吳亞鋒 王楠楠 徐瀠 金承玲 方蘋



摘 要: 為調查2021年江蘇省河蟹源氣單胞菌屬細菌的流行規律及特征,在江蘇省泗洪、吳中、相城等20個縣(市、區)采集河蟹樣品進行氣單胞菌的分離培養,采用16S rRNA基因特異性引物PCR擴增測序法進行種屬鑒定,并進行體外藥敏試驗。結果顯示,從河蟹的肝胰臟、鰓絲、腸道樣品中共分離鑒定出氣單胞菌182株,其中維氏氣單胞菌的數量最多,占比最大(64%)。體外藥敏結果表明,河蟹源氣單胞菌分離株對恩諾沙星的耐藥率最低,僅為4.95%,敏感率最高(86.81%)。比較2019-2021年耐藥性數據,發現河蟹源氣單胞菌近3年來對恩諾沙星的耐藥率始終保持在較低水平;與江蘇省水產養殖中其他4個代表性品種日本沼蝦、鯽、草魚、克氏原螯蝦相比,河蟹源氣單胞菌的耐藥性總體情況良好,耐藥程度相對較低。研究結果可為該地區河蟹源氣單胞菌引起的細菌性疾病的防治提供一定的用藥依據。
關鍵詞: 江蘇省;河蟹;氣單胞菌;分離鑒定;耐藥情況
中圖分類號: S 917.1 ???文獻標志碼: A ???文章編號: 0253-2301(2023)05-0008-07
DOI: ?10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.05.002
Analysis of the Situation of Drug Resistance of ?Aeromonas ?from River Crabs in Jiangsu Province in 2021
WU Ya-feng 1, WANG Nan-nan 2, XU Ying 2, JIN Cheng-ling 3, FANG Ping ?1*
(1. Jiangsu Center for Control and Prevention of Aquatic Animal Disease, Nanjing, Jiangsu 210036, China;
2. College of Animal Science and Food Engineering, Jingling Institute of Technology, Nanjing, Jiangsu 210038, China;
3. Nanjing Jiangning District Aquatic Technology Promotion Station, Nanjing, Jiangsu 211100, China)
Abstract: ?In order to investigate the prevalent rules and characteristics of ?Aeromonas ?bacteria from river crabs in Jiangsu Province, the samples of river crabs were collected from the 20 counties (cities, districts) in Jiangsu Province, such as Sihong, Wuzhong and Xiangcheng, etc., for the isolation and cultivation of ?Aeromonas . The genus identification was conducted by using the PCR-amplified sequencing method of 16 S rRNA gene-specific primers, and the in vitro chemosensitivity test was also carried out. The results showed that a total of ?182 ?strains of ?Aeromonas ?were isolated and identified from hepatopancreas, gill filaments and intestinal samples of river crabs, among which ?Aeromonas veronii ?accounted for the largest proportion (64%). The results of in vitro chemosensitivity test showed that the ?isolated ?strains of ?Aeromonas ?from river crabs had the lowest resistance rate to enrofloxacin, only ?4.95%, ?while the sensitivity rate was the highest (86.81%). By comparing the data of drug resistance from 2019 to 2021, it was found that the resistance rate of ?Aeromonas ?from river crabs to enrofloxacin has remained at a relatively low level in the past three years. Compared with the other four representative species such as ?Macrobrachium nipponense, Carassius ?auratus , Ctenopharyngodon idella ?and ?Procambarus shrimp ?in the aquaculture in Jiangsu Province, the overall conditions of the drug resistance of ?Aeromonas ?from river crabs was generally good, and the degree of drug resistance was relatively low. The research results could provide a certain basis for the prevention and treatment of bacterial diseases caused by ?Aeromonas ?from river crabs in the region.
