卵巢癌組織中miR-581、FOXO1表達與患者病理特征和預后的關系

劉麗利，丁桂春，陸紅梅，王奕芳

1 揚州市婦幼保健院生育技術科，江蘇揚州 225000；2 揚州市婦幼保健院婦產科；3 揚州市婦幼保健院病理科

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤。據2020年國際癌癥研究機構報告，全球新發卵巢癌病例31.4萬例，死亡20.7萬例，我國新發卵巢癌病例5.5萬例，死亡3.8萬例。近年來隨著人們生活方式的改變和人口老齡化的加劇，卵巢癌發病率逐年升高［1］。盡管近年來卵巢癌的診治取得一定進展，但患者預后仍較差。研究表明，微小RNA（miRNA）等非編碼RNA和細胞自噬、分化、周期異常等參與卵巢癌進展［2-3］。miR-581是一種保守miRNA。有學者報道，miR-581參與結直腸癌和食管鱗癌等惡性腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲與凋亡等過程［4-5］。叉頭框轉錄因子O1（FOXO1）是一種轉錄因子，能通過調控基因轉錄參與細胞自噬、分化、周期、凋亡等調控［6］。有學者報道，FOXO1能抑制肺腺癌和胃癌等惡性腫瘤的惡性行為［7-8］。目前，關于卵巢癌組織中miR-581、FOXO1表達及臨床意義報道不多。2017年1月—2019年10月，我們通過檢測卵巢癌組織中miR-581、FOXO1表達，探討二者與卵巢癌患者臨床病理特征和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月—2019年10月揚州市婦幼保健院收治的97例卵巢癌患者，年齡32～81（55.24 ± 8.32）歲；病理類型：漿液性癌77例、黏液性癌20例；腫瘤最大徑：≥3 cm 38例、<3 cm 59例；分化程度：低分化36例、中高分化61例；國際婦產科聯盟（FIGO）分期［9］：Ⅰ期18例、Ⅱ期20例、Ⅲ期59例；淋巴結轉移42例。納入標準：經病理檢查結果證實為卵巢癌；初診且未接受過抗腫瘤治療；年齡≥18歲；患者或家屬知情并簽署同意書。排除標準：合并其他部位惡性腫瘤；合并血液、免疫系統損害；妊娠及哺乳期婦女；院內死亡或不能接受隨訪。本研究經醫院倫理委員會批準（審批編號：2017002）。患者出院后通過門診或電話隨訪3年，隨訪截至2022年10月或死亡。

1.2 卵巢癌組織中miR-581、FOXO1表達檢測 術中切除部分卵巢癌組織和癌旁正常組織（距離癌組織≥3 cm），液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱中。取部分凍存組織，液氮下研磨成末，TRIzol法提取組織總RNA，鑒定RNA純度、濃度合格后，使用TaKaRa RNA PCR Kit試劑盒（北京寶日醫生物技術有限公司，編號：RR024A）合成cDNA。參考SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒（北京智杰方遠科技有限公司，編號：DRR041A）說明書進行擴增，引物設計和合成由北京環中睿馳科技有限公司完成。miR-581正向引物：5′-CTGATACATCGCTACTTCTG-3′，反向引物：5′-GTAATCTAACTACTCACACTA-3′；miR-581內參U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCG-3′；FOXO1正向引物：5′-CGGACGAGTACGAGAAGCG-3′，反向引物：5′-CGTAGCCAAAGACGAACATGC-3′；FOXO1內參GAPDH正向引物：5′-CGAGAGC‐TACACGTTCACGG-3′，反向引物：5′-GGGTGTC‐GAGGGAAAAATAGG-3′。反應條件：95 ℃ 90 s，95 ℃30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，循環40次后收集Ct值，2-ΔΔCT法計算組織中miR-581、FOXO1 mRNA相對表達量。根據卵巢癌組織中miR-581、FOXO1 mRNA表達均值分為高、低表達，統計患者累積生存率。

1.3 統計學方法 采用SPSS28.0統計軟件。正態分布計量資料以表示，比較采用t檢驗；計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗；Pearson相關系數分析卵巢癌組織中miR-581與FOXO1 mRNA表達的相關性；Kaplan-Meier法繪制不同miR-581、FOXO1 mRNA表達卵巢癌患者生存曲線，組間生存率比較采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢癌組織與癌旁正常組織中miR-581、FOXO1 mRNA表達比較 卵巢癌與癌旁正常組織中miR-581的相對表達量分別為1.55 ± 0.25、1.14 ±0.22，FOXO1 mRNA的相對表達量分別為0.95 ±0.21、1.39 ± 0.28，卵巢癌組織中miR-581表達高于癌旁正常組織，FOXO1 mRNA表達低于癌旁正常組織（P均<0.05）。

2.2 卵巢癌組織中miR-581與FOXO1 mRNA表達的相關性 經TargetScan數據庫7.2https：//www.targetscan.org/預測，miR-581與FOXO1的3′-非翻譯區1 943～1 949、3 224～3 231處存在結合位點（圖1）。Pearson相關系數分析顯示，卵巢癌組織中miR-581與FOXO1 mRNA表達呈負相關（r=-0.728，P<0.05）。

