上皮性卵巢癌組織中miR-515-5p、CSPG4的表達及臨床意義

陳益波，林永紅，張叢敏

1 崇州市婦幼保健院婦科，四川崇州 611230；2 成都市婦女兒童中心醫院婦科

卵巢癌是臨床常見的女性生殖系統惡性腫瘤。據2020年國際癌癥研究機構報告，我國新發卵巢癌病例5.5萬例，死亡3.8萬例，其發病率居宮頸癌和子宮體惡性腫瘤之后，但病死率居所有女性生殖系統惡性腫瘤之首，疾病負擔嚴重［1］。上皮性卵巢癌（EOC）是卵巢癌最常見類型，占所有卵巢癌的80%，盡管近年來卵巢癌的診治取得了一定進展，但EOC患者預后仍較差［2］。研究表明，微小RNA（miRNA）通過多條信號通路活化參與卵巢癌發生、發展［3］。研究報道，miR-515-5p參與胃癌、結直腸癌等惡性腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲與凋亡等過程［4］。硫酸軟骨素蛋白聚糖4（CSPG4）是一種細胞表面蛋白，能通過結合肌動蛋白細胞骨架激活一系列信號效應因子［5］。研究報道，CSPG4參與黑色素瘤、皮膚鱗狀細胞癌等惡性腫瘤進展［6］。目前，關于EOC組織中miR-515-5p、CSPG4表達及臨床意義的研究報道不多。本研究旨在通過檢測EOC組織中miR-515-5p、CSPG4表達，探討二者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月—2019年12月崇州市婦幼保健院收治的84例EOC患者，年齡31～81（55.35 ± 7.26）歲。病理類型：漿液性癌67例、黏液性癌17例；腫瘤最大徑：≥3 cm 33例、<3 cm 51例；組織分化程度：低分化31例、中高分化53例；國際婦產科聯盟（FIGO）分期：Ⅰ期16例、Ⅱ期17例、Ⅲ期51例；淋巴結轉移36例。納入標準：①經病理證實為卵巢癌；②初診且未接受過抗腫瘤治療；③入院接受根治性或姑息性手術；④年齡≥18歲；⑤患者或家屬知情并簽署同意書。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤或既往惡性腫瘤；②合并血液、免疫系統損害；③妊娠及哺乳期婦女；④院內死亡或不能接受隨訪。本研究經醫院倫理委員會批準。患者出院后通過門診或電話隨訪3年，隨訪截止2022年12月或死亡。

1.2 EOC組織中miR-515-5p、CSPG4表達檢測 術中切除部分癌組織和癌旁部分正常組織（經病理檢查為正常組織），液氮冷凍后保存于－80 ℃冰箱中。取部分凍存組織，液氮下研磨成末，TRIzol法提取組織總RNA，鑒定RNA純度、濃度合格后，使用TaKaRa RNA PCR Kit試劑盒（北京寶日醫生物技術有限公司，編號：RR024A）合成cDNA。引物設計和合成由北京環中睿馳科技有限公司完成。miR-515-5p引物：正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；內參U6引物：正向引物5′-AGCGCCTTGACCTGGACA-3′，反向引物5′-TCGGCGTGCTCTGGAAAA-3′；CSPG4引物：正向引物5′-GTTGCATAGGTCCCTCGGTT-3′，反向引物5′-CGTAGCCAAAGACGAACATGC-3′；內參GAPDH引物：正向引物5′-GAGAAACCTGCCAAGTATGAT‐GAC-3′，反向引物5′-GGAGTTGCTGTTGAAGTCAC-3′。參考SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒（北京智杰方遠科技有限公司，編號：DRR041A）說明書和使用PCR儀（美國ABI，型號：ABI7500）進行擴增，反應條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，循環40次后收集Ct值，2-ΔΔCT法計算組織中miR-515-5p、CSPG4 mRNA相對表達量。根據EOC組織中miR-515-5p、CSPG4 mRNA表達均值分為高、低表達，統計EOC患者累積生存率。

1.3 統計學方法 采用SPSS28.0統計軟件。正態分布計量資料以表示，比較采用t檢驗；計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗；采用Pearson相關系數分析EOC組織中miR-515-5p與CSPG4 mRNA表達的相關性；Kaplan-Meier法繪制不同miR-515-5p、CSPG4 mRNA表達EOC患者生存曲線，組間生存率比較采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EOC組織與癌旁組織中miR-515-5p、CSPG4 mRNA表達比較 EOC組織與癌旁組織中miR-515-5p mRNA相對表達量分別為0.96 ± 0.22、1.23 ± 0.27，CSPG4 mRNA相對表達量分別為1.37 ± 0.33、1.06 ±0.21，EOC組織中miR-515-5p表達低于癌旁組織，CSPG4 mRNA表達高于癌旁組織（P均<0.05）。

2.2 EOC組織中miR-515-5p與CSPG4 mRNA表達的相關性 經TargetScan數據庫7.2https：//www.targetscan.org/預測，miR-515-5p與CSPG4的3′-非翻譯區210-216處存在結合位點（圖1）。Pearson相關系數分析顯示，EOC組織中miR-515-5p與CSPG4 mRNA表達呈負相關（r=-0.710，P<0.05）。

