組織蛋白酶在糖尿病及糖尿病腎病作用機制中的研究進展

李明嘉 趙苗妙 楊金奎*

(1. 首都醫科大學附屬北京同仁醫院內分泌科,北京 102600;2. 北京市糖尿病研究所,北京 100730)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是內分泌系統的一種代謝紊亂疾病,由內源性胰島素水平缺乏或活性不足引起。隨著生活水平的提高及全球老齡化,DM患病率越來越高,成為各國主要的健康負擔。據統計,2019年全球約有4.63億DM患者,達到了9.3%的全球患病率,預計到2045年,這一數字將增加到7.002億[1]。我國DM患病率也從2013年的10.9%增長到2018年的12.4%,遠高于全球估計值(8.3%)[2]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是DM患者常見的慢性微血管并發癥,已成為全球慢性腎疾病(chronic kidney disease, CKD)的首要病因[3]。2017年全球有6.97億CKD患者[4],其中DN是CKD的最常見病因。目前對于DN的治療主要還是應用血管緊張素轉換酶抑制劑、鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2抑制劑來降低腎小球內壓、減少蛋白尿、保護腎功能,缺乏針對發病機制的特異性療法。

值得注意的是,組織蛋白酶(cathepsin,CTS)與DM的發病密切相關,并參與了DM及其并發癥的發生發展。研究[5]表明,缺乏組織蛋白酶S(cathepsin S, CTSS)的非肥胖糖尿病(non obese diabetes, NOD)小鼠、缺乏組織蛋白酶B(cathepsin B, CTSB)的NOD小鼠以及缺乏組織蛋白酶L(cathepsin L, CTSL)的NOD小鼠中DM發病率分別為33%、28%、0%,而野生型NOD小鼠的DM發病率為69%,差異有統計學意義。Garsen等[6]證明了缺乏CTSL的小鼠與野生型小鼠相比,前者沒有出現蛋白尿、系膜基質擴張、小管間質纖維化,顯示出了正常腎功能。在一項研究隊列包括1 270名參與者,平均隨訪8年的Meta分析[7]中,尿中組織蛋白酶D(cathepsin D, CTSD)含量與1型糖尿病中估算腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate, eGFR)快速下降相關,并反映腎小管間質損傷。以上證據都提示了多種組織蛋白酶參與到DM及DN的發病與進展過程。

本課題組前期致力于研究CTSL的作用與機制,前期工作利用冷凍電鏡與臨床患者血清揭示了CTSL在新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)感染中的重要作用及機制[8],并通過機器學習的方法篩選出多種CTSL抑制劑[9],證實了CTSL在感染性疾病中所發揮的重要作用。本文將對CTSB、CTSD、CTSL與CTSS,這幾個研究較為廣泛的分子在非感染性代謝性疾病中發揮的重要作用進行討論,系統性回顧它們在DM及DN中的作用及機制。

1 CTS家族蛋白

一個健康生物體的維持很大程度上依賴于蛋白質的合成、成熟、執行功能和最終分解。為了完成上述過程,人類基因組編碼了550多種蛋白酶和200多種內源性蛋白酶抑制劑[10],CTS就是其中的一個龐大家族。到目前為止,在人類中已發現了15類CTS,主要包括了CTS A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、O、S、V、W、Z,根據其蛋白水解機制又可分為絲氨酸蛋白酶(CTSA、CTSG)、天冬氨酸蛋白酶(CTSD、CTSE)、半胱氨酸蛋白酶(CTSB、CTSC、CTSF、CTSH、CTSK、CTSL、CTSO、CTSS、CTSV、CTSW、CTSZ)[11],其中半胱氨酸組織蛋白酶占據了組織蛋白酶家族的主要部分(圖1)。

一般來說,CTS家族成員在酸性細胞器中,即在溶酶體和核內體中是穩定的,并能夠高效地裂解各種底物,執行其功能。CTSB可以促進淀粉樣斑塊形成、降解基質從而促進病毒等進入細胞,主要與腫瘤的侵襲和轉移、胰腺炎、阿爾茨海默病、呼吸道炎癥性疾病、肝纖維化等疾病有關[12]。CTSD可以促進侵襲、裂解細胞外基質蛋白,主要與乳腺癌、阿爾茨海默病、神經元蠟樣脂褐質沉積癥等疾病有關[13]。CTSL可以降解基質、促進病毒入侵細胞,主要與腫瘤的侵襲和轉移、牙齦增生等疾病有關[14-15]。CTSS可以提呈抗原、重塑結締組織和基底膜,主要與Ⅳ型星形細胞瘤、動脈粥樣硬化等疾病相關[16]。

