經氣管鏡超聲引導針吸活檢術聯合核酸擴增試驗對肺門/縱隔淋巴結結核的診斷價值

李媛媛，常煒，阿爾泰，高孟秋

1 首都醫科大學附屬北京胸科醫院 北京市結核病胸部腫瘤研究所結核科，北京 101149；2 新疆醫科大學第八附屬醫院呼吸與危重癥醫學科；3 新疆醫科大學第八附屬醫院胸外科；4 新疆醫科大學第八附屬醫院科教科

結核病是全球重大公共衛生問題之一，是法定報告傳染病中發病率和病死率均較高的一種疾病類型［1］。縱隔淋巴結核過去常見于兒童的原發型肺結核，現階段成人型縱隔淋巴結核亦逐漸增多［2］。在既往臨床工作中，我們通過支氣管鏡檢查發現越來越多的支氣管淋巴瘺型氣管結核，此類患者病情進展迅速，傳染性較高［3］，若不及時治療則會導致結核蔓延，引起嚴重的全身癥狀，故早期診斷肺門/縱隔淋巴結結核對于指導臨床治療有重要意義。目前臨床多采用常規影像學檢查，但其無法進行定性判斷，缺乏組織病理學和細菌學依據，極易誤診［4］。超聲支氣管鏡（EBUS）是一種在支氣管鏡前端裝置超聲探頭的設備，另配備專用的吸引活檢針，可在實時超聲引導下行經支氣管針吸活檢（TBNA）［5］。EBUS具有電子凸陣掃描的彩色能量多普勒超聲，有助于操作過程中確認血管位置，易于分辨淋巴結和血管的界限及解剖關系，防止誤穿血管，提高TBNA的安全性。感染性疾病的組織病理學觀察往往缺乏特異性，多數實驗室還無法在病理中應用實時熒光定量PCR對結核分枝桿菌DNA進行檢測。這需要高效的病原學檢測方法來進一步補充組織病理診斷的不足以提高診斷效率。因此，本研究通過探究EBUSTBNA聯合核酸擴增試驗對肺門/縱隔淋巴結結核的診斷價值，以期為肺門/縱隔淋巴結結核的臨床診斷提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月—2022年1月于新疆醫科大學第八附屬醫院接受EBUS-TBNA的疑似縱隔淋巴結結核患者為研究對象。納入標準：①臨床診斷為肺結核，影像學證實為肺門/縱隔淋巴結腫大；疑似肺結核，影像學證實為肺門/縱隔淋巴結腫大；影像學證實單純孤立肺門/縱隔淋巴結腫大；上述條件符合任一即可；②無支氣管鏡檢查禁忌證；③無經氣管鏡超聲引導針吸活檢術禁忌證；④患者知情同意并簽署知情同意書。排除標準：①伴有嚴重心、肝功能障礙者；②伴有凝血功能障礙者；③伴有哮喘發作或大咯血者；④全麻不耐受或對麻醉藥物過敏者；⑤伴有精神疾病者。本研究共納入159例疑似縱隔淋巴結結核患者，其中男73例、女86例，年齡20~50（30.25 ± 6.65）歲。本研究經新疆醫科大學第八附屬醫院倫理委員會審核批準（2019倫審001）。

1.2 經EBUS-TBNA抽吸活檢針負壓抽吸標本采集 患者術前6 h禁食水，建立靜脈通道，有創動脈血壓監測。患者取仰臥位，經口插喉罩或單腔氣管插管進行全麻，術中機械輔助通氣。經喉罩進入超聲內窺鏡，開啟彩色多普勒超聲探查，確認穿刺目標，固定超聲內窺鏡，測量目標大小，預計穿刺深度。通過內鏡進入穿刺針，固定穿刺針的穿刺深度，刺入目標后，超聲可見穿刺目標內強回聲影，確定穿刺針位于目標內，將活檢針柄推出，然后啟動切割開關。用上述方法再次穿刺活檢，獲得2~3條相對完整的組織條，用甲醛固定。如果病變較小或壞死面積較大，無法活檢，則使用抽吸活檢針負壓抽吸標本，噴在載玻片上。

