合生元兒童成長奶粉功能性評價

袁紫晴，陶芷茵，孫曉霞，潘錦蓉，林 沁，林綺琪，鄭倩望＊

1 華南農業大學食品學院，廣東廣州 510640

2 合生元（廣州）健康產品有限公司，廣東廣州 510610

0 引言

牛奶中含有蛋白質、脂質、糖類、礦物質（尤其是鈣和磷）和多種維生素族群等基礎營養元素，是嬰幼兒發育重要的營養補充劑，在增強免疫力、提升骨質健康上有重要作用。一些隨機對照試驗研究發現，青少年日常飲食中補充牛奶可有效增強整個臀部和脊柱的骨骼密度[1]；12 歲的青春期女性連續18 個月每天攝入1 份（568 mL）的全脂或低脂牛奶，可顯著提高骨礦物質的獲取能力[2]。還有研究發現，低免疫力斑馬魚連續食用一些與牛奶含量相似的乳制品，如低溫酸奶、常溫純牛奶和冷凍酸奶冰淇淋等，4 d后，動物體內的免疫細胞，如吞噬細胞、淋巴細胞等數量顯著增加，免疫能力也顯著增強[3]。

兒童成長過程需要補充其他營養元素來滿足發育需要、提高身體素質和增強免疫力。中國《GB19644—2010 食品安全國家標準乳粉》規定了兒童配方奶粉的產品執行標準，但與2021年落實的《GB 10765—2021 食品安全國家標準嬰兒配方食品》有所不同，它針對大于36月齡以上的人群食用，產品的執行標準不及嬰幼兒奶粉嚴格[4]。一般來講，配方食品中蛋白質、碳水化合物含量的要求，目的是讓兒童能更科學、更均衡地生長，避免體重過度增長[5]。如在兒童配方奶粉中添加功能性物質，例如低聚半乳糖、乳鐵蛋白和二十二碳六烯酸（DHA）等。低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）是一種常見的益生元，能刺激人體腸道益生菌群生長，促進對礦物質吸收，從而調節人體骨骼發育，增強免疫能力[6，7]。乳鐵蛋白是來自母乳中的一種活性成分，能與鐵離子結合[8]，顯著提升人體免疫能力和改善機體營養結構[9，10]。另外，飲食中合理添加DHA也能有效提高機體免疫功能[11]。

調查顯示，市面上的兒童奶粉很少在原料上添加GOS等活性物質[12，13]。因臨床試驗周期長、構建模型難度大準確度低，所以本研究使用了更加方便精準的動物試驗，對比兩款奶粉在體重、骨密度、骨強度、血清鈣和增強大鼠免疫力的作用情況，從而為該年齡段兒童提供更科學、優良的配方奶粉。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

21 只4 周齡SD雄性大鼠，飼養于華南農業大學實驗動物中心，許可證號為SYXK（粵）2022-0136；動物實驗證明編號為No.00317301。飼料為輻照滅菌實驗鼠生長繁殖飼料，除雞肉粉、魚粉、豆粕等粗糧外，還添加一些微量元素、維生素。

喂養奶粉為委托方公司提供的合生元兒童成長奶粉（金蓋）（簡稱“金蓋組”）和合生元兒童成長奶粉（藍蓋）（簡稱“藍蓋組”）。

大鼠白細胞介素2（Interleukin，IL-2）ELISA試劑盒、大鼠免疫球蛋白M（Immunoglobulin，IgM）ELISA試劑盒、大鼠骨鈣素（Osteocalcin BGP）OCN ELISA試劑盒、大鼠組織蛋白酶K（Cathepsin-K，Cath-K）ELISA試劑盒、大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）ELISA試劑盒，泉州睿信生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Super Nova?Micro-CT，平山醫療科技（昆山）有限公司；動物牽拉系統Electroforce 323，美國TA儀器沃斯特公司；超純水系統FastPure-B，聯羽有限公司；臺式離心機，德國艾本德有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 奶粉的配方和營養成分

金蓋組配料表：全脂乳粉、脫脂乳粉、固體玉米糖漿、乳糖、低聚半乳糖、二十二碳六烯酸油脂（DHA）、乳鐵蛋白、酒石酸氫膽堿、牛磺酸、動物雙歧桿菌Bb-12（活性益生菌的活菌數≥1×106CFU/g）、醋酸視黃酯、膽鈣化醇、dl-α-醋酸生育酚、植物甲萘醌、硝酸硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇、氰鈷胺、L-抗壞血酸鈉、煙酰胺、葉酸、D-泛酸鈣、D-生物素、碳酸鈣、檸檬酸鈣、硫酸銅、硫酸亞鐵、碳酸鎂、硫酸錳、亞硒酸鈉、檸檬酸鋅。

