低分子量肝素對(duì)糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制

王淮淮，趙學(xué)慧，王會(huì)芳，魏曉巖，賈軍利

河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科，河北張家口 075000

糖尿病腎病（DN）是1型糖尿病（T1DM）和2型糖尿病（T2DM）的常見并發(fā)癥［1］。糖尿病由多種因素造成，包括高血糖水平、晚期糖基化終產(chǎn)物和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的激活［2］。糖尿病早期會(huì)出現(xiàn)腎小球肥大、腎小球基底膜增厚、足細(xì)胞數(shù)量減少、系膜基質(zhì)擴(kuò)張和腎小管損傷，在晚期，腎臟會(huì)出現(xiàn)腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，嚴(yán)重時(shí)腎功能喪失［3］。目前糖尿病患者依然采用嚴(yán)格的血糖控制和降壓降脂治療，但不能完全阻止患者的腎病進(jìn)展［4］。肝素類藥物是應(yīng)用廣泛的一類抗凝類藥物，包括未分級(jí)肝素及低分子量肝素（LMH）。LMH是由未分級(jí)肝素解聚而得［5］，肝素具有多種藥理活性，包括抗凝血抗血栓、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、促進(jìn)傷口愈合、預(yù)防和治療貧血等［6］。目前LMH治療DN的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究較少。2021年12月—2022年11月，本實(shí)驗(yàn)采用高濃度葡萄糖（HG）誘導(dǎo)人腎小球足細(xì)胞（HGPC）建立DN損傷模型，通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路變化探討LMH對(duì)DN足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，以期了解DN中足細(xì)胞損傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞株HGPC購(gòu)自河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心。低分子量肝素鈉（純度≥99%）、D-葡萄糖、NF-κB通路抑制劑BAY11-7082（純度≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；NF-κB通路激活劑Prostratin購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；無糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；Hoechst 33258染色試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)（CCK-8）試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；RI‐PA裂解液、0.1 %結(jié)晶紫水溶液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；鼠抗人肌動(dòng)蛋白（β-actin）、NF-κBp65、磷酸化（p）-NF-κBp65、波形蛋白（Vimentin）、纖連蛋白（FN）、神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）、上皮型鈣黏蛋白（E-cad‐herin）一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司。NIKON Ti-s型倒置熒光顯微鏡購(gòu)自東莞市昱和儀器設(shè)備有限公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，OI 1000型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海山科學(xué)儀器有限公司。

1.2 HGPC培養(yǎng) HGPC細(xì)胞接種于含10 % FBS、5 mmol/L葡萄糖的DMEM完全培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁達(dá)80 %以上時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，選取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)開始之前，用無血清、無糖DMEM培養(yǎng)液在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞24 h，使細(xì)胞完成同化。

1.3 細(xì)胞分組與給藥 HGPC細(xì)胞同化后調(diào)整密度為2×105/mL，接種到合適細(xì)胞培養(yǎng)板中。將HGPC細(xì)胞分為對(duì)照（NC）組、HG組、1、5、10、15、20 μmol/L LMH組，NC組細(xì)胞以含5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)；HG組細(xì)胞以含30 mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)［7］；1、5、10、15、20 μmol/L LMH組細(xì)胞以含30 mmol/L葡萄糖+不同濃度（1、5、10、15、20 μmol/L）LMH的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)，篩選出最佳濃度LMH后，又將細(xì)胞分為NC組、HG組、LMH組、BAY11-7082組、LMH+BAY11-7082組、LMH+Pros‐tratin組。LMH組細(xì)胞以含30 mmol/L葡萄糖+15 μmol/L LMH的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)；BAY11-7082組細(xì)胞以含30 mmol/L的葡萄糖+1 μmol/L BAY11-7082的培養(yǎng)基培養(yǎng)［8］；LMH+BAY11-7082組細(xì)胞以含30 mmol/L葡萄糖+15 μmol/L LMH+1 μmol/L BAY11-7082的培養(yǎng)基培養(yǎng)；LMH+Prostratin組細(xì)胞以含30 mmol/L葡萄糖+15 μmol/L LMH+20 μmol/L Prostratin的培養(yǎng)基培養(yǎng)［9］，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.4 HG誘導(dǎo)的DN模型HGPC細(xì)胞活力檢測(cè) 采用CCK-8法。將細(xì)胞以7×103細(xì)胞/孔的密度接種于96孔微孔板中。經(jīng)HG誘導(dǎo)建立模型24 h后，給予不同濃度（1、5、10、15、20 μmol/L）的LMH處理24 h或48 h。顯微鏡下評(píng)估細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，之后使用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8溶液，在37 °C孵育1 h后，在450 nm波長(zhǎng)下使用酶標(biāo)儀測(cè)量光密度（OD）。