1.3 標本檢測 ①細菌學檢測：抽吸活檢針負壓抽吸標本置入無菌培養管中進行結核分枝桿菌培養；②核酸擴增試驗檢測：抽吸活檢針負壓抽吸標本置入無菌容器，進行實時熒光核酸恒溫擴增試驗，若試驗結果陽性進一步行實時熒光PCR熔解曲線完成分子藥物敏感性檢測；③病理檢測：所得組織標本10%中性液固定，之后分別經組織脫水、石蠟包埋、切片，經蘇木素-伊紅染色，光學顯微鏡下辨別活檢標本的良惡性及細胞類型。肉芽腫性改變標本進行抗酸染色。

1.4 藥物敏感性試驗 分子DST檢測：采用廈門致善生物科技股份有限公司生產的SLAN-96S型實時熒光定量PCR儀以及BY-R18型低溫高速離心機。使用溶解曲線檢測試劑盒，嚴格按照鏈霉素、利福平、異煙肼、乙胺丁醇、氟喹諾酮類耐藥突變試劑盒說明書操作。當樣本的熔解溫度與陽性對照的溶解溫度一致（誤差不超過1 ℃）時判定為野生型；樣本的Tm低于陽性對照2 ℃及以上時判定為突變型。

表型DST檢測：采用美國BD公司生產的BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養監測系統及配套試劑，依據說明規范進行結核菌培養及DST檢測。以生長單位（GU）指數評估耐藥結果：含藥品培養管的GU值<100為敏感，≥100為耐藥。檢測藥物包括鏈霉素、利福平、異煙肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺。

1.5 診斷結果判定［6］結核培養結果判定：MGIT 960培養顯示存在結核分枝桿菌即為陽性。實時熒光核酸恒溫擴增檢測結果判定：檢測樣本CT值等于40或0的樣本為陰性樣本，檢測樣本CT值≤37.0者判為陽性，CT值>37.0的樣本建議重做，重做結果CT值<40者為陽性，否則為陰性。組織病理學分為5級：表皮樣肉芽腫反應伴干酪壞死為Ⅰ級；無干酪壞死上皮樣肉芽腫反應為Ⅱ級；非肉芽腫反應伴壞死為Ⅲ級；非特異性為Ⅳ級；樣本不足為Ⅴ級。Ⅰ～Ⅲ級或抗酸染色陽性被認為是高度懷疑的結核病，判斷為組織病理學陽性。耐藥結核診斷判定［7］：單耐藥（MR-TB）定義為感染的結核菌僅對1種一線抗結核藥產生耐藥；多耐藥（PR-TB）定義為對1種以上一線抗結核藥產生耐藥，但不包括同時耐利福平和異煙肼；耐多藥（MDR）指至少同時對異煙肼和利福平耐藥；利福平耐藥（RR-TB）指對利福平耐藥的結核病。患者最終被分為三類：“病原學確診”肺門/縱隔淋巴結結核：包括MGIT 960培養或NAAT陽性；“可能的”肺門/縱隔淋巴結結核（缺乏病原學陽性結果，但有典型的組織病理表現提示結核病，具有與結核一致的典型癥狀和體征，對抗結核治療有良好反應）；“非結核”（診斷為非結核或者如果在沒有抗結核治療的情況下出現臨床癥狀改善）。在本研究中，最終臨床診斷作為肺門/縱隔淋巴結結核的參考標準，即綜合診斷，包括基于所有可用數據聯合組織病理學、病原學、免疫學檢測和抗結核治療反應的“明確”和“可能”病例。