Key words: ?Jiangsu Province; River crab; ?Aeromonas ; Isolation and identification; Situation of drug resistance
江蘇省擁有豐富的海洋和淡水資源,是中國重要的水產養殖基地。中華絨螯蟹,簡稱河蟹,是一種生活在河道、湖泊、池沼等淤泥河畔的大型甲殼類動物,擁有適溫性廣、餌料資源豐富、生長快速、養殖周期短、經濟效益高等優點 ?[1] 。河蟹養殖是江蘇省漁業中最具有特色以及影響力的產業之一 ?[2] 。全省養殖總面積達到26.67萬hm 2,年產量約35萬t,年產值超過了300億元,均占全國總量的50%左右。然而,近年來逐漸增多的河蟹細菌性疾病給江蘇省水產養殖業帶來了巨大的損失。2019年劉肖漢等 ?[3] 在江蘇省河蟹疫區進行測報,平均發病率為2.31%,死亡率為3.35%。
氣單胞屬細菌 Aeromonas 是一類條件致病菌,是我國水產養殖產業中細菌性傳染病的主要病原體之一 ?[4] 。由該屬細菌所造成的疾病類型復雜,并可透過水生動物、水產品傳染人畜,造成人畜腹瀉、食物中毒,危害人體健康 ?[5-6] 。2015年曹海鵬等 ?[7] 從患病中華絨螯蟹體內分離出1株病原菌,分析結果表明該菌為點狀產氣單胞菌。2022年周麗穎等 ?[8] 從患病華絨螯蟹肝臟和胰腺中分離出1株優勢生長菌,分析結果為豚鼠氣單胞菌。朱成科等 ?[9] 從瀕死鯽魚的內臟中分離出1株維氏氣單胞菌,經動物致病性試驗檢測發現該菌具有極強的致病力。
氣單胞菌廣泛存在于各個生態系統,如土壤、河水、海水等。除了引起水產動物感染之外,也被報道能夠感染人類,引起胃腸炎、敗血癥和傷口感染等 ?[10] 。對感染氣單胞菌水生動物的治療,目前多以口服抗生素為主,但大量應用抗生素容易引起抗藥性,同時水生動物體內的抗生素殘留也成為一種食品安全隱患。目前,國內對于氣單胞菌感染疾病的防治仍缺乏科學合理的藥物防治指導,給水產養殖產業的健康發展帶來了困難。若不能及時、有效地防治該病,將會對水生動物的健康造成極大的危害。為調查江蘇省河蟹源氣單胞菌的流行規律及特征,本研究于2021年在江蘇省泗洪、吳中、相城、銅山、昆山等20個縣(市、區)采集河蟹樣品進行氣單胞菌的分離培養,并進行體外藥敏試驗,以分析河蟹源氣單胞菌分離株的耐藥情況,指導養殖戶科學規范用藥。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
在江蘇省泗洪、吳中、相城、銅山、昆山等20個縣(市、區)采集河蟹發病樣品,采樣部位包括腮、肝胰腺、腸道等。
1.2 主要試劑
細菌基因組提取試劑盒、2× Taq ?Master Mix(Dye Plus)購于諾唯贊生物科技股份有限公司;腦心浸液肉湯BHI(Brain Heart Iusion)購自英國Oxoid公司,LB瓊脂平板、RS瓊脂平板、BHI液體培養基均為自行配制。硫酸新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、甲砜霉素、鹽酸環丙沙星、紅霉素、鹽酸土霉素和鹽酸多西環素等8種抗菌素藥物標準品購自南京鼎思生物技術有限公司。
1.3 試驗方法
1.3.1 河蟹樣品中菌株的分離純化 ??對河蟹發病部位進行無菌處理,無菌蘸取腮、肝胰腺、腸道等病料,于LB固體培養基上劃線接種,將平皿倒置放入37℃溫箱恒溫培養16~48 h。挑取典型單菌落置于新鮮BHI液體培養基中,37℃恒溫培養16~24 h,繼續挑取單獨菌落于BHI平板上劃線,放入37℃恒溫培養16~24 h。再次挑取單個特征性菌落,進行革蘭氏染色,在光學顯微鏡下觀察菌體染色形態。同時在BHI平板上劃線分離,得到單一菌落后,放入BHI液體培養基中,37℃振蕩培養12 h,-20℃凍存。
