奶牛乳房炎相關天然免疫基因的探索分析

黃亨良

興義市南盤江鎮農業農村服務中心，貴州興義 562400

0 引言

奶牛乳房炎不但可導致奶牛產奶量下降、淘汰率增加[1]，而且治療費用高昂。數據顯示，由于治療診斷費、勞動成本和廢棄奶等原因造成的平均損失達444 美元/頭·年，其中治療費用損失達128 美元/頭·年[2]，給牧場帶來巨大的經濟損失。奶牛乳房炎在全世界的發病率較高，如北馬其頓共和國高產奶牛乳房炎發病率達到68.6%[3]，孟加拉乳房炎發病率達43.9%[4]。

目前，引發奶牛乳房炎的病原菌主要分為環境型病原菌和傳染型病原菌[5]。環境型病原菌是指由于奶牛居住環境差而產生的病菌，是引起臨床乳房炎的主要病原菌，主要為桿菌和鏈球菌類[6]。傳染型病原菌是指可以在牛群之間或乳房之間廣泛傳播的病菌，主要為金黃色葡萄球菌和停乳鏈球菌[7]。

奶牛攝入營養不足、生活環境衛生差或處于高溫高濕環境時，極易由于免疫力下降而被病原菌感染，而引發乳房炎[8]。而且產奶量和乳房炎發病率呈正比[9]，高產奶牛的發病率遠高于普通奶牛。

除了提高營養和改善奶牛飼養環境外，機體增強免疫力是降低乳房炎發病率、維持奶牛機體健康水平，增強生產性能的重要措施。其中天然免疫是機體免疫屏障的第1道防線，主要包括對病原菌的識別，早期細胞因子的合成，補體的產生及自噬的發生[10]。因此，增強天然免疫基因的篩選，有助于從分子水平上改善奶牛免疫力，抑制乳房炎發病率，降低牧場的經濟損失。

1 奶牛乳房天然免疫系統的構成

奶牛乳房的天然免疫系統主要由皮膚組織、乳頭管、體液和免疫細胞構成[11]。皮膚組織對防御外界病原菌直接入侵體內起主要作用。乳頭管在非擠奶期和奶量較少時都關閉，形成將病原菌隔離在外的物理屏障。體液中能發揮免疫功效的分子主要為補體、溶菌酶、乳鐵蛋白、抗體和轉鐵蛋白等；細胞則主要為巨噬細胞、嗜中性粒細胞、自然殺傷細胞、乳腺上皮細胞和樹突細胞等[12]。奶牛乳房部位受到病原菌入侵感染時，巨噬細胞和乳腺上皮細胞部位的模式識別受體（TLR和CD14等）會接收到病原菌的特征信號，從而激活體內的NF-κB或AP-1信號通路，產生相應的炎癥因子和趨化因子。其中炎癥因子IL-1β和TNF-α等會將體內的炎癥信號加大，加劇炎癥反應。而趨化因子則起到“定位”作用，促使更多白細胞尤其是中性粒細胞進入感染部位，殺死入侵的病原菌[13]。病原菌不同，引起的免疫反應強度存在差異。通常革蘭氏陰性細菌會引起較強的免疫反應，導致明顯的臨床癥狀，而機體免疫反應也較迅速，能及時處理病原菌后恢復正常狀態；革蘭氏陽性細菌引起的免疫反應較弱，持續時間久，機體無法將這類病原菌很快清除干凈，可引起乳房部位持續炎癥，造成較大危害[14]。

2 奶牛抗病相關基因

近年來，為了提高產奶量，通過分子選育技術對高產奶牛進行基因篩選的研究較多，但對增強奶牛抗病能力基因的研究較少，仍處于起步階段。根據分子生物學實驗和流行病學調查，不同品種的奶牛對結核桿菌和布魯氏桿菌的抵抗能力存在基因水平上的差異[15，16]，其中瑞士褐牛比荷斯坦牛巨噬細胞的活性氮自由基合成能力更強，對沙門氏菌的吞噬清除能力更強[17]，為通過分子選育，降低奶牛乳房炎患病率提供了依據。除了將抗菌能力作為篩選基因的檢測指標外，牛奶中體細胞數也能夠體現出乳房炎的嚴重程度，研究者通常會將體細胞數的變化作為篩選抗病基因的一項重要指標[18]。目前研究發現能影響奶牛機體免疫力的候選基因主要為以下幾種。