圖1 miR-515-5p與CSPG4的結合位點圖

2.3 miR-515-5p、CSPG4 mRNA表達與EOC病理特征的關系 miR-515-5p、CSPG4 mRNA表達與EOC分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移有關（P均<0.05）。見表1。

表1 EOC組織中miR-515-5p、CSPG4 mRNA表達與病理特征的關系

2.4 EOC組織中miR-515-5p、CSPG4 mRNA表達與預后的關系 84例EOC患者隨訪3～36個月，失訪4例，死亡36例，3年累積生存率為57.14%（48/84）。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，miR-515-5p高表達者（≥0.96，45例）累積生存率68.89%（31/45）高于低表達者（≥0.96，39例）的43.59%（17/39），兩者比較差異有統計學意義（χ2=7.462，P<0.05）；CSPG4 mRNA高表達者（≥1.37，43例）累積生存率44.19%（19/43）低于低表達者（≥1.37，41例）的70.73%（29/41），兩者比較差異有統計學意義（χ2=7.554，P<0.05）。

3 討論

EOC是源于卵巢上皮細胞的惡性腫瘤，早期癥狀以腹部腫大、腹脹、腹痛和內分泌失調為主，但絕大多數患者癥狀隱匿，臨床中超過70%的卵巢癌患者就診時已處于臨床晚期，已伴盆腔播散或淋巴結轉移，手術治療異常困難，即使多學科合作亦難以達到滿意的癌細胞減滅效果，且術后多次化療易反復復發，5年生存率僅40%［7］。盡管近年來隨著基因檢測的普及和靶向藥物“多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑”的應用，EOC患者生存期得以有效延長，但仍有部分患者難以獲得臨床效益，且獲得性耐藥和不良反應隨著治療時間的延長愈發常見［8］。

EOC的發生、發展是一個復雜和多因素共同參與的過程，近年隨著生命科學的快速發展，越來越多研究證實miRNA能通過引發信使核糖核酸的降解或轉錄后的基因沉默參與EOC發生、發展［9］。miR-515-5p定位于人染色體19q13.42，近年來大量研究報道與腫瘤有關。DING等［10］研究報道，miR-515-5p在結直腸癌中低表達，能靶向有絲分裂阻滯缺陷2樣蛋白1抑制結直腸癌細胞增殖并誘導其凋亡。LIU等［11］研究報道，miR-515-5p在前列腺癌中低表達，能靶向解整合素金屬蛋白酶10抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。上述研究提示miR-515-5p可能是一種抑癌基因。本研究結果顯示，EOC組織中miR-515-5p低表達，提示miR-515-5p低表達可能參與EOC發生，miR-515-5p在EOC組織中低表達可能與其啟動子甲基化有關［12］。本研究結果顯示，EOC組織中miR-515-5p表達與組織分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移和預后有關，進一步說明miR-515-5p低表達參與EOC發生發展，分析其機制可能與抑制白細胞介素-6（IL-6）表達有關。IL-6作為炎癥核心分子，能結合其受體調節激活多條信號通路促進EOC惡性進展［13］。申利等［14］報道，上調miR-515-5p能靶向抑制IL-6，進而抑制EOC細胞增殖、遷移和侵襲。

EOC的發生發展伴隨多條信號通路異常激活/失活，細胞外調節蛋白激酶1/2（ERK1/2）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）是EOC最常改變的信號通路［15］。CSPG4定位于人染色體15q24.2，最初于黑色素瘤中發現，CSPG4高表達能激活ERK1/2信號通路促進黑色素瘤增殖、運動、侵襲和抗凋亡［16］。后續研究發現，CSPG4的細胞內結構域能連接肌動蛋白細胞骨架，還能激活PI3K/Akt/mTOR，促進黑色素瘤惡性進展［17］。近年研究亦證實，CSPG4高表達與胰腺癌、肝癌、膠質瘤、腎癌等腫瘤進展有關［18］。本研究結果顯示，EOC組織中CSPG4 mRNA高表達，與組織分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移和預后有關，說明CSPG4 mRNA高表達參與EOC發生、發展，分析其機制與CSPG4升高能激活ERK1/2、PI3K/Akt/mTOR等信號通路，促進EOC細胞增殖、遷移和侵襲有關［17-18］。本研究通過網站預測發現，miR-515-5p與CSPG4的3′-非翻譯區210～216處存在結合位點，二者在EOC中的表達呈負相關，提示二者可能共同參與EOC進展。江紅等［19］研究報道，上調miR-515-5p能靶向下調CSPG4，抑制卵巢癌細胞增殖和轉移。本研究分析EOC患者預后發現，miR-515-5p高表達和CSPG4 mRNA低表達的EOC患者3年累積生存率升高，說明miR-515-5p、CSPG4 mRNA表達與EOC患者預后有關，可能成為EOC患者預后評估標志物。

綜上所述，EOC組織中miR-515-5p低表達和CSPG4 mRNA高表達與患者病理特征和預后相關，二者可能共同參與EOC進展，但本研究結果還需前瞻性多中心研究驗證。