1.6 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計量資料符合正態分布以表示，比較采用t檢驗。計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床診斷結果 患者均順利完成EBUS-TB‐NA，經過6個月隨訪，對所有研究對象進行最終診斷。在159例肺門/縱隔淋巴結腫大病例中，通過EBUS-TBNA診斷為結核112例，診斷為非結核33例（肺癌16例，淋巴結炎7例，結節病4例，塵肺4例，非結核分枝桿菌病1例，淋巴瘤1例），14例未得到任何陽性證據。14例中9例通過診斷性抗結核診斷為結核病，5例再次復查氣管內鏡及手術等一系列檢查后診斷為非結核性疾病（肺癌2例，淋巴瘤2例，結節病1例）。最終臨床診斷肺門/縱隔淋巴結結核患者121例，肺癌18例，淋巴結炎7例，結節病5例，塵肺4例，淋巴瘤3例，非結核分枝桿菌病1例。159例肺門/縱隔淋巴結腫大患者中合并肺結核95例。

2.2 EBUS-TBNA在縱隔淋巴結結核中的診斷結果 以綜合診斷為標準，92.56%（112/121）的肺門/縱隔淋巴結結核患者經EBUS-TBNA穿刺物標本確診。經過EBUS-TBNA診斷為肺門/縱隔淋巴結結核的112例中，98例組織病理結果陽性，46例為結核菌培養陽性，79例核酸檢測陽性。

2.3 EBUS-TBNA不良反應發生率 患者均能耐受操作，1例術中出現低氧血癥，2例術后咯血，經止血和吸氧后均得到明顯改善；2例術后發熱，服用復方對乙酰氨基酚片后體溫恢復正常。不良反應發生率為3.14%（5/159）。

2.4 EBUS-TBNA不同檢測方法對肺門/縱隔淋巴結結核診斷的靈敏度、特異度和準確率比較 如表1所示，核酸擴增試驗對結核分枝桿菌檢測的敏感度較高，高于結核菌培養，與組織病理學無統計學差異；特異度達到100%，高于組織病理學，與結核菌培養一致；準確度亦較高，高于結核菌培養，與組織病理學差異無統計學意義；結核菌培養敏感度最低，組織病理學的特異度最低。組織病理學存在8個假陽性：結節病4例，肺癌淋巴結轉移3例，非結核分枝桿菌病 1例。

表1 EBUS-TBNA不同檢測方法診斷結果比較

2.5 肺門/縱隔淋巴結結核的耐藥情況

2.5.1 肺門/縱隔淋巴結結核的耐藥特征 121例肺門/縱隔淋巴結結核患者中EBUS-TBNA標本MGIT 960培養陽性46例，有7例對檢測藥物中任一種或兩種以上藥物耐藥，表型耐藥檢出總耐藥率為15.22%。其中耐多藥結核病（同時耐異煙肼、利福平）2例，多耐藥結核病（同時耐異煙肼、乙胺丁醇）1例，利福平耐藥結核病1例，異煙肼單耐藥結核病3例。表型DST檢出耐藥順位情況：耐異煙肼13.04%（6/46）、耐利福平6.52%（3/46）、耐乙胺丁醇2.17%（1/46），對異煙肼耐藥率較高。EBUS-TBNA標本核酸擴增試驗檢測陽性79例，分子耐藥檢出耐藥8例，比表型耐藥多檢出1例利福平耐藥結核病，余耐藥與表型耐藥一致。

2.5.2 分子與表型DST利福平和異煙肼耐藥性的檢測結果比較 熒光PCR熔解曲線法的DST結果平均報告時間為（24.0 ± 9.6）h，BACTEC MGIT 960 DST結果平均報告時間為（34.0 ± 5.0）d。熒光PCR溶解曲線法的DST結果明顯短于BACTEC MGIT 960法表型DST檢測時間（t=9.375，P<0.05）。經EBUS-TBNA診斷肺門/縱隔淋巴結結核患者行表型DST檢出耐利福平的有3例，耐異煙肼的有6例。以表型DST檢測結果為參照標準，經EBUS-TBNA診斷肺門/縱隔淋巴結結核患者中，分子DST檢出耐利福平的有4例，耐異煙肼的有6例，與表型DST結果一致性較高。

