喉鱗狀細胞癌組織中TIP30、DKK1表達與患者臨床病理特征和預后的關系

施濤，王志顧，許莉，薛飛，陳偉，程友

東部戰區總醫院耳鼻咽喉頭頸外科，南京 210002

喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤，近年來隨著吸煙、飲酒比例的增加，喉癌發生率逐年升高，據流行病學統計，2020年我國新發喉癌病例29 135例，死亡15 814例［1］。喉鱗狀細胞癌（LSCC）是喉癌最常見類型，占喉癌95%以上，盡管近年來LSCC的診治取得一定進展，但患者預后仍較差［2-3］。tat結合蛋白30（TIP30）是一種人類免疫缺陷病毒結合蛋白，能調節腫瘤細胞增殖、遷移、凋亡等相關基因，抑制腫瘤細胞惡性行為。據報道，TIP30表達與肝癌、肺癌等惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移有關［4-5］。dickkopf相關蛋白1（DKK1）是一種分泌型糖蛋白，能通過調控Wnt信號通路促進腫瘤細胞惡性行為［6］。有研究報道，DKK1表達與骨肉瘤、膽囊癌等惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移有關［7-8］。目前，關于TIP30、DKK1表達與LSCC發生發展關系的報道較少。本研究擬探討LSCC組織中TIP30、DKK1表達與病理特征和預后的關系，以期為改善LSCC患者預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年2月—2020年2月本院收治的103例LSCC患者，男90例、女13例，年齡34～81（60.54 ± 5.63）歲。腫瘤位置：聲門上35例、聲門54例、聲門下14例；吸煙78例；飲酒60例；組織分化程度：中低分化55例、高分化48例；TNM分期［9］：Ⅰ～Ⅱ期63例、Ⅲ期40例；淋巴結轉移28例。納入標準：①經病理檢查確診為LSCC；②初次確診；③入院前未接受任何抗腫瘤治療；④患者及家屬書面知情同意。排除標準：①喉轉移癌或喉腺癌、腺鱗癌等其他喉癌類型；②合并其他部位惡性腫瘤；③合并急慢性感染或免疫、血液系統損害；④院內死亡、拒接隨訪、臨床資料不完整。LSCC患者出院后通過電話或門診隨訪3年（第1年3個月1次，然后6個月1次），隨訪截止死亡或2023年2月。本研究經醫院倫理委員會批準（2016NKY012）。

1.2 LSCC組織中TIP30、DKK1表達檢測 收集LSCC患者術中部分癌組織和癌旁組織，液氮下碾磨組織標本，TRIzol法（杭州昊鑫生物科技股份有限公司，編號：RN0102）提取組織總RNA，TaKaRa RNA PCR Kit試劑盒（北京麥瑞博生物科技有限公司，編號：RR001A-1）反轉錄合成cDNA，條件42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。以cDNA為模板，參考SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒（北京智杰方遠科技有限公司，編號：DRR041A）說明書，使用實時熒光定量聚合酶鏈式反應分析儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司，型號：7500］進行擴增，TIP30正向引物：5′-CGGGTTTGTTC‐GTTCGGCT-3′，反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAG‐GTATT-3′；DKK1正向引物：5′-AAATCCCATCAC‐CATTCCAG-3′，反向引物：5′-TGATGACCCTTTTG‐GCTCCC-3′；GAPDH正向引物：5′-TGGTGTCGTG‐GAGTCG-3′，反向引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。反應體系共20.0 μL：cDNA模板1.0 μL、2×Master mix 8 μL、正向引物0.5 μL、反向引物0.5 μL、SYBR Pre‐mix Ex Taq 5.0 μL、RNase-free ddH25.0 μL；反應條件95 ℃ 90 s（循環1次），95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s（循環40次）。以GAPDH為內參，2-ΔΔCT法計算組織中TIP30 mRNA、DKK1 mRNA相對表達量。根據LSCC組織中TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表達均值分為高、低表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS28.0統計軟件。計量資料符合正態分布以表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗；不同TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表達LSCC患者生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制；LSCC患者死亡的影響因素采用多因素Cox回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LSCC組織與癌旁組織中TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表達比較 LSCC組織與癌旁組織中TIP30 mRNA相對表達量分別為1.08 ± 0.27、1.59 ±0.34，DKK1 mRNA相對表達量分別為1.81 ± 0.42、1.27 ± 0.32，LSCC組織中TIP30 mRNA表達低于癌旁組織，DKK1 mRNA表達高于癌旁組織，差異有統計學意義（t分別為11.823、10.367，P均<0.001）。TIP30 mRNA高表達（≥1.08）54例，低表達（<1.08）49例；DKK1 mRNA高表達（≥1.81）50例，低表達（<1.81）53例。

