柴胡皂苷B通過Nrf2/ARE信號緩解Caco-2細胞氧化損傷

楊慧 黃麗麗

[摘要]?目的?探討柴胡皂苷B（saikosaponin?B，SSB）對棕櫚酸（palmitic?acid，PA）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）聯合誘導的人結直腸腺癌細胞（Caco-2）屏障損傷的保護作用及潛在機制。方法?利用Caco-2細胞構建腸道屏障模型，采用隨機數字表法將細胞分為對照組（CON組，n=6），模型組（PA+LPS組，n=6）和柴胡皂苷B干預組（PA+LPS+SSB組，n=6），通過測量跨膜電阻（transepithelial?electrical?resistance，TEER）值和緊密連接蛋白的表達水平，評價SSB對Caco-2細胞屏障損傷的保護作用。通過檢測活性氧（reactive?oxygen?species，ROS）和脂質過氧化物含量評估細胞氧化壓力。通過定量聚合酶鏈反應和蛋白質免疫印跡法檢測SSB對Nrf2/ARE信號通路相關基因及蛋白的表達水平的影響。通過敲降Nrf2驗證SSB改善細胞屏障功能是否通過Nrf2/ARE途徑。結果?PA+LPS+SSB組Caco-2細胞的TEER值、ZO-1和Occludin-1的蛋白水平顯著高于PA+LPS組（P<0.05）。PA+LPS組細胞內丙二醛（malondialdehyde，MDA）、4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）、蛋白羰基含量（protein?carbonyl?content，PCC）和ROS含量均顯著高于對照組（P<0.05），PA+LPS+SSB組的4-HNE、MDA、ROS含量和PCC均顯著低于PA+LPS組（P<0.05）。PA+LPS+SSB組細胞內Nrf2和p-Nrf2的蛋白水平、Nqo1和Ho-1的mRNA水平、過氧化氫酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，SOD）酶活性均顯著高于PA+LPS組（P<0.05）。PA+LPS+SSBsiNrf2組細胞中ZO-1和Occludin-1的蛋白水平和轉錄水平均顯著低于PA+LPS+SSB組（P<0.05），ROS、4-HNE、MDA含量和PCC均顯著高于PA+LPS+SSB組（P<0.05）。結論?SSB通過激活Nrf2/ARE信號通路增加了腸上皮細胞的抗氧化能力，抑制了PA和LPS引起的Caco-2細胞氧化應激和屏障損傷，對腸上皮細胞具有良好保護作用。

[關鍵詞]?柴胡皂苷B；屏障損傷；Nrf2/ARE；氧化應激

[中圖分類號]?R285.5??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.20.015

Saikosaponin?B?alleviates?oxidative?stress?and?barrier?damage?in?Caco-2?cells?through?activation?of?Nrf2/ARE?signaling