3 討論

肺門/縱隔淋巴結結核屬原發性肺結核的一種亞型，多發生于初次感染結核菌者，其發病率逐年上升［8］，肺門/縱隔淋巴結結核臨床通常表現為不典型，易出現誤診、漏診現象。傳統有創檢查方法中，縱隔鏡和胸腔鏡是推薦的診斷方法，但其風險高、取得組織標本的淋巴結區域有限［9］。因此臨床需尋求準確且安全性高的評估手段以對肺門/縱隔淋巴結結核進行診斷。

本研究結果顯示，EBUS-TBNA可有效鑒別肺門/縱隔淋巴結腫大患者。EBUS-TBNA是將內鏡學和超聲學相聯合，具有操作方便、范圍廣、并發癥少等優點，其可通過多勒普超聲技術動態觀察病灶內血供，分析其生長方式、質地及回聲、是否外侵等生物學特點，明確周圍血管分布情況指導選擇合適的穿刺部位，安全完成操作過程［10］。EBUS-TBNA在EBUS圖像中通過利用病變在淋巴組織內侵犯破壞、導致液化及隨之出現的硬化、增殖等改變，利用多普勒超聲系統對其回聲特征分析準確判斷病灶部位，隨之利用穿刺針抽吸病變組織進行病理及病原學檢測，可提高肺門/縱隔淋巴結結核的準確率。既往研究已證實EBUS-TBNA對肺門/縱隔內惡性疾病有較高的診斷價值，丁群力等［11］通過對124例肺門/縱隔淋巴結腫大患者進行EBUS-TBNA檢測，可有效診斷出肺門/縱隔淋巴結結核患者，病原學診斷率為82.60%；MOHAN等［12］通過EBUS-TBNA檢測臨床可能為縱隔結核病的孤立性縱隔淋巴結腫大患者發現，EBUS-TBNA是一種有效、安全的胸腔內結核病診斷工具；此外，TETART等［13］研究指出，EBUS-TB‐NA對HIV感染患者胸部淋巴結病診斷的準確率達92%，可作為結核病低發病率地區HIV感染患者縱隔淋巴結病的一種安全、準確的檢查方法。本研究與以上研究均顯示EBUS-TBNA為診斷肺門/縱隔淋巴結結核的有效方法。本研究結果還顯示，EBUSTBNA穿刺組織活檢均順利完成，不良反應發生率為3.14%，表明EBUS-TBNA穿刺組織活檢安全性較高。EBUS-TBNA為超聲監測下實時穿刺，因此引起大血管損傷出血的概率極小，另22G、21G的穿刺針較細也不易引起縱隔氣腫、氣胸等發生。GONU‐GUNTLA等［14］的一項回顧研究分析表明，在使用EBUS-TBNA中未出現嚴重縱隔氣腫、氣胸等并發癥，僅出現穿刺部位少量出血，提示EBUS-TBNA具有較高的安全性。

從本研究結果來看，組織病理結果靈敏度較高，特異度較低，并且淋巴結穿刺操作能否穿到干酪壞死部位對結果影響較大，但細胞學可對惡性淋巴結腫大等其他疾病進行鑒別，故應作為細針淋巴結穿刺檢查常規送檢項目。穿刺標本僅靠組織病理結果判讀時應注意將結核巨細胞作為特異性細胞學特征，若表現為上皮樣肉芽腫，則需要聯合臨床進行充分鑒別診斷，包括結核或其他特殊感染如非結核分枝桿菌、真菌、放線菌、諾卡菌等、結節病、結締組織病、藥物相關肺損害以及淋巴瘤等［15］。傳統的結核分枝桿菌檢測方法，如抗酸桿菌涂片鏡檢，靈敏度低，不能區分結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌。標本中每毫升必須存在5 000~10 000個細菌時，才能通過顯微鏡觀察到結核病細菌。結核分枝桿菌培養是結核診斷的金標準，但其靈敏度較低，周期較長，不能滿足結核病的早診斷早治療的臨床需求［16］。結核菌培養需活菌才能報告陽性，但淋巴結核中結核分枝桿菌數量少，如經過抗結核治療，培養陽性的可能性較小，因而無法獲得滿意的陽性結果。隨著診斷技術的進步和越來越多的臨床研究評估，新的分子生物學方法診斷手段在臨床實踐中受到越來越多關注［17］。核酸擴增試驗是一種快速的分子診斷技術，其使用的目標基因（DNA或RNA）為結核分枝桿菌所特有，而進行基因擴增、測序檢測系列，是不依賴標本菌群質量及數量的。與傳統培養相比，具有快速、敏感且能除外其他非結核分枝桿菌的干擾等優點；此外，在PCR基礎上檢測耐藥基因，從而獲得早期耐藥信息［18］。本研究中采用的實時熒光核酸恒溫擴增技術是一種結核病分子快速診斷技術，是一項基于結核分枝桿菌核酸提取、擴增為基礎的全自動分子生物學檢測技術，少量標本即可完成檢查。其還采用實時熒光定量PCR技術自動進行檢測，最大程度減少由于人工操作導致樣品間出現交叉污染的可能性。