1.5 HG誘導(dǎo)的DN模型HGPC細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用Hoechst 33258染色法。給藥LMH處理24 h后，用10 μL Hoechst 33258染色液在避光條件下染色10 min，固定后在熒光顯微鏡下（×20）觀察并采集Hoechst 33258染色的細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率（%）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總的細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.6 HG誘導(dǎo)的DN模型HGPC細(xì)胞的侵襲能力檢測(cè) 取各組處理24 h的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。Transwell小室預(yù)先用基質(zhì)膠包被，將Transwell小室放入24孔板中，將200 μL（含5×104個(gè)細(xì)胞）細(xì)胞懸液加入Transwell上室，下室加入含有10% FBS的完全培養(yǎng)基，將整個(gè)Transwell-細(xì)胞體系轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后，下室細(xì)胞用4%的甲醇固定30 min。之后0.1 %結(jié)晶紫染色10 min，將小室放在顯微鏡下（20×）觀察拍照，并分析計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）。

1.7 HG誘導(dǎo)的DN模型HGPC細(xì)胞裂解液中腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6檢測(cè) 采用ELISA法。評(píng)估HG誘導(dǎo)下的HGPC細(xì)胞因子分泌水平，按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測(cè)HGPC細(xì)胞裂解液中TNF-α、IL-6。

1.8 HG誘導(dǎo)的DN模型HGPC細(xì)胞中NF-κBp65、p-NF-κBp65、Vimentin、FN、N-cadherin、E-cadherin表達(dá)檢測(cè) 采用蛋白免疫印跡法。取各組干預(yù)24 h后的細(xì)胞，與RIPA裂解液共同孵育，并置冰上裂解，12 000 r/min離心20 min（離心半徑8 cm），取上清液，其中蛋白質(zhì)濃度通過BCA蛋白試劑盒來定量分析。按照20 μg/孔的蛋白量上樣，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳分離蛋白，一抗(稀釋比例：NF-κBp65 1∶2 000、p-NF-κBp65 1∶1 000、Vimentin 1∶20 000、FN 1∶5 000、N-cadherin 1∶5 000、E-cadherin 1∶5 000、β-actin 1∶10 000）4 ℃孵育過夜、二抗（稀釋比例為1∶2 000）室溫孵育2 h，置于凝膠成像系統(tǒng)下顯色拍照記錄，之后使用Image J（Version 1.53c）軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)以目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示，磷酸化蛋白的相對(duì)表達(dá)以磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白的比值表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用Dunnett′st檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度LMH對(duì)HG誘導(dǎo)DN模型HGPC細(xì)胞活力的影響 HG組相比NC組細(xì)胞活力下降（P<0.05），在LMH處理24 h或48后，與HG組相比，LMH在1~20 μmol/L時(shí)的細(xì)胞活力均高于HG組（P均<0.05），且在1~15 μmol/L范圍內(nèi)，HGPC細(xì)胞活力隨LMH濃度的升高而升高，在濃度為20 μmol/L時(shí)相比15 μmol/L稍有下降，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用15 μmol/L作為L(zhǎng)MH的最適劑量。見表1。

表1 各組細(xì)胞活力比較（）

表1 各組細(xì)胞活力比較（）

注：與NC組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05。

組別NC組HG組1 μmol/L LMH組5 μmol/L LMH組10 μmol/L LMH組15 μmol/L LMH組20 μmol/L LMH組48 h 0.362 ± 0.030 0.238 ± 0.044*0.418 ± 0.035#0.423 ± 0.029#0.466 ± 0.028#0.558 ± 0.026#0.533 ± 0.043#OD值24 h 0.343 ± 0.035 0.206 ± 0.027*0.341 ± 0.027#0.366 ± 0.025#0.463 ± 0.029#0.497 ± 0.034#0.492 ± 0.020#