1.3.2 分離菌株16S rRNA基因PCR擴增及序列分析 ??使用細菌基因組提取試劑盒進行分離株基因組的提取,參照說明書進行。使用細菌16S rRNA基因的測序通用引物:27 F(5′ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3′)與1492 R(5′ GGTTACCTTGTT ACGACTT 3′),引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成,大小為 1:465 ?bp,退火溫度為55℃,構建30 μL PCR體系進行PCR擴增。電泳完畢后將陽性PCR產物回收后送交生工生物工程股份有限公司(南京)進行序列測定,所得序列使用BLAST軟件進行同源性分析。
1.3.3 分離菌株對8種抗菌藥物的敏感性試驗 ??分別對上述8種水產用抗菌藥物開展耐藥性監測。采用96孔藥敏板法對河蟹源氣單胞菌分離株進行最小抑菌濃度的測定。首先使用MH培養基溶解待供試藥物,然后將其分別進行梯度稀釋。陰性、陽性對照僅加入MH培養基,其余孔均加入不同濃度的藥物和MH培養基。挑選BHI平板上的單菌落接種到適宜的液體培養基中,培養 4~6 ?h,用無菌液體培養基進行校正,使菌液調整為1.5×10 8 CFU·mL ?-1 ?。隨后用生理鹽水把上述菌懸液按1 ?∶ 100的比例稀釋后備用。將稀釋液倒入一次性無菌V形槽內,使用排槍將稀釋后菌液加入到藥敏板中,每孔200 μL,使每孔菌液的終濃度約為10 6 ?CFU·mL ?-1 ?;陰性對照孔加生理鹽水200 μL。將藥敏板置于培養箱中合適溫度下培養18~24 h后觀察。經過肉眼觀察證實無細菌生長孔中的最低藥物濃度,即為該抗菌藥物的最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration,MIC)。以大腸桿菌ATCC 25922作為質控菌株。利用SPSS軟件進行MIC ?50 、MIC ?90 (即能抑制50%或90%受試菌所需的MIC值)的統計分析。
參照2017年美國國家臨床實驗室標準委員會(CLSI)頒布的判斷標準判定細菌對抗菌藥物的感受性,經后續修改,判定標準見表1。若分離株對恩諾沙星的MIC值≥16,則認為該菌株對恩諾沙星具有耐藥性;MIC值為8,記為中介;MIC值≤4,則認為該菌株對恩諾沙星敏感。根據表1判定各分離株對8種抗菌藥物的感受性,并進行分離菌株對抗菌藥物的耐藥率、敏感率和中介率統計 分析。
1.3.4 耐藥性情況比較分析 ??根據全國水產技術推廣總站發布的《水產養殖動物主要病原菌耐藥性監測報告(2015-2020年)》 ?[11] ,統計2019、2020年江蘇省河蟹源氣單胞菌分離株的耐藥性情況,開展2019-2021年河蟹源氣單胞菌對抗菌藥物的耐藥性變化分析。根據全國水產技術推廣總站發布的《2021年全國水產養殖動物主要病原菌耐藥性監測分析報告》 ?[12] ,統計不同水生動物來源的氣單胞菌耐藥性情況,開展不同來源氣單胞菌對抗菌藥物的耐藥性差異分析。
2 結果與分析
2.1 河蟹樣品中氣單胞菌分離鑒定結果
在BHI固體培養基上,氣單胞菌分離株的菌落呈圓形、中央微凸、表面光滑、呈淡黃色(圖1);革蘭染色后鏡檢結果為紅色短桿菌,菌體兩端鈍圓。細菌分子生物學鑒定方法目前通用的是16S rRNA序列分析??[13] 。本研究對分離菌株進行16S rRNA基因擴增,結果顯示,分離株在 1:500 ?bp下方有1條目的條帶大小相一致的條帶(圖2)。將陽性PCR產物送樣測序,利用BLAST比對確定 到種。