近年來，隨著抗結核藥物的廣泛使用，結核分枝桿菌的耐藥情況較嚴重，導致結核病近期療效差，遠期復發率高［19］。當前，結核耐藥的診斷依據主要源于結核菌培養，其中BACTECMGIT960液體藥敏試驗是臨床上檢測結核分枝桿菌對常用抗結核藥品耐藥性的常用方法之一，但其通常需對患者痰液中菌群進行培養，結核分枝桿菌生長緩慢，檢測周期較長，易致患者錯過最佳治療時期［20］。本研究中采用的分子藥物敏感性試驗使用熒光PCR熔解曲線檢測，其原理是在PCR完成后，通過實時監測溫度變化過程中探針熒光強度變化情況，得到熒光強度或者熒光強度相對溫度的負導數隨溫度變化的曲線，即探針熔解曲線，從探針熔解曲線上可以獲得探針與靶序列雜交的熔點值（Tm值）。當熒光探針與不同的靶序列雜交時，由于堿基匹配程度不同，形成雙鏈DNA的穩定性也各不相同，其Tm值存在差異。一條熒光探針可同多條序列相近的靶序列雜交產生不同的Tm值，因此根據Tm值的差異就可以實現不同靶的檢測和區分，即Tm值的多重檢測，可實現鏈霉素、利福平、異煙肼、乙胺丁醇、氟喹諾酮類耐藥的進一步檢測，有利于對耐藥患者進行快捷診斷并減少耐藥患者的傳播。本研究結果顯示，46例結核菌培養陽性患者中，總耐藥率15.22%，其中異煙肼耐藥率較高，這與既往肺門/縱隔淋巴結結核化療方案以異煙肼為主有關。耐藥的產生主要與編碼藥物靶標的基因、染色體或藥物激活酶總體突變，從而影響靶位酶與藥物聯合產生耐藥性。異煙肼發揮對分枝桿菌的毒性作用需要過氧化物酶和過氧化氫酶或KatG的細胞激活，而當KatG突變時則會產生對結核分枝桿菌的耐藥性，其中以KatG S315T突變為主［21］。本研究結果顯示，分子DST檢測利福平、異煙肼耐藥性與表型DST結果一致率較高，但極大地縮短了報告時間，有助于早期明確結核患者耐藥譜，因此對于已發現的耐藥結核病患者，應聯合藥物敏感性試驗結果及既往治療史有針對性地早期制定耐藥抗結核方案，最大限度避免臨床不合理用藥。

綜上所述，EBUS-TBNA聯合核酸擴增試驗對肺門/縱隔淋巴結結核患者有一定診斷價值，且不良反應發生率較低，還可依據其結核分枝桿菌分子耐藥信息，開展耐藥結核病精準治療，早期制定合理抗結核方案。這將成為痰檢病原學檢測陰性病例有意義的補充診斷方式。由于本研究中患者病例數較少，后續仍需擴大樣本量進一步驗證。