2.2 LMH和BAY11-7082、Prostratin對(duì)HG誘導(dǎo)的DN模型HGPC細(xì)胞凋亡的影響 藥物處理24 h后，NC組、HG組、LMH組、BAY11-7082組、LMH+BAY11-7082組、LMH+Prostratin組細(xì)胞凋亡率分別為（6.380 ±0.840）%、（40.351 ± 2.090）%、（23.285 ± 2.635）%、（20.654 ± 2.299）%、（8.373 ± 2.664）%、（31.738 ±1.442）%，與NC組相比，HG組細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）；與HG組相比，LMH組和BAY11-7082組細(xì)胞凋亡率下降（P均<0.05）；與LMH組相比，LMH+BAY11-7082組細(xì)胞凋亡率下降（P<0.05），LMH+Prostratin組細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）。

2.3 LMH和BAY11-7082、Prostratin對(duì)HG誘導(dǎo)的DN模型HGPC細(xì)胞侵襲能力的影響 處理細(xì)胞24 h后，NC組、HG組、LMH組、BAY11-7082組、LMH+BAY11-7082組、LMH+Prostratin組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（73.333 ± 12.423）、（392.333 ± 37.099）、（178.333 ± 20.817）、（141.667 ± 17.098）、（99.333 ±5.132）、（310.667 ± 35.233）個(gè)/HP，HG組和NC組相比侵襲細(xì)胞數(shù)上升（P<0.05）；與HG組相比，LMH組和BAY11-7082組侵襲細(xì)胞數(shù)少（P均<0.05）；與LMH組相比，LMH+BAY11-7082組侵襲細(xì)胞數(shù)少（P<0.05），LMH+Prostratin組侵襲細(xì)胞數(shù)多（P<0.05）。

2.4 各組HGPC細(xì)胞裂解液中TNF-α、IL-6分泌水平比較 與NC組相比，HG組TNF-α、IL-6水平升高（P均<0.05）；與HG組相比，LMH組和BAY11-7082組TNF-α、IL-6水平下降（P均<0.05）；與LMH組相比，LMH+BAY11-7082組TNF-α、IL-6水平下降（P均<0.05），LMH+Prostratin組TNF-α、IL-6水平升高（P均<0.05）。見表2。

表2 各組HGPC細(xì)胞裂解液中TNF-α、IL-6水平比較（pg/mL，）

表2 各組HGPC細(xì)胞裂解液中TNF-α、IL-6水平比較（pg/mL，）

注：與NC組相比，*P<0.05；與HG組相比，#P<0.05；與LMH組相比，&P<0.05。

IL-6 1.559 ± 0.232 12.486 ± 0.447*6.287 ± 0.168#5.672 ± 0.223#3.307 ± 0.272&9.805 ± 0.223&組別NC組HG組LMH組BAY11-7082組LMH+BAY11-7082組LMH+Prostratin組TNF-α 2.676 ± 0.067 8.351 ± 0.183*5.704 ± 0.133#4.540 ± 0.133#3.468 ± 0.351&6.503 ± 0.285&

2.5 各組HGPC細(xì)胞中NF-κB通路相關(guān)蛋白p-NF-κBp65表達(dá)比較 NC組、HG組、LMH組、BAY11-7082組、LMH+BAY11-7082組、LMH+Prostratin組p-NF-κBp65相對(duì)表達(dá)量分別為1.295 ± 0.120、1.922 ± 0.034、1.229 ± 0.080、1.099 ± 0.062、0.449 ± 0.006、1.839 ± 0.028。與NC組相比，HG組細(xì)胞中p-NF-κBp65表達(dá)升高（P<0.05）；與HG組相比，LMH組和BAY11-7082組細(xì)胞中p-NF-κBp65表達(dá)下降（P均<0.05）；與LMH組相比，LMH+BAY11-7082組細(xì)胞中p-NF-κBp65表達(dá)下降（P<0.05），LMH+Prostratin組細(xì)胞中p-NF-κBp65表達(dá)升高（P<0.05）。

2.6 各組HGPC細(xì)胞中Vimentin、FN、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)比較 見表3。

表3 各組HGPC細(xì)胞中Vimentin、FN、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)比較（）