YANG?Hui，?HUANG?Lili

Department?of?Pharmacy，?Ningbo?Medical?Center?Lihuili?Hospital，?Ningbo?315040，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?protective?effect?and?therapeutic?mechanism?of?saikosaponin?B?（SSB）?on?Caco-2?cell?barrier?damage?induced?by?the?combination?of?palmitic?acid?（PA）?and?lipopolysaccharide?（LPS）.?Methods?A?monolayer?barrier?model?of?Caco-2?cells?was?constructed?in?vitro?and?the?cells?were?divided?into?control?（CON，?n=6）?group，?model?（PA+LPS，?n=6）?group?and?saikosaponin?B?（PA+LPS+SSB，?n=6）?group?according?to?the?random?number?table?method.?The?regulatory?effects?of?SSB?on?barrier?injury?in?Caco-2?cells?were?observed?by?measuring?transepithelial?electrical?resistance?（TEER）?values，?gene?and?protein?levels?of?tight?junction?molecules.?Cellular?oxidative?stress?was?assessed?by?reactive?oxygen?species?（ROS）?and?lipid?peroxide?levels.?The?effect?of?SSB?on?the?expression?levels?of?genes?and?proteins?related?to?the?Nrf2/ARE?signaling?pathway?was?examined?by?quantitative?PCR?and?Western?blot.?Cell?transfection?was?performed?to?construct?a?siNrf2?cell?model?to?verify?that?SSB?maintains?cellular?barrier?function?through?activation?of?the?Nrf2/ARE?pathway.?Results?The?TEER?values?and?the?protein?levels?of?ZO-1?and?Occludin-1?in?the?PA+LPS+SSB?group?were?significantly?higher?than?those?in?the?PA+LPS?group?（P<0.05）.?The?intracellular?malondialdehyde?（MDA），?4-hydroxynonenal?（4-HNE），?protein?carbonyl?content?（PCC）?and?ROS?in?the?PA+LPS?group?were?significantly?higher?than?those?in?the?control?group?（P<0.05），?while?the?intracellular?4-HNE，?MDA，?PCC?and?ROS?in?the?PA+LPS+SSB?group?were?significantly?lower?than?those?in?the?PA+LPS?group?（P<0.05）.?The?protein?levels?of?Nrf2?and?p-Nrf2，?mRNA?levels?of?Nqo1?and?Ho-1，?catalase?（CAT）?and?superoxide?dismutase?（SOD）?enzyme?activities?in?the?PA+LPS+SSB?group?were?significantly?higher?than?those?in?the?PA+LPS?group?（P<0.05）.?ZO-1?and?Occludin-1?in?the?PA+LPS+SSBsiNrf2?group?were?significantly?lower?than?those?in?the?PA+LPS+SSB?group?at?both?protein?level?and?transcript?level?（P<0.05），?and?the?levels?of?ROS，?4-HNE，?MDA?and?PCC?were?significantly?higher?than?those?in?the?PA+LPS+SSB?group?（P<0.05）.?Conclusion?Saikosaponin?B?increase?the?antioxidant?capacity?of?intestinal?epithelial?cells?through?activating?the?Nrf2/ARE?signaling?pathway，?and?inhibite?oxidative?stress?and?barrier?damage?induced?by?PA?and?LPS?in?Caco-2?cells，?the?present?data?indicate?that?SSB?has?a?protective?effect?on?intestinal?epithelial?cells.

[Key?words]?Saikosaponin?B;?Barrier?damage;?Nrf2/ARE;?Oxidative?stress

腸道屏障是由腸上皮細胞與腸上皮緊密連接蛋白（intestinal?epithelial?tight?junctions，TJs）形成的具有選擇性的物理屏障，允許離子、營養物質和水的定向吸收，同時抵御有害物（如腸道病原體，抗原和毒素）進入機體[1]。腸道屏障功能障礙導致有害物質入侵增加，引起系統性炎癥反應，最終導致各種疾病，如炎性腸病（inflammatory?bowel?disease，IBD）和腸易激綜合征（irritable?bowel?syndrome，IBS）[2]。研究發現，富含棕櫚酸（palmitic?acid，PA）的膳食可顯著增加小鼠腸道通透性，減少TJs蛋白表達，增加炎癥因子白細胞介素-1β的表達和分泌[3-4]。因此，過量食用高脂膳食會引發炎癥反應，破壞TJs的完整性和腸道屏障功能。中藥柴胡含有大量的三萜類皂苷，由于其具有抗氧化、抗炎和抗癌活性，已受到越來越多的關注[5-7]。研究表明，柴胡皂苷可以顯著抑制脂多糖脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的急性肺損傷小鼠髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性和促炎癥因子分泌[6]。在硫酸葡聚糖誘導的結腸炎小鼠模型中，柴胡皂苷A通過抑制核因子-κB的激活和重塑腸道微生物群而改善腸道炎癥[7]。可見柴胡皂苷對細胞炎癥和氧化應激表現出顯著的藥理活性，然而，柴胡皂苷B（saikosaponin?B，SSB）改善高脂和LPS誘發的腸上皮細胞屏障損傷的相關研究報道較少。本實驗旨在初步探討SSB通過調節Nrf2/ARE途徑對PA和LPS誘導Caco-2細胞損傷的保護機制，為SSB的臨床開發利用提供理論基礎。