2.2 LSCC組織中TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系 不同分化程度、TNM分期、淋巴結轉移LSCC組織中TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表達比較差異有統計學意義（P均<0.05），見表1。

表1 LSCC組織中TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系（）

表1 LSCC組織中TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系（）

臨床病理特征性別男女年齡≥60歲<60歲腫瘤位置聲門上聲門聲門下吸煙是否飲酒是否組織分化程度中低分化高分化TNM分期Ⅰ、Ⅱ期Ⅲ期淋巴結轉移有無n TIP30 mRNA相對表達量（images/BZ_6_1582_1938_1671_1989.png）t/F 0.186 P DKK1 mRNA相對表達量（images/BZ_6_1582_1938_1671_1989.png）P>0.05 t/F 0.260>0.05 90 13 1.08 ± 0.27 1.10 ± 0.26 1.81 ± 0.42 1.78 ± 0.38 0.858>0.050.803>0.05 81 22 1.07 ± 0.28 1.13 ± 0.23 1.83 ± 0.43 1.75 ± 0.37 0.264>0.050.583>0.05 35 54 14 1.11 ± 0.27 1.06 ± 0.28 1.10 ± 0.25 1.78 ± 0.39 1.85 ± 0.44 1.74 ± 0.41 0.079>0.050.059>0.05 78 25 1.08 ± 0.27 1.09 ± 0.26 1.81 ± 0.42 1.81 ± 0.40 0.167>0.050.233>0.05 60 43 1.08 ± 0.28 1.09 ± 0.25 1.82 ± 0.43 1.80 ± 0.40 2.405<0.052.391<0.05 55 48 1.02 ± 0.27 1.15 ± 0.26 1.90 ± 0.38 1.71 ± 0.43 2.698<0.052.759<0.05 63 40 1.14 ± 0.26 1.00 ± 0.26 1.72 ± 0.41 1.95 ± 0.39 3.111<0.053.519<0.05 28 75 0.95 ± 0.26 1.13 ± 0.26 2.04 ± 0.38 1.73 ± 0.40

2.3 LSCC組織中TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表達與預后的關系 隨訪3年，103例LSCC患者失訪4例（剔除），死亡31例，累積生存率為69.90%（72/103）。Kaplan-Meier生存曲線顯示，TIP30 mRNA高表達者3年累積生存率高于低表達者；DKK1 mRNA高表達者3年累積生存率低于低表達者（Log-rankχ2分別為12.316、10.758，P均<0.05）。見圖1。

圖1 不同TIP30 mRNA、DKK1 mRNA表達LSCC患者K-M生存曲線

2.4 LSCC患者死亡的影響因素 根據LSCC患者存活狀況分為死亡組31例與存活組68例，兩組臨床病理資料比較見表2。將表2有統計學差異因素作為自變量，隨訪時間為時間變量，生存狀態（賦值：死亡為“1”；存活為“0”）為因變量。多因素Cox回歸分析顯示，中低分化、TNM分期Ⅲ期、淋巴結轉移、DKK1 mRNA升高為LSCC患者死亡的獨立危險因素（P均<0.05），TIP30 mRNA升高為獨立保護因素（P<0.05），見表3。