雖然CTS普遍分布于哺乳動物細胞,但它們在組織和器官中表達水平不同,一些CTS如B、L普遍表達,而F、K、S等在細胞和組織中的分布是有限的[17]。

2 CTSB、CTSD、CTSL、CTSS在DM中的作用

CTS與DM的相關關系已得到驗證。Huang等[18]通過實驗發現肌肉CTSL基因在DM易感小鼠中表達增加,并與糖耐量有關。Chen等[19]發現在超重和肥胖的中國成人中,循環中CTSS濃度升高與代謝綜合征密切相關。Ding等[20]分別收集了男性2型糖尿病患者及年齡匹配的健康男性人群的血漿樣本,發現患者群體中血漿CTSD活性而非濃度增加,此外CTSD活性還與2型糖尿病的代謝參數顯著相關(糖化血紅蛋白、胰島素抵抗指數和血糖),所以這些數據都指向血漿CTSD作為男性2型糖尿病的代謝調節因子。此外,Ding等[21]還在一項臨床試驗中證明了血漿CTSD活性與肝胰島素敏感性呈負相關,以往認為“高胰島素-正糖鉗夾”是評估外周和肝胰島素敏感性的金標準,由此提出血漿CTSD活性檢測可能被用作人類肝胰島素敏感性的非侵入性檢查指標。一項前瞻性隊列研究[22]顯示較高的CTSS與胰島素敏感性降低相關、與較高的DM發病風險相關,所以CTSS活性可能參與早期葡萄糖和胰島素代謝異常。有研究者[23]利用蛋白質組學和基因分型數據找到了29種DM的生物標志物,其中就包括CTSD,另外一項蛋白質組學研究量化了1型糖尿病患者與其健康兄弟姐妹之間的尿液中低豐度蛋白質的差異,發現CTSB在二者中發生變化,并參與炎癥和代謝過程[24]。這對于預測、診斷DM具有臨床指導意義。

2.1 CTSB、CTSD、CTSL介導自身免疫反應導致1型糖尿病

早在2005年,Maehr等[25]的研究結果就已經表明CTSL活性對NOD小鼠1型糖尿病的發生至關重要。1型糖尿病是一種自身免疫性疾病,人和小鼠的主要組織相容性復合體Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ, MHC Ⅱ)類區域是其關鍵易感位點,CTS生成肽,由Ⅱ類MHC分子提呈給CD4+T細胞進而引發免疫反應[26]。CTSL缺失對小鼠提供了保護作用,CTSL缺失小鼠與野生型小鼠相比,調節性T細胞比例增加,所以認為調節性T細胞與侵略性CD4+T細胞之間的失衡提供了保護作用。CT4+T細胞肽表位驅動自身免疫性疾病的鑒定一直非常困難,最近Reed等[27]提出1型糖尿病的發生與MHCⅡ類分子所呈現的肽表位相關,一些肽表位通過分泌顆粒蛋白的不同肽片段融合拼湊在一起,創建了一種新的嵌合表位。這些表位是由CTSL 消化適當的無活性顆粒蛋白片段產生的。Serpin B13是一種在胰腺上皮中表達的CTSL抑制劑。在體內外抑制Serpin B13,可通過Notch1使Ngn3+內分泌祖細胞的數量增加,并增強了向β細胞的轉化。抗Serpin B13抗體可刺激胰腺中Ngn3+內分泌祖細胞的形成,并使兒童1型糖尿病進展延遲[28]。混合胰島素肽通過胰島素原片段與其他肽段之間的肽鍵在胰腺β細胞中形成,并且可以被1型糖尿病患者的CD4+T細胞以及NOD小鼠的致病性CD4+T細胞靶向。通過蛋白質組學分析,Crawford等[29]確定了CTSD、CTSL分別是驅動疾病中混合胰島素肽特異性形成、水解的主要蛋白酶。敲除CTSB可下調自身反應性CD4+T細胞對胰腺β細胞的侵襲性,胰島周圍細胞浸潤減少[30]。