1??材料與方法

1.1??材料與試劑

人結直腸腺癌細胞（Caco-2）購自于中國科學院細胞庫（中國上海）。SSB（純度>98%）和棕櫚酸（palmitic?acid，PA）購于中國阿拉丁生化科技股份有限公司，LPS購于美國Sigma-Aldrich試劑公司。過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，SOD）、4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、蛋白質羰基含量（protein?carbonyl?content，PCC）檢測試劑盒均購于中國南京建成生物工程研究所，DMEM培養基購于美國Gibco公司，熒光染料DCFH-DA購于中國碧云天生物技術有限公司，Lipofectamine?2000轉染試劑購于美國Invitrogen公司，其他化學試劑均為分析純。

1.2??方法

1.2.1??細胞培養與藥物處理??在常規條件下（37℃，5%?CO2）的細胞培養箱中培養Caco-2，DMEM培養基含有10%血清和青霉素/鏈霉素。采用隨機數字表法將細胞分為對照組（CON組，n=6），模型組（PA+LPS組，n=6）和柴胡皂苷B干預組（PA+LPS+SSB組，n=6），其中PA的濃度為200μmol/L，LPS濃度為10μg/ml，SSB的濃度為5μmol/L。

1.2.2??細胞活力測定??Caco-2細胞在96孔板中培養24h，加入含有不同濃度（0～20μmol/L）SSB的無血清DMEM持續培養不同時間。在每個孔中加入100μl的噻唑藍染料溶液（0.5mg/ml），置于培養箱孵育4h。棄去培養基后，向每孔加入150μl的二甲基亞砜，采用Varioskan?LUX多功能酶標儀（美國賽默飛世爾公司）測量570nm吸光度。

1.2.3??跨膜電阻（transendothelial?electrical?resistance，TEER）測定??采用PA（200μmol/L）和LPS（10μg/ml）共同處理Caco-2細胞12h，建立腸道上皮屏障損傷細胞模型。使用Millipore?Millicell?ERS-2?跨膜電阻儀（美國密立博公司）和筷子型電極進行電阻測定。達到單層匯合后，將Caco-2細胞用于TEER測量，分別在0、4h、12h測量電阻，并計算TEER值。TEER=（R1–R0）×A（Ω·cm2），其中R1為細胞孔電阻（Ω），R0為空白孔電阻（Ω），A代表膜面積（cm2），所有的TEER測量均在37℃下進行。

1.2.4??活性氧（reactive?oxygen?species，ROS）含量測定??使用DCFH-DA熒光探針法測量ROS含量。細胞處理后，收集于離心管中，用10μmol/L的DCFH-DA避光孵育20min。將無血清DMEM清洗3次后，PBS緩沖液重懸細胞，采用Varioskan?LUX多功能酶標儀（美國賽默飛世爾公司）分別測量細胞中ROS的熒光值，其中激發波長為488nm，發射波長為525nm。

1.2.5??敲降Nrf2??使用siRNA試劑盒（購于中國Origene生物科技有限公司）對Caco-2細胞進行Nrf2敲降。Caco-2細胞種于6孔板中，融合率達到80%后，細胞饑餓處理6h，利用Lipofectamine?2000轉染試劑將siRNA轉染細胞，并于48h后提取蛋白檢測Nrf2表達水平。

1.2.6??定量聚合酶鏈反應（quantitative?PCR，qPCR）??細胞經PBS緩沖液沖洗3遍，加入TRIzol試劑提取RNA并測量濃度，采用反轉錄試劑盒（購于中國諾唯贊公司）將mRNA反轉錄為cDNA。使用SYBR?Green熒光染料（購于中國諾唯贊公司）進行qPCR分析以確定目的基因表達水平，引物序列見表1。采用2–ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.2.7??蛋白質免疫印跡??細胞經PBS緩沖液沖洗3次后，加入RIPA細胞裂解液，置于冰上裂解30min，采用BCA法測定裂解液蛋白含量，經SDS-PAGE電泳，轉膜、封閉、孵育一抗和二抗、曝光顯影。檢測ZO-1、Occludin-1、Nrf2、磷酸化Nrf2的表達水平，并使用ImageJ軟件對條帶灰度進行量化分析。