2.2 河蟹樣品中氣單胞菌分離株種類及組成分析
本研究自江蘇省采集的河蟹樣品使用16S ?rRNA 基因進行種屬鑒定。由圖3可知,從河蟹的肝胰臟、鰓絲、腸道樣品中共分離鑒出氣單胞菌科182株,其中維氏氣單胞菌116株、嗜水氣單胞菌25株、溫和氣單胞菌18株、豚鼠氣單胞菌13株、殺鮭氣單胞菌4株、斑點氣單胞菌4株、異嗜糖氣單胞菌2株。
2.3 河蟹源氣單胞菌對抗菌藥物的MIC值分析
182株河蟹源氣單胞菌分離株對8種抗菌藥物的MIC值見表2。恩諾沙星對氣單胞菌分離株的MIC ?50 最低,為0.1 ?μg·mL ?-1 ?,其次為硫酸新霉素、氟甲喹和鹽酸多西環素,分別為0.38、0.45、0.61 ?μg·mL ?-1 ?,而對磺胺間甲氧嘧啶鈉的MIC ?50 最高,為21.64 ?μg·mL ?-1 ?;恩諾沙星對氣單胞菌分離株的MIC ?90 最低,為8.53 ?μg·mL ?-1 ?,其次為硫酸新霉素,為10.76 ?μg·mL ?-1 ?,而甲砜霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉和磺胺甲噁唑/甲氧芐啶對氣單胞菌分離株的MIC ?90 均達檢測上限。
2.4 河蟹源氣單胞菌對抗菌藥物的感受性分析
參照表1中抗菌藥物敏感性判定標準,根據表2中MIC值判定上述河蟹源氣單胞菌分離株對抗菌藥物的感受性。由圖4可知,河蟹源氣單胞菌對甲砜霉素、氟苯尼考和磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的耐藥率較高,分別為46.70%、36.26%和34.07%,最低的為恩諾沙星,僅為4.95%;對恩諾沙星的敏感率最高,為86.81%;對氟苯尼考的敏感率稍低,為55.49%,對甲砜霉素的敏感率最低,為47.80%;對鹽酸多西環素的中介率最高,達15.93%,表明具有很強的潛在耐藥性,需要警惕耐藥性的進一步提高。
2.5 2019-2021年河蟹源氣單胞菌對抗菌藥物的耐藥性變化
比較2019-2021年江蘇省河蟹源氣單胞菌對抗菌藥物的耐藥率(表3),結果顯示:3年來河蟹源氣單胞菌對恩諾沙星、甲砜霉素和磺胺甲噁唑/ 甲氧芐啶的耐藥率變化不大,其中對恩諾沙星的耐藥率始終保持在較低水平;對硫酸新霉素、氟苯尼考和鹽酸多西環素的耐藥率始終呈上升趨勢,其中對硫酸新霉素的耐藥率于2021年上升了10.27%(與2020年相比);對氟甲喹和磺胺間甲氧嘧啶鈉的耐藥率呈下降趨勢,其中對氟甲喹的耐藥率下降最多,3年總共下降了64.73%。
2.6 不同來源氣單胞菌對抗菌藥物的耐藥性差異
根據《2021年全國水產養殖動物主要病原菌耐藥性監測分析報告》,江蘇省不同來源氣單胞菌分離株對8種抗菌藥物呈現不同程度的耐藥性(圖5)。其中,河蟹源氣單胞菌對硫酸新霉素和磺胺類藥物的耐藥性最低,對氟苯尼考、鹽酸多西環素和氟甲喹的耐藥性也不高,而對恩諾沙星和甲砜霉素表現出較高的耐藥性。從總體耐藥性情況來看:日本沼蝦>鯽>草魚>克氏原螯蝦>河蟹。在江蘇省水產養殖中有代表性的5個水產品中,河蟹源氣單胞菌的耐藥性總體情況良好,耐藥程度相對較低。
3 討論與結論