藍蓋組配料表：全脂乳粉、脫脂乳粉、固體玉米糖漿、乳糖、二十二碳六烯酸油脂（DHA）、酒石酸氫膽堿、牛磺酸、動物雙歧桿菌Bb-12（活性益生菌的活菌數≥1×106CFU/g）、醋酸視黃酯、膽鈣化醇、dl-α-醋酸生育酚、植物甲萘醌、硝酸硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇、氰鈷胺、L-抗壞血酸鈉、煙酰胺、葉酸、D-泛酸鈣、D-生物素、碳酸鈣、檸檬酸鈣、硫酸銅、硫酸亞鐵、碳酸鎂、硫酸錳、亞硒酸鈉、檸檬酸鋅。

兩款奶粉的成分區別主要為：金蓋組含有低聚半乳糖，而藍蓋組不含；藍蓋組中的DHA含量比金蓋組高出90.5%。

合生元兒童成長奶粉（金蓋）和合生元兒童成長奶粉（藍蓋）的營養成分如表1所示。

表1 金蓋組和藍蓋組營養成分表

1.3.2 動物試驗及采食量和體重記錄

21 只4 周齡SD雄性大鼠進入動物房后隨機分為3 組，分別為對照組、奶粉組（金蓋組和藍蓋組），每組7 只進行1 周適應性喂養，自由采食及飲水，每天進行12 h 交替光照，室內溫度設置為恒溫（24±2）℃。適應性喂養后對大鼠進行為期8 周的奶粉補充。

奶粉每天現配現用。分別稱取金蓋組、藍蓋組適量加入50 ℃溫水中，使其終濃度為300 mg/mL，具體灌胃劑量根據大鼠體重增長情況調整，為2～3 mL/次，灌胃時間為每天9：00及15：00。

每天記錄大鼠采食量，每周記錄大鼠體重。

1.3.3 樣品采集

對大鼠注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉處理，取大鼠全血，在4 ℃下4000 r/min離心10 min，吸取上清液得到血清，放入-20 ℃待測。測量大鼠體長（鼻尖至肛門），取兩側股骨，剔除多余肌肉筋膜及結締組織后放于10%的福爾馬林固定液中待測。

1.3.4 大鼠股骨骨微結構測量

將保存于固定液中的股骨取出，通過Micro-CT掃描影像系統對股骨的骨小梁和骨皮質部分進行掃描。測量計算得出骨密度、骨小梁分離度、骨小梁厚度、骨皮質厚度。采用三點彎曲測定大鼠股骨骨強度。

1.3.5 血清中對應數據的測量

取存于-20 ℃的待測大鼠血清，采用生化方法測得樣品中的鈣磷含量，并且采用 ELISA試劑盒測定大鼠血清鈣含量。

1.4 數據處理與分析

試驗數據均采用SPSS 21.0 統計軟件進行統計學處理，試驗相關結果以平均值（mean）±標準誤（SE）表示；采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用S-N-K和LSD事后檢驗法。

2 結果與分析

2.1 奶粉干預對大鼠體重、體長及攝食量的影響

由圖1A和圖1B可知，三組大鼠的體重和體長均無顯著差異。與該品系雄性大鼠體重相比（試驗周期第8 周時，大鼠周齡為12 周，參考體重為460 g），三組大鼠體重均處于該品系大鼠正常范圍的上限，并未顯現超重、營養不良癥狀。

圖1 兩款奶粉干預對大鼠體重、體長及大鼠每日攝食量的影響

三組大鼠的飼料攝食量變化結果如圖1C可知，與對照組相比，兩款奶粉組大鼠的飼料攝食量下降。含有GOS的金蓋組下降幅度更大，并有顯著差異性，但三組的大鼠體重均處于正常水平且無明顯差異。張園園指出，GOS作為一種益生元能增強大鼠飽腹感，減少大鼠對飼料進食[14]，從而避免大鼠肥胖風險。而奶粉本身含有能量和蛋白質等其他營養元素足以支撐健康發育，所以大鼠降低飼料攝入沒有出現體重下降或因食量減少而誘導其他健康問題。

2.2 奶粉組干預對大鼠骨強度和骨密度的影響

三點彎曲原理是將待測樣品放在兩個支撐點上，向中點施加一個向下的載荷，當3 個接觸點在樣品上形成2 個相等的力矩時即發生三點彎曲，樣品的中點處隨即斷裂（圖2）。該原理也適合測量生物的骨骼強度，是研究骨骼生物力學性能的重要檢測手段。

圖2 三點彎曲力學示意圖

骨強度是人體抗骨折能力的評估指標，代表骨的韌性和載荷能力。骨強度提高時，可減少骨折的發生可能。本試驗利用三點彎曲測量3 組大鼠的兩側股骨骨強度，結果如圖3-A所示。與對照組相比，奶粉組結果均有提高，其中金蓋組大鼠股骨骨強度比對照組增加了15.2%，藍蓋組比對照組增加了4.1%。該結果說明了兩種奶粉都能有效增強大鼠的股骨骨強度。

圖3 兩款奶粉干預對大鼠股骨骨強度和骨密度的影響

本試驗采用Micro-CT分別掃描大鼠股骨骨皮質及骨小梁，得到骨密度（3B和3C）。結果顯示，奶粉組大鼠的骨皮質骨密度和骨小梁骨密度與對照組相比，均無顯著性差異（P＞0.05），說明兩款奶粉對骨皮質骨密度及骨小梁骨密度增強效果不明顯。