1.4??統計學方法

采用GraphPad?Prism?9.0統計學軟件對數據進行處理分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析和Tukey檢驗，數據取3次以上獨立實驗的平均值。P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??SSB對Caco-2細胞活力的影響

2.5μmol/L≤SSB≤10μmol/L時，Caco-2細胞活力與對未添加SSB的細胞相比，差異均無統計學意義（P>0.05）；當SSB濃度為20μmol/L時，Caco-2細胞活力明顯低于未添加SSB的細胞（P<0.05）；用10μmol/L?SSB處理細胞，6～24h內Caco-2細胞活力與0h比較，差異均無統計學意義（P>0.05），48h時的Caco-2細胞活力顯著低于0h（P<0.05），見圖1。因此，選擇藥物處理條件為5μmol/L處理12h，開展后續實驗。

2.2??Caco-2細胞屏障損傷水平比較

4h和12h時，PA+LPS組Caco-2細胞的TEER值顯著低于對照組（P<0.05），PA+LPS+SSB組TEER值顯著高于PA+LPS組（P<0.01）。PA+LPS組的ZO-1和Occludin-1的轉錄水平和蛋白水平均顯著低于對照組（P<0.05）；PA+LPS+SSB組的ZO-1和Occludin-1的表達水平均顯著高于PA+LPS組（P<0.05），見圖2。

2.3??Caco-2細胞氧化應激水平比較

PA+LPS組細胞內4-HNE、MDA、PCC和ROS含量均顯著高于對照組（P<0.05），PA+LPS+SSB組的4-HNE、MDA、ROS含量和PCC均顯著低于PA+LPS組（P<0.05），見圖3。

2.4??Caco-2細胞中Nrf2/ARE信號通路水平比較

PA+LPS+SSB組細胞內Nrf2和p-Nrf2的蛋白水平、Nqo1和Ho-1的mRNA水平、CAT和SOD酶活性均顯著高于PA+LPS組（P<0.05），PA+LPS組CAT和SOD酶活性均顯著低于對照組（P<0.05），見圖4。

2.5??Nrf2/ARE信號通路保護作用比較

PA+LPS+SSB組的ZO-1和Occludin-1蛋白水平、轉錄水平均顯著高于PA+LPS組（P<0.05）；PA+LPS+SSBsiNrf2組的ZO-1和Occludin-1蛋白水平、轉錄水平均顯著低于PA+LPS+SSB組（P<0.05）；對照組和PA+LPS+SSB組的TEER值均顯著高于PA+LPS組（P<0.05），見圖5。PA+LPS+SSBsiNrf2組ROS、4-HNE、MDA含量和PCC均顯著高于PA+?LPS+SSB組（P<0.05），PA+LPS+SSB組的ROS、4-HNE、MDA含量和PCC均顯著低于PA+LPS組（P<0.05），見圖6。

3??討論

腸道上皮細胞作為腸道物理屏障，負責抵御腸腔內致病微生物、毒素和過敏原的入侵，是腸道屏障功能的重要組成部分[2]。高脂飲食會增加腸道通透性，導致腸腔中LPS和細菌代謝產物滲入機體，造成代謝性內毒素血癥的發生[8]。其中，PA作為人類飲食中最常見的長鏈飽和脂肪酸之一，對人類的多種器官均有脂毒作用[9]。Ouyang等[3]發現高濃度PA（>400μmol/L）處理會增加Caco-2細胞屏障滲透性，抑制緊密連接相關蛋白（Claudin-1、Occludin-1和ZO-1）基因轉錄。Gori等[10]發現PA和LPS可以構建腸道屏障損傷體外模型，很好的模擬了高脂膳食引起的實驗動物腸道屏障功能損傷。