表3 各組HGPC細(xì)胞中Vimentin、FN、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)比較（）

注：與NC組相比，*P<0.05；與HG組相比，#P<0.05；與LMH組相比，&P<0.05。

組別NC組HG組LMH組BAY11-7082組LMH+BAY11-7082組LMH+Prostratin組E-cadherin蛋白1.065 ± 0.017 0.553 ± 0.008*0.871 ± 0.009#0.841 ± 0.019#1.166 ± 0.003&0.531 ± 0.008&Vimentin蛋白0.428 ± 0.024 0.870 ± 0.075*0.578 ± 0.028#0.506 ± 0.028#0.192 ± 0.004&0.812 ± 0.019&FN蛋白0.515 ± 0.021 0.777 ± 0.006*0.544 ± 0.025#0.524 ± 0.012#0.302 ± 0.005&0.741 ± 0.021&N-cadherin蛋白0.621 ± 0.021 0.935 ± 0.037*0.580 ± 0.041#0.479 ± 0.040#0.266 ± 0.020&0.881 ± 0.015&

3 討論

DN是糖尿病患者死亡的主要危險(xiǎn)因素，是終末期腎病腎衰竭的主要原因［10］。隨著DN發(fā)展，腎小球受損數(shù)量增加，腎小球?yàn)V過能力降低。研究表明，DN發(fā)生、發(fā)展與足細(xì)胞損傷相關(guān)［11］。足細(xì)胞是一種獨(dú)特的、高度分化的腎小球上皮細(xì)胞，與內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜一起形成腎小球?yàn)V過屏障，維持腎臟正常功能。DN足細(xì)胞損傷后其形態(tài)學(xué)發(fā)生較大改變，包括足細(xì)胞肥大、足細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和足細(xì)胞凋亡［12］。

高血糖、氧化應(yīng)激和RAAS系統(tǒng)激活是造成DN損傷的主要致病因素，但現(xiàn)有大量證據(jù)表明，炎癥在糖尿病發(fā)生、進(jìn)展中起關(guān)鍵作用［13］，且調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)已成為治療DN的一種潛在方案［14］。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α主要由活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，是重要的炎癥因子［15］，且與糖尿病患者的蛋白尿發(fā)生密切相關(guān)，表明TNF-α是糖尿病神經(jīng)病變的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物［16］。IL-6是一種細(xì)胞因子，在炎癥病理學(xué)中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，DN患者尿液中IL-6水平升高［17］，而阻斷IL-6受體后，通過減少炎癥和氧化應(yīng)激，減弱了糖尿病大鼠的組織病理學(xué)改變［18］。NF-κB參與細(xì)胞對(duì)外界刺激的響應(yīng)，在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，抑制NF-κB活性可改善小鼠白蛋白尿、腎小球損傷和血糖水平［19］，并降低腎臟促炎細(xì)胞因子水平和氧化應(yīng)激［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，LMH可抑制HG誘導(dǎo)的DN模型HGPC細(xì)胞凋亡，抑制炎癥因子TNF-α和IL-6分泌，抑制NF-κBp65的活化，但并不影響NF-κBp65表達(dá)。

EMT是一個(gè)可逆過程，其中上皮細(xì)胞失去其特性并成為間充質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞骨架的表達(dá)發(fā)生改變。結(jié)果，細(xì)胞發(fā)展運(yùn)動(dòng)侵入性，允許它們以高度動(dòng)態(tài)和可塑的方式在上皮和間充質(zhì)狀態(tài)之間過渡［21］。EMT是促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲的因素。足細(xì)胞EMT被認(rèn)為在DN發(fā)展中起重要作用，足細(xì)胞EMT的靶向抑制可能為DN提供了一種新的治療方法。本研究發(fā)現(xiàn)，LMH可上調(diào)HG誘導(dǎo)的DN模型HGPC細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)，抑制Vimentin、FN、N-cadherin蛋白表達(dá)，抑制HGPC細(xì)胞的侵襲能力。

綜上所述，LMH可對(duì)HG誘導(dǎo)的DN模型HGPC細(xì)胞損傷產(chǎn)生一定保護(hù)作用，其機(jī)制可能是抑制NF-κB通路的活性和EMT進(jìn)程。