表2 兩組相關臨床資料比較

表3 LSCC患者死亡的多因素Cox分析

3 討論

LSCC是起源于喉黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，可嚴重破壞患者語言功能、基本生理功能和外貌，由于早期癥狀非典型，導致超過60%的LSCC患者在初診時處于局部晚期（TNM分期Ⅲ～Ⅳ期，除M1），手術治療異常困難，且即使接受多學科的綜合治療，仍有40%～60%的局部晚期患者可出現復發或轉移［10］。盡管近年來免疫和靶向治療取得長足進展，已有獲批用于LSCC治療的藥物，但隨著臨床的廣泛使用，獲得性耐藥和不良反應越來越多，仍有部分患者難以獲得臨床效益［11］。

抑癌基因失活和促癌基因激活在LSCC發生發展中發揮重要作用［12］。p53是最早被發現的腫瘤抑制基因之一，能通過誘導細胞周期停滯、細胞凋亡和細胞衰老來調節細胞動態平衡，在多數人類惡性腫瘤中經常發生突變（部分或全部功能喪失）［13］。突變型p53不僅失去了正常的細胞增殖和分化調節功能，而且抑制了細胞的凋亡，促進了細胞的惡性轉化，是LSCC惡變的早期重要事件［14］。TIP30是近年來新發現的一種腫瘤抑制基因，能通過磷酸化p53的C端或N端增強p53依賴的通路，促進內源性p53表達，調節細胞周期從G1向S期轉化和抑制B淋巴細胞瘤-2/B淋巴細胞瘤xl，進而抑制腫瘤細胞增殖和促進其凋亡。劉慶偉等［15］研究報道，上調TIP30表達能抑制胃癌細胞增殖和促進其凋亡。本研究結果顯示，LSCC組織中TIP30 mRNA表達下調，與分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關，說明TIP30 mRNA低表達與LSCC發生、發展有關。分析原因可能是TIP30 表達下調會抑制p53轉錄活性和表達，使LSCC細胞繞過p53的抑瘤作用，促進LSCC細胞惡性進展［15］。

Wnt信號通路是一個高度保守的信號通路，控制細胞生長、分化、遷移、增殖、凋亡等多種生物學功能，細胞癌變時能激活Wnt并導致β-連環蛋白核易位，Wnt/β-連環蛋白信號通路能通過上皮間質轉化、誘導腫瘤免疫耐受等促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和存活［16］。DKK1是DKK家族中保守程度最高成員，最初研究發現DKK1能特異性與Kremen 蛋白、低密度脂蛋白相關蛋白5/6等Wnt蛋白競爭，阻斷Wnt下游信號傳導，最終導致β-連環蛋白降解，可能是腫瘤抑制基因［17］。近年研究發現，DKK1還能激活Wnt/β-連環蛋白信號通路，促進腫瘤惡性進展，在不同腫瘤中發揮抑癌或促癌作用［18］。如LONG等［19］研究報道，DKK1能抑制Wnt/β-連環蛋白信號通路抑制結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化。SONG等［20］研究報道，DKK1能激活Wnt/β-連環蛋白信號通路促進食管癌細胞增殖、遷移和侵襲。本研究結果顯示，LSCC組織中DKK1 mRNA表達上調，與分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關，說明DKK1 mRNA高表達與LSCC發生、發展有關。分析原因可能與DKK1 表達上調能激活Wnt/β-連環蛋白信號通路，促進LSCC細胞惡性進展有關［21］。

本研究通過分析TIP30 mRNA、DKK1表達與LSCC患者預后的關系發現，TIP30 mRNA高表達和DKK1 mRNA低表達者平均生存期延長，TIP30 mRNA高表達能降低LSCC患者死亡風險，DKK1 mRNA高表達會增加LSCC患者死亡風險，說明TIP30、DKK1與LSCC患者預后密切相關。

綜上所述，LSCC組織中TIP30 mRNA表達降低，DKK1 mRNA表達升高，與腫瘤組織分化程度、TNM分期、淋巴結轉移和預后有關。