2.3 奶粉組對大鼠骨代謝的影響

雖然骨密度是影響骨強度和骨折的主要因素，但大多數患有脆骨病患者的骨密度數值變化在合理范圍內波動[15]，只從骨密度數值變化判斷骨骼健康情況不精確，應從骨骼的微觀結構探究其對骨折是否產生重要影響。

對采用Micro-CT掃描大鼠股骨骨皮質及骨小梁的結果進一步分析，得到骨小梁厚度、骨皮質厚度、骨小梁分離度及結構模型指數（圖4）。由圖4A可知，奶粉組均顯著增加大鼠的骨小梁厚度，其中藍蓋組比對照組增加25.7%，金蓋組比對照組增加20.8%。三組大鼠的骨皮質厚度結果如圖4B所示，與對照組相比，奶粉組在骨皮質厚度方面沒有顯著變化；在骨小梁分離度方面，由圖4C可知，與對照組相比，奶粉組都減少了大鼠的骨小梁分離度，其中金蓋組骨小梁分離度降低23.6%，與對照組具有顯著性差異，而藍蓋組和對照組沒有顯著性差異。

圖4 奶粉組對大鼠骨代謝的影響

骨皮質和骨小梁的結構關系如圖5所示。骨皮質和骨小梁是人體骨骼的重要結構，兩者相互依存。骨皮質（紅色區域）為骨小梁提供堅硬的外部保護，骨小梁（白色區域）為骨皮質提供內部支撐。當骨皮質骨厚度和骨小梁厚度增加時，骨小梁的分離度隨之下降，而骨骼的硬度增強，發生骨折的概率降低。其中，骨小梁骨密度是骨代謝的反映指標[16]，當骨密度增加時，骨合成代謝大于分解代謝，反之亦然。本試驗數據中，皆反映大鼠骨骼強度增強（圖4A、4B、4C），且奶粉干預組的大鼠骨小梁骨密度增加（圖3C），說明奶粉攝入有利于大鼠骨骼的合成代謝。

圖5 骨皮質和骨小梁的結構關系

本試驗用結構模型指數SMI定義骨小梁的板狀和桿狀程度，即對于擁有相同厚度的骨小梁，通過其“板”和“桿”的形態分析骨骼疏松情況，其數值介于0～3之間。當骨小梁為板狀結構時，SMI為0，桿狀時為3。當骨骼發生骨質疏松時，骨小梁結構則從板狀轉為桿狀，SMI值也隨之增大[17]。由圖4D可知，與對照組相比，奶粉組對大鼠股骨的結構模型指數影響沒有顯著性差異。

2.4 奶粉組對大鼠血清鈣磷含量和IgM含量的影響

骨骼是人體的重要器官，能為人體結構提供移動性和支撐性，也是鈣磷等礦物質的主要儲庫[18]。本文采用生化分析方法檢測大鼠血清中的鈣磷含量，得到結果如圖6A、6B所示。兩款奶粉添加對對大鼠血清磷含量沒有影響，但是血清鈣含量在奶粉組出現下降，這是由于試驗所使用的大鼠生長維持飼料是高鈣配方，鈣含量比兩款兒童奶粉更高，所以對照組因攝食量較奶粉干預組高，鈣含量更高。由于奶粉補充后提高大鼠的飽腹感，大鼠采食量降低，所以奶粉組的血清鈣含量降低。值得注意的是，盡管金蓋組大鼠的攝食量顯著低于藍蓋組（圖1C），但其血清鈣離子濃度卻高于藍蓋組，而兩者的配方中鈣含量是一致的（表1）。推測是由于金蓋組中添加2%的GOS，而之前也有研究提示額外補充GOS能促進礦物質的吸收[19]。

圖6 奶粉組對大鼠血清磷鈣含量和IgM含量的影響

IgM是B細胞抗原受體的主要成分，是初次體液免疫應答中最早出現的抗體，所以通常作為體液免疫的指標。分析結果可知（圖6C），藍蓋組和金蓋組大鼠的IgM值比對照組分別提高8.5%和5.9%，對大鼠的免疫調節都有一定效果，但藍蓋組的調節效果更強。該結果可能與藍蓋組中DHA有關，由表1可知，藍蓋組中DHA的含量比金蓋組高出90.5%。而DHA是調節體液免疫功能的主要基礎物質[20]，所以藍蓋組對機體免疫的調節功能對比其他兩組有著顯著的效果。

3 結論

本試驗以合生元（廣州）健康產品有限公司提供的合生元兒童成長奶粉（金蓋組）和合生元兒童成長奶粉（藍蓋組）為例子，評估食用配方奶粉和不額外食用配方奶粉、兩款奶粉中含有乳鐵蛋白和GOS分別對大鼠的體重、骨密度、骨強度、血清鈣及機體免疫的影響。最后得出兩款合生元兒童奶粉對大鼠骨骼生產、機體免疫能力都有正向作用，由此推斷兩款兒童奶對兒童骨骼、免疫發育可能起到促進作用。