基因主要集中在鞭毛成分、轉運蛋白活性等途徑，而催化活性、金屬結合活性、碳水化合物代謝和氨基酸代謝等途徑顯著下調表達。在本實驗中，為進一步明確HN-2的抑菌機制，將桿菌肽和HN-2正丁醇提取物處理12 h后的Xoo菌進行轉錄組測序。桿菌肽（Bacitracin）是一類由地衣芽孢桿菌（Bacillus licheni formus）發酵生產的一類脂肽類物質，具有良好的抑制細菌活性[28]。桿菌肽的作用機制明確，它通過抑制細胞壁的合成，對細胞膜造成損傷，使細胞質中離子和氨基酸外泄來發揮抑菌作用[29]。與地衣芽孢桿菌一樣，貝萊斯芽孢桿菌也能夠通過非核糖體途徑合成一些具有抑菌活性的脂肽類物質，因此本實驗選擇桿菌肽作為對比來檢驗貝萊斯芽孢桿菌HN-2的主要抑菌機制與桿菌肽是否具有相似性。

轉錄組測序分析后發現Xoo的核糖體途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑、細菌趨化性途徑等在受到HN-2正丁醇提取物的影響后顯著上調表達，說明HN-2正丁醇提取物很可能通過影響這些代謝途徑而發揮抑菌能力。由圖4可以看到，HN-2組與桿菌肽組中相同的差異基因僅占HN-2組所有差異基因的45.3%，HN-2組還有54.7%差異基因為其特有，因此，可以得出結論，HN-2正丁醇提取物的抑菌活性與桿菌肽可能有部分相似性，但是其主要抑菌機理仍需要進一步探究與分析。通過KEGG富集分析結果發現，HN-2正丁醇提取物處理后，核糖體途徑富集的程度最高、富集最顯著、且包含的差異表達基因數目最多。在核糖體途徑中發現顯著上調表達的rpoB，rpoB基因是結核分枝桿菌（M.tuberculosis）中編碼RNA聚合酶β亞基的基因。萬智敏等[30]的研究結果表明，rpoB基因耐藥決定區（rifampin resistance-determining region，RRDR）的突變可以引起96%以上的結核分枝桿菌臨床分離株對利福平耐藥，并且rpoB基因不同的突變模式對利福平產生的耐藥程度有顯著的差異。由此可以推測菌株HN-2正丁醇提取物與利福平的抑菌機理可能存在一定相似性。此外，還發現核糖體途徑中secY、secE和secG基因顯著上調表達，secY、secE和secG基因所編碼的蛋白是分泌途徑中主要的3種膜蛋白[31]，大多數細菌蛋白的運送都由secYEG復合體完成，可以推測HN-2正丁醇提取物可能影響了Xoo中蛋白的分泌與運輸，從而影響Xoo菌與外界的物質交換。同時還發現HN-2正丁醇提取物處理后Xoo內淀粉和蔗糖代謝途徑中的差異基因數目較多，差異較顯著，可以推測HN-2正丁醇提取物可能使Xoo對淀粉和蔗糖等物質的代謝利用能力發生了改變。

本研究中，對Xoo經過HN-2正丁醇提取物和桿菌肽處理12 h轉錄組的分析結果表明，HN-2正丁醇提取物主要影響Xoo的核糖體途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑、細菌趨化性途徑。為進一步明確HN-2對Xoo的抑菌機理提供了理論基礎。