2.2 CTSB、CTSL、CTSS通過多種機制導致2型糖尿病

Yang等[31]發現2型糖尿病患者循環CTSL濃度升高,并且CTSL通過降解基質纖維連接蛋白、胰島素受體(insulin receptor, IR)和胰島素樣生長因子-1受體(insulin-like growth factor-1 receptor, IGF-1R)參與了2型糖尿病的發病機制,提示CTSL可作為治療靶點。Urbich等[32]指出高糖顯著降低了CTSL的蛋白表達和活性,而內皮祖細胞侵入缺血組織需要CTSL將基質降解,所以這限制了內皮祖細胞改善DM新生血管的能力。2014年Lafarge等[33]發現了CTSS基因敲除鼠相較于對照組血糖顯著改善,通過研究發現CTSS敲除可減少肝葡萄糖生成,可能有助于改善葡萄糖耐量,但對胰島素敏感性沒有明顯影響。最近,日本學者[34]提出CTSS通過抑制肝細胞肝糖輸出來改善糖代謝,并且可誘導胰高血糖素樣肽-1 (glucagon like peptide-1,GLP-1)分泌,循環中的CTSS有助于改善小鼠糖代謝。由此可見有一些機制尚未得到公認,有的甚至相反。CTSB可能是通過炎癥和細胞凋亡參與DM的發病過程,在敲除CTSB后,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)誘導的細胞凋亡減輕[35]。

3 CTSB、CTSD、CTSL、CTSS在DN中的作用

3.1 CTSL介導腎小球濾過屏障損傷

DN早期表現為微量白蛋白尿,隨著疾病的進展表現為持續性白蛋白尿,這提示腎小球濾過屏障受損。足細胞附著在腎小球濾過屏障的外層,是維持腎小球濾過屏障完整性的主要成分[36]。由于它們是終末分化細胞,在體內沒有增殖能力,因此足細胞的損傷和丟失在DN進展過程中發揮重要作用[37]。CTSL可降解維持足突正常結構的蛋白,如突觸蛋白(synaptopodin)[38]、動力蛋白(dynamin)[39],進而介導蛋白尿表型。環孢素A可通過阻斷CTSL介導的足細胞突觸蛋白降解來預防蛋白尿[10]。

3.2 CTSB促進近端小管重吸收蛋白質的降解

在DM患者中,近端小管暴露于大量的營養物質中,易發生營養超載,進而導致腎小管肥大、損傷[40],CTSB在內皮細胞和腎小管近端高表達[41]。然而在DM早期,腎小管細胞因CTSB活性降低而導致蛋白分解降低。此外,CTSB被證明參與尿調素肽的形成[42],它們具有腎特異性并表現出促炎活性,在DN早期變化中可能發揮作用;在病變晚期,白蛋白發生結構變化,可抑制CTSB功能,導致溶酶體功能障礙并進一步造成損傷[43]。研究[44]表明經腎小球濾過后的CTSB可被低密度脂蛋白受體相關蛋白1和巨蛋白(megalin)捕獲,隨后內化入細胞,并通過M6P通路進入溶酶體,繼續發揮蛋白水解功能。

3.3 CTSB、CTSS介導基質蛋白降解和內皮損傷

CTSB有助于DM腎組織中纖連蛋白(fibronectin)的降解從而緩解病理改變[45]。CTSS是單核-巨噬細胞來源的循環中蛋白酶激活受體-2(protease-activated receptor-2, PAR-2)激動劑,與DM微血管并發癥相關。其致病機制主要是通過內皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)表達下調、內皮對白蛋白的通透性增加所致[46-47]。

3.4 CTSL創造慢性炎癥微環境

CTSL可以激活乙酰肝素酶(heparanase),裂解硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS),硫酸乙酰肝素在基底膜和各種細胞表面豐富表達,并作為多種生物活性分子的協同受體發揮作用[6]。既往,人們認為乙酰肝素酶通過降解腎小球基底膜上的HS導致DN,但越來越多的數據[48]表明乙酰肝素酶的激活形成了一個慢性炎癥微環境,保護了巨噬細胞的異常激活、 防止炎癥消退,通過Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)途徑來激活巨噬細胞,隨后NF-κB通路被激活,促進了TNF-α的表達,由此介導了炎癥反應、腎損傷。