研究發現柴胡皂苷可以通過靶向調控AMPK、MAPK、核因子κB等信號途徑改善嚙齒動物的腸道炎癥和代謝紊亂[11]。然而，對PA誘導的腸道屏障功能損傷研究還未見報道。本研究使用PA和LPS聯用構建腸道屏障損傷細胞模型，研究結果顯示SSB干預緩解了PA+LPS引起的Caco-2細胞屏障受損，增加緊密連接蛋白（Occludin-1和ZO-1）的表達，有效維持細胞屏障完整性和功能。PA+LPS組可增加Caco-2細胞內ROS含量，導致大量脂質過氧化物（MDA、4-HNE和PCC）堆積。MDA和4-HNE是脂質/蛋白質過氧化的有毒代謝物，被廣泛用作許多代謝性疾病發病過程中氧化應激的生物標志物[12-13]。同樣，過量的羥基自由基作用于蛋白質的肽鍵，在肽鍵斷裂處產生羰基，破壞蛋白質功能，是機體內氧化壓力水平升高的指標[14]，推測PA+LPS可導致Caco-2細胞內抗氧化系統受到抑制，ROS不能被充分清除，導致氧化還原失衡，進而引發屏障功能損傷的發生和惡化。有研究表明，柴胡皂苷通過增強抗氧化酶（CAT、HO-1、SOD和GST），降低MDA含量，對5-氟尿嘧啶誘導的腸炎小鼠的腸道組織有明顯的保護作用，本研究結果與其一致[15]。

Nrf2/ARE是體內經典的抗氧化信號通路，調節多種抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達。有研究發現，過表達Nrf2可以改善高脂飲食引起的小鼠代謝紊亂和腸道屏障損傷[16]。SSB是Nrf2信號通路的潛在激動劑[17-18]，可明顯減緩H2O2誘導的MDA和乳酸脫氫酶的釋放，增加SOD和CAT酶的活性，從而減少細胞凋亡[17]。Lin等[18]發現，柴胡皂苷D可以通過清除ROS來抑制H2O2誘導的PC12細胞凋亡，可能與阻斷MAPK依賴的氧化損傷有關。本研究結果顯示，SSB干預可以增加Nrf2和p-Nrf2的蛋白水平，其下游的靶基因Nqo1和Ho-1表達增加，抗氧化酶SOD和CAT的活性顯著升高，說明SSB通過激活Nrf2/ARE抗氧化信號通路，清除PA和LPS誘導的ROS和脂質過氧化產物積累。此外，當敲降Nrf2時，SSB對Caco-2細胞的屏障保護作用消失，可見Nrf2/ARE信號通路是SSB發揮藥效作用的關鍵途徑。

綜上所述，SSB通過激活Nrf2/ARE信號通路可增加腸道上皮細胞的抗氧化能力，抑制PA和LPS引起的Caco-2細胞氧化應激和屏障損傷。本研究初步揭示了柴胡皂苷B對腸壁屏障保護作用的新機制，為治療腸道屏障功能障礙相關疾病提供了潛在的治療藥物。

[參考文獻][1] 李靜，?蔣春明.?腸道菌群及其代謝物在炎癥性腸病腸道屏障中的作用[J].?中國現代醫生，?2022，?60（22）：?89–92.

[9] 郭海蓮，?劉曉玲，?李鵬翠，?等.?游離脂肪酸及葡萄糖對鼠主動脈內皮細胞的影響及作用機制[J].?中國現代醫生，?2012，?50（10）：?4–7.

[18] LIN?X，?WU?S，?WANG?Q，?et?al.?Saikosaponin-D?reduces?H2O2-induced?PC12?cell?apoptosis?by?removing?ROS?and?blocking?MAPK-dependent?oxidative?damage[J].?Cell?Mol?Neurobiol，?2016，?36（8）：?1365–1375.