氣單胞菌是常見的水產致病菌,廣泛存在于養殖水體中,對環境具有較強的適應能力 ?[14] 。該菌可感染多種水生動物引起暴發性傳染性疾病,對水產養殖業的發展構成嚴重的威脅。由氣單胞菌所引起的感染在感染性疾病中居于重要位置,尤其是對免疫力低下的水生動物影響十分明顯,如常見的水生動物蝦蟹、青魚、泥鰍、鯽魚等 ?[15-18] 。本研究自江蘇省某市采集河蟹樣品,從河蟹的肝胰臟、鰓絲、腸道樣品中共分離鑒定出氣單胞菌科182株,其中維氏氣單胞菌116株,數量最多,占比最大(64%)。鄧玉婷等 ?[19] 從廣東的4個城市16個養殖戶采集樣品,分離出 1:143 株病原菌,鑒定出8種氣單胞菌,其中維氏氣單胞菌的占比也最大(60.28%)。徐先棟等 ?[20] 在山塘、池塘、魚菜共生塘的水體與底泥中分離出氣單胞菌,通過16S ?rDNA 鑒定,分離出細菌54株,其中氣單胞菌23株,維氏氣單胞菌株數最多,為12株。與本研究所得結果相比,盡管不在同一個地區,但這些數據均體現出維氏氣單胞菌在養殖漁場中存在較多。在氣單胞菌屬細菌中,維氏氣單胞菌是養殖漁場中魚蝦等水產動物常見的易感病原。周慧華等 ?[21] 對分離自河蟹的維氏氣單胞菌的研究表明,該菌對河蟹具有較強的致病性。其次為嗜水氣單胞菌(25株)和溫和氣單胞菌(18株),分別占14%和10%,其他還有豚鼠氣單胞菌(7%)、殺鮭氣單胞菌(2%)、斑點氣單胞菌(2%)、異嗜糖氣單胞菌(1%)。
趙賢亮等 ?[22] 研究表明,由于養殖中抗生素的濫用或錯用問題,致使水產動物致病菌包括氣單胞菌的耐藥現象越來越嚴重。汪永祿等 ?[23] 對馬鞍山地區66株環境源氣單胞菌進行藥敏試驗,發現對環丙沙星的敏感率高達100%;為了防止過度使用抗生素,應進行耐藥性監測。而MIC值能更準確、更全面地反映抗生素感受性結果,因此在監測耐藥性時,同時要將MIC值作為監測數據。藥敏試驗結果表明河蟹源氣單胞菌分離株對8種抗菌藥物呈現出不同程度的耐藥性。其中,河蟹源氣單胞菌對甲砜霉素、氟苯尼考和磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的耐藥率較高,而對恩諾沙星的耐藥率最低。因此,河蟹源氣單胞菌分離株對恩諾沙星的敏感性最高。
比較2019-2021年河蟹源氣單胞菌對抗菌藥物的耐藥率可知,氣單胞菌分離株對恩諾沙星的耐藥率始終保持在較低水平;對硫酸新霉素、氟苯尼考和鹽酸多西環素的耐藥率始終呈上升趨勢。肖丹等 ?[24] 研究發現94%以上的菌株對新霉素敏感,而黃玉萍等 ?[25] 發現57株氣單胞菌對新霉素的耐藥率達到33.33%。本研究中2021年河蟹源氣單胞菌分離株對硫酸新霉素的耐藥率為14.29%。這說明不同地區、不同養殖品種、不同用藥習慣,對水生動物病原菌的耐藥性均有一定的影響。與2020年相比,2021年河蟹源氣單胞菌對硫酸新霉素的耐藥率上升了10.27 %,這提示須加強對抗生素的合理使用,以防止耐藥性的進一步上升。氣單胞菌分離株對氟甲喹和磺胺間甲氧嘧啶鈉的耐藥率呈下降趨勢,其中對氟甲喹的耐藥率下降最多,3年總共下降了64.73 %,這說明江蘇已經開始重視抗生素的使用情況,并已經初具成效。來自不同養殖品種的氣單胞菌分離株對于8種抗菌藥物具有不同程度的耐藥性,其中河蟹源氣單胞菌對對硫酸新霉素和磺胺類藥物的耐藥率最低,且在江蘇省水產養殖中有代表性的5個品種中,河蟹源氣單胞菌的耐藥性總體情況良好,耐藥程度相對較低。
建議養殖戶可選用恩諾沙星、硫酸新霉素和鹽酸多西環素進行河蟹源氣單胞菌感染的治療,但必須嚴格按照藥敏試驗結果和藥代動力學原理確定劑量和藥程。因此應加強藥敏試驗的應用,為水產養殖用藥指導,才能盡可能減少耐藥病原菌的產生并保障水產品質量安全。
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(責任編輯:陳文靜)