2.1 模式識別受體基因

模式識別受體（Pattern Recognition Receptor，PRR）是奶牛機體內感應外來病原菌入侵的重要受體[19]。特別是肽聚糖識別蛋白和溶菌酶家族是兩種特別重要的PRR，能對病原菌中的肽聚糖進行特異性識別，從而在防御和抵抗病原菌入侵等方面起重要作用[20]。王洪亮[21]利用基因組DNA擴增肽聚糖識別蛋白基因序列，并檢測序列中的多態位點，發現調控肽聚糖識別蛋白的PGLYRP1基因表達后，對金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌有較好的抑制作用。Gao等[22]通過高通量測序發現，通過調節H與溶酶體表達的HSPA8基因的表達能夠降低乳房炎的炎癥。此外，Toll樣受體也是PRR家族中和免疫相關的重要靶點。Russell等[23]在TLR1基因上發現1 個與奶牛臨床乳房炎顯著相關的SNP位點，且通過細胞試驗發現，不同基因型奶牛產的牛奶中體細胞表面的TLR1受體的表達量存在差異，其中CG基因型奶牛的表達量顯著低于其他基因型的奶牛。不僅如此，Sharma等[24]也在TLR4上發現3 個與奶牛體細胞數顯著關聯的SNP位點。劉娟[25]發現TLR1基因的G1498A位點與奶牛的乳脂率、體細胞數和乳房炎發病率顯著相關。CD14是存在于白細胞表面的PRR，能識別外來病原菌的表面抗原脂多糖。有研究發現，CD14的SNP基因型1908AG外顯子上一個錯義突變就能改變CD14受體在嗜中性粒細胞的表達量，從而增強對病原菌的識別和滅殺作用，這說明CD14可能是影響奶牛免疫力的候選基因之一[26]。CARD15（NOD2）也是胞內的PRR，參與機體的炎癥反應，研究發現，牛CARD15編碼區的3020堿基發生錯義突變后對體細胞數具有較大影響，因此也被認為是乳房炎的候選基因之一[27]。

2.2 趨化因子及其受體基因

趨化因子是一種具有誘導免疫細胞進行定向趨化能力的細胞因子，能夠調節免疫反應。奶牛被病原菌入侵后，白細胞能通過表面的受體CXCR1和CXCR2基因識別感染部位釋放的趨化因子——白介素-8（IL-8），引導自身向受感染部位移動，吞噬并殺死病原菌[28]。其中關于CXCR1基因的研究最多。CXCR1基因的+777位點的錯義突變會導致谷氨酰胺和組氨酸之間發生替換，而該位點與荷斯坦牛的臨床乳房炎和亞臨床乳房炎密切相關[29]。該基因的-1768位點與泌乳期奶牛的體細胞數顯著關聯[30]；+735位點與臨床乳房炎的發病顯著關聯[31]；+777位點與中國荷斯坦牛的體細胞數顯著相關，可作為奶牛亞臨床乳房炎抗性基因的分子輔助標記[32]。張亞琴[33]通過研究中國荷斯坦牛的CXCR1和IL-8兩個基因多個突變位點多態性與乳房炎易感性的交互作用，發現CXCR1基因的-1830位點、-1768位點和IL-8的2789/2862位點的三者交互模型為奶牛乳房炎易感性相關的最佳選擇模型。