圖1 miR-876-5p與PAX6的結合位點圖

2.3 卵巢癌組織中miR-581、FOXO1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系 見表1。

表1 卵巢癌組織中miR-581、FOXO1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系

2.4 卵巢癌組織中miR-581、FOXO1 mRNA表達與患者預后的關系 97例卵巢癌患者隨訪2～36個月，失訪5例，死亡42例，3年累積生存率為56.70%（55/97）。miR-581高表達者（≥1.55）47例，miR-581低表達者（<1.55）50例；FOXO1 mRNA高表達者（≥0.95）49例，FOXO1 mRNA低表達者（<0.95）48例。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，miR-581高表達者與低表達者的累積生存率分別為42.55%（20/47）、70.00%（35/50），miR-581高表達者累積生存率低于miR-581低表達者（χ2=8.059，P<0.05）。FOXO1 mRNA高表達者與低表達者的累積生存率分別為71.43%（35/49）、41.67%（20/48），FOXO1 mRNA高表達者的累積生存率高于FOXO1 mRNA低表達者（χ2=11.596，P<0.05）。

3 討論

卵巢癌早期有的女性可能會出現陰道出血或排液、尿頻或便秘等癥狀，但多數患者癥狀隱匿，臨床中約70%的患者就診時已處于晚期伴盆腔播散或淋巴結轉移，手術治療異常困難，即使所有學科合作也難以達到滿意的癌細胞減滅效果，且術后多次化療易反復復發，5年生存率僅40%［10］。盡管近年來隨著基因檢測的普及和靶向藥物“多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑”的應用，改變了卵巢癌治療模式和延長了生存期，但仍有部分患者難以獲得臨床效益，且隨著治療時間延長獲得性耐藥和不良反應越來越多，影響患者預后［11］。

卵巢癌是一種異質性疾病，其發生、發展過程涉及表觀遺傳、癌基因激活、抑癌基因失活、基因轉錄后調控異常等諸多機制，miRNA是表觀遺傳學的一個新的研究熱點，能通過與mRNA的3′-非翻譯區互補或配對引發mRNA降解或轉錄后沉默，通過調控多種基因參與卵巢癌發生、發展［2-3］。miR-581定位于人5號染色體長臂11.2。研究報道，miR-581參與多種惡性腫瘤進展，如miR-581能靶向內質網降解增強α-甘露糖苷酶樣蛋白1，誘導結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲［12］；miR-581能靶向ATP結合盒轉運蛋白G1促進膽管癌細胞增殖和轉移［13］。本研究結果顯示，卵巢癌組織中miR-581高表達，與分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移和預后有關，提示miR-581高表達參與卵巢癌發生、發展。miR-581在卵巢癌組織中高表達的原因可能與miR-581啟動子被卵巢癌內原癌基因激活和大量轉錄有關，而隨著miR-581表達上調能通過與黏蛋白4相互作用，解離腫瘤細胞間的黏附作用，促使腫瘤細胞從原發病灶中解離，增強卵巢癌細胞侵襲和轉移能力，進而促進卵巢癌進展［14］；同時miR-581高表達還能上調SMAD同源物7表達，刺激卵巢癌細胞上皮間質轉化，促進卵巢癌細胞侵襲和轉移，進而促進卵巢癌進展［15］。

卵巢癌是多種因素參與的復雜過程，與基因轉錄異常、DNA損傷修復、細胞周期阻滯、分化、凋亡、自噬等密切相關［16］。FOX是一類具有DNA結合區的轉錄因子家族，FOXO1是FOX家族重要成員，不僅能作為經典轉錄因子調節基因轉錄，還能協同其他轉錄因子參與轉錄調節，在DNA損傷修復、細胞周期阻滯、分化、自噬等方面發揮重要作用［6］。研究報道，FOXO1在肺腺癌、胃癌、結直腸腺癌等惡性腫瘤中低表達，上調FOXO1能抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和血管生成［7-8，17］。本研究結果顯示，卵巢癌組織中FOXO1 mRNA低表達，與分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移和預后有關，提示FOXO1 mRNA低表達參與卵巢癌發生、發展。FOXO1 mRNA在卵巢癌組織中低表達的原因可能與FOXO1啟動子在卵巢癌內甲基化有關。有學者發現，卵巢癌內FOXO1的上游信號通路磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B失活，導致FOXO1啟動子甲基化進而表達沉默［18］。本研究通過在線數據庫預測發現，miR-581與FOXO1存在結合位點，進一步分析發現二者在卵巢癌組織中表達呈負相關，提示miR-581與FOXO1可能共同參與卵巢癌進展。高海寧等［19］研究報道，上調卵巢癌中miR-581表達能靶向下調FOXO1表達，抑制卵巢癌細胞自噬，進而促進卵巢癌發展。本研究隨訪發現，miR-581低表達和FOXO1 mRNA高表達的卵巢癌患者3年累積生存率更高，提示miR-581、FOXO1 mRNA表達與卵巢癌患者預后有關，有望成為卵巢癌患者預后評估的潛在指標。

綜上所述，卵巢癌組織中miR-581高表達和FOXO1 mRNA低表達與臨床病理特征及預后相關，二者可能共同參與卵巢癌進展，但本研究結果還需前瞻性多中心研究進一步驗證。