3.5 CTSD、CTSL促進晚期糖基化終產物的降解

晚期糖基化終產物(advanced glycation end products, AGEs)是還原糖和活性醛與蛋白質、脂類和核酸發生非酶促反應的最終產物,在DM中有所積累。AGEs通過與受體結合或被炎癥細胞內化產生活性氧(reactive oxygen species, ROS),同時誘導細胞因子的釋放,促進炎癥反應。Grimm等[49]的研究表明,施加AGEs刺激后,細胞中溶酶體數量增多、溶酶體蛋白酶活性增強,CTSD mRNA水平增高、成熟體增多;CTSL mRNA不變、成熟體增多。因此CTSD、CTSL可降低AGEs的毒性。

4 抑制CTS的小分子藥物的研究現狀

鑒于CTS在疾病中所發揮的巨大作用,開發CTS抑制劑一直都是研究的熱點。近年來,新藥的開發雖然取得了一些進展,但仍存在一些缺陷:①治療劑量的CTS抑制劑對細胞有毒性作用;②廣譜的CTS抑制劑可能會導致其他不良反應;③可能存在生物利用度低的問題[50]。下面對本文中重點介紹的幾種CTS抑制劑研發現狀進行介紹。

目前臨床應用的CTSS抑制劑是來自羅氏公司的Compound RO5459072[51],它基于原有的化合物結構進行改造,增加了藥物的體內穩定性和代謝參數,該藥物已在乳糜瀉、干燥綜合征等自身免疫性疾病的臨床試驗中進行測試[52]。通過口服RO5461111(也是一種CTSS抑制劑)兩個月,治療組2型糖尿病db/db小鼠中蛋白尿較對照組減少了60%,治療期間產生的穩定血漿濃度為400～600 ng/mL[53]。Kwork等[54]揭示了一種完全人源化的抗CTSS抗體Fsn0503 h,介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC),也是抑制CTSS的一種候選藥物。

目前已知的天冬氨酸蛋白酶抑制劑是來自放線菌的蛋白酶抑素A,但由于其非特異性,可能會引起不良反應,然而在哺乳動物中還沒有已知的CTSD內源性抑制劑[55]。中藥的某些有效成分已被證明可下調CTSD的表達[56],黃酮類化合物水合桑葚苷、番石榴等成分可抗氧化、抗炎癥,最近已被證明可以抑制慢性腎損傷小鼠腎中的CTSD[57]。最近,以蛋白酶抑素A為基礎設計出了一種大環擬肽類抑制劑,與蛋白酶抑素A相比,它們在納摩爾范圍內抑制CTSD,而沒有毒性[58]。另外,還通過機器學習的方法篩選出許多種候選化合物,但缺乏體內外驗證的數據。

CTSB抑制劑作為潛在的抗癌和抗轉移劑曾一度受到追捧,但至今仍未開發出共價可逆特異性的抑制劑。目前文獻[59-60]中常用到的CTSB抑制劑為CA-074/CA-074Me,半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)為2～5 nmol/L。有學者[50]提出了新型CTSB抑制劑,不過與CA-074/CA-074Me相比,還相差甚遠(IC50分別為:<1 μmol/L、8～125 nmol/L)。

和CTSB一樣,目前缺乏特異性針對CTSL的抑制劑,到目前為止還沒有用于臨床的CTSL抑制劑。本課題組從小分子文庫、天然化合物中篩選CTSL抑制劑,并通過結構優化、分子改造(引入腈基)來提高候選分子的活性、選擇性和可逆性。不過這些分子的藥代動力學、藥物效應學還不夠完善,有待于進一步驗證。

隨著對致病機制的深入了解,將會有越來越多的CTS抑制劑進入臨床試驗。這將為治療DM、DN,甚至其他疾病提供新的思路。

5 結語

本文重點回顧了CTSB、CTSD、CTSL、CTSS與DM及DN的關系及其背后的作用機制。CTSB、CTSD、CTSL、CTSS有可能作為預測、診斷和治療疾病的重要分子。盡管目前的研究已取得可喜的進展,但關于組織蛋白酶致病機制及藥物開發方面的研究還有巨大的空間。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明李明嘉:提出研究思路,撰寫論文;趙苗妙:提出研究思路,撰寫論文;楊金奎:提出研究思路,論文總體把關、審定。