2.3 炎癥因子及其受體基因

奶牛乳房炎常伴隨長時間炎癥，因此，炎癥細胞因子及其受體基因也是影響乳房炎的重要因素，如TNF-α和IL-1β等炎癥因子能放大炎癥信號，增強機體的免疫應答反應[34]。Verschoor等[35]在奶牛的IL-10及其受體IL-10Rα基因上分別發現10 個和6個相關基因位點，其中IL-10Rα上的SNP1185C＞T位點與奶牛的體細胞數密切相關。Skelding等[36]對IL-12的IL12RB1/B2和IL-23受體基因的啟動子和外顯子區測序，發現與乳房炎相關的10 個SNP位點。楊宇澤等[37]發現，牛整合素（ITGB2）基因的389C＞T位點的基因型與乳脂肪率、乳蛋白率和乳房炎相關，其中ITGB2基因389位點和774位點的TTCC的復合基因型可用于中國荷斯坦牛乳房炎抗性和乳品質的潛在分子標記。Günther等[38]發現，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎，都能刺激乳房上皮細胞產生趨化因子，但在介導的炎癥反應過程中，大腸桿菌通過上調TNF-α和IL-1β的表達來產生快速炎癥，而金黃色葡萄球菌通過IL-6的生成來誘導炎癥反應。

2.4 抗菌肽相關基因

抗菌肽是一種能直接殺死病原菌的活性多肽，在奶牛機體中，能表達產生抗菌肽的相關基因對降低奶牛乳房炎的患病率具有重要作用[39]。其中乳鐵蛋白基因啟動子和編碼區域序列呈高度多態性，具有較好應用前景，是潛在乳房炎的相關候選基因。李宏濱[40]通過基因組學分析對照β-防御素、AHCY（S-腺苷高半胱氨酸水解酶編碼基因）和MPIF-1（骨髓細胞前體抑制因子 1 基因）3 種基因與奶牛乳房炎癥的關聯性，經過3D結構分析發現，β-防御素是一種存在于乳房上皮細胞表面、具有微生物菌落抗性的活性抗菌肽。王靜[41]通過重疊延伸PCR克隆了重組LAP-CATHL2抗菌肽，發現其對由大腸桿菌和金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎具有良好的治療作用。李云龍等[42]針對奶牛溶菌酶的多態性和乳房炎的相關性進行研究，檢測420 頭奶牛的溶菌酶基因，發現其外顯子的115位點上存在突變，且該位點與體細胞數和305 天產奶量具有較大的關聯，可用于奶牛乳房炎抗性和產奶量的分子標記。

2.5 其他相關基因

閆濤濤等[43]發現，乳房炎奶牛干擾素調節因子5（IRF5）的表達量比正常奶牛顯著上升，可能是通過與白細胞介素-1受體相關激酶、組蛋白乙酰轉移酶p300、C-C基序趨化因子4等蛋白相互作用，調節炎癥的發生概率。吳培等[32]對奶牛亞臨床乳房炎抗性的多種基因進行體細胞數的關聯性分析，結果發現，SPP1的-1301位點、CXCR1的+777位點、NOD2c.4500位點與中國荷斯坦牛體細胞數顯著相關，可作為奶牛亞臨床乳房炎抗性基因的分子輔助標記。種麗偉[44]利用基因組、轉錄組水平鑒定，驗證奶牛乳房炎抗性的相關基因，發現6 個新疆褐牛乳房炎抗性相關基因ZRANB3、PIAS1、ACTR3、LPCAT2、MGAT5、SLC37A2。

3 總結

總之，目前與奶牛天然免疫相關的基因較多，研究的也較為廣泛，因此篩選對乳房炎抗性較強的基因，對奶牛進行定向培育、分子育種，在遺傳上降低乳房炎發病率，對促進奶牛的高效健康育種具有重要意義。此外，天然免疫對改善奶牛繁殖及泌乳性能也具有重要影響，這是因為天然免疫不存在特異性，篩選天然免疫基因過程也可能對奶牛機體的乳腺及繁殖系統起良好調節作用。目前對奶牛相關天然免疫研究仍存在不足，可繼續借助基因多態性、疾病性狀的關聯分析，進一步探尋可能影響奶牛天然免疫力的候選基因和標記分子，助力分子育種。