基于TCGA數據庫分析胸苷酸合成酶基因在食管癌組織中的表達及臨床意義

張文君，陳清江，張旭東，唐燦偉，吳曉爽，李 沖，王妍杰，劉棟林，馬珊珊

(1.新鄉醫學院第三附屬醫院腫瘤科,河南 新鄉 453003;2.新鄉醫學院,河南 新鄉 453003; 3.鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科,河南 鄭州 450052)

食管癌(esophageal carcinoma,ESCA)是發生在食管上皮組織的惡性腫瘤,病死率高,為全球第6大癌癥死亡原因。據統計,我國2020年ESCA新發和死亡病例分別為32.4萬例、30.1萬例[1]。目前,化學治療、放射治療和手術治療是ESCA的主要治療措施,但經治療許多患者仍會出現疾病進展和復發。分子靶向治療是腫瘤治療領域的突破性和革命性的發展,相對于化學治療、放射治療和手術治療三大傳統治療手段更具有“治本”效果。新型分子標志物的研究對于ESCA的診斷、治療靶點確定及判斷預后具有重要意義,甚至可提高對發病機制的認識[2-3]。胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,TYMS)基因編碼蛋白是合成脫氧胸苷三磷酸(deoxy-thymidine monophosphate,dTMP)的限速酶,為葉酸代謝過程中重要的關鍵酶,在細胞增殖、分化及DNA合成方面起著關鍵作用;TYMS基因編碼蛋白可從CH2H4轉移亞甲基葉酸,催化脫氧胸苷二磷酸的還原甲基化,從而產生dTMP;而dTMP進一步磷酸化形成三磷酸(deoxythymidine triphosphate,dTTP),dTTP 是用于合成DNA的4種前體之一[4]。因此,在DNA的合成中TYMS基因表達起關鍵作用。TYMS功能紊亂可導致生物和遺傳學異常。目前認為,TYMS基因表達與胰腺癌[5]和非小細胞肺癌[6]等多種腫瘤的細胞增殖密切相關;但是,關于TYMS基因在ESCA中的表達及其與腫瘤免疫相關性的報道很少。基于此,本研究基于癌癥基因圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數據庫分析ESCA患者TYMS基因表達及其與臨床特征的關系,旨在為研究TYMS在ESCA早期診療中的價值提供參考。

1 資料與方法

1.1 數據來源

在TCGA數據庫中檢索并下載ESCA的原始轉錄組測序數據和患者的臨床信息。檢索時間:2022-06-01。檢索條件:(1)Cancer type:ESCA;(2)Gene:TYMS;(3)Data type:mRNA;(4)Analysis type:cancer vs.normal analysis;(5)Preferences:P-value<0.05。

1.2 方法

1.2.1 TYMS 基因表達情況與ESCA患者臨床特征關系分析

以TYMS表達水平將患者分為高表達組和低表達組,采用t檢驗和χ2檢驗分析在TCGA數據庫中檢索到的ESCA樣本和正常樣本TYMS基因表達情況,分析TYMS 基因表達情況與ESCA患者臨床特征的關系,

1.2.2 TYMS表達與ESCA患者預后關系分析

提取正常組織和腫瘤組織中TYMS基因表達相關的臨床信息,進行差異表達及配對分析;應用Cox回歸分析和預后列線圖對ESCA患者進行預后分析,應用Kaplan-Meier生存分析對TYMS表達情況和臨床性狀與ESCA患者生存時間的關系進行分析,應用受試者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線預測TYMS與ESCA預后的相關性。

1.2.3 免疫細胞浸潤水平與TYMS基因表達量的相關性分析

使用單樣本基因集合富集分析(single sample gene collection enrichment analysis,ssGSEA)評估腫瘤組織浸潤性免疫細胞的相對豐度,使用“GSVA”(R包)和免疫數據集分析ESCA相關基因表達譜中免疫細胞的浸潤水平,采用Spearman相關性和Wilcoxon秩和檢驗分析免疫細胞與高表達TYMS的相關性。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 ESCA組織與正常組織及配對癌旁組織中TYMS基因表達水平比較

共獲取173例樣本的臨床病理學資料,其中11例為正常樣本,162例為ESCA樣本。總樣本中,ESCA組織中TYMS基因表達水平顯著高于正常樣本,差異有統計學意義 (t=6.344,P<0.001),見圖1A;在8例配對ESCA和鄰近癌旁組織中,ESCA組織中TYMS基因表達水平顯著高于鄰近癌旁組織,差異有統計學意義(t=6.866,P<0.001),見圖1B。

A:總樣本中ESCA組織與正常組織中TYMS基因表達水平比較;B:8對匹配的ESCA組織和癌旁組織中TYMS基因表達水平比較。圖1 ESCA組織與正常組織及配對癌旁組織中TYMS基因表達水平比較Fig.1 Comparison of TYMS expression level between ESCA tissue and normal tissue and paired adjacent cancer tissue

2.2 TYMS高表達組與TYMS低表達組ESCA患者臨床特征比較

將ESCA樣本分為TYMS高表達組和TYMS低表達組。2組患者的臨床分期、病理分級、是否放射治療及是否為Barrett食管比較差異無統計學意義(P>0.05);2組患者的年齡、體質量及組織學分型比較差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 TYMS高表達組與TYMS低表達組ESCA患者臨床特征比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics of ESCA patients in high expression of TYMS group and low expression of TYMS group 例(%)

2.3 TYMS對ESCA的診斷價值

ROC曲線顯示,TYMS診斷ESCA的曲線下面積為0.949,95%置信區間(confidence interval,CI)為0.896～1.000,敏感度為0.909,特異度為0.791,見圖2。

圖2 TYMS診斷ESCA的ROC曲線Fig.2 ROC curve of TYMS in diagnosis of ESCA

2.4 TYMS基因高表達患者與低表達患者生存率的比較

TYMS基因高表達患者與TYMS基因低表達患者的總生存(overall survival,OS)率、疾病特異性生存(disease specific survival,DSS)率和無進展間隔(progress free interval,PFI)率比較差異無統計學意義(HR=0.940、1.040、0.980,P>0.05),見圖3。

A:ESCA患者OS率與TYMS表達的關系;B:ESCA患者DSS率與TYMS表達的關系;C:ESCA患者PFI率與TYMS表達的關系。圖3 TYMS表達與OS率的關系Fig.3 Relationship between TYMS expression and survival rate

2.5 不同臨床特征患者TYMS基因表達水平與OS率的關系

在84例體質量>70 kg的ESCA患者中,TYMS基因高表達患者的OS率顯著低于TYMS基因低表達患者,差異有統計學意義(P<0.05),見圖4A;在106例非Barrett食管疾病的ESCA患者中,TYMS基因高表達患者的OS率顯著低于TYMS基因低表達患者,差異有統計學意義(P<0.05),見圖4B。在不同T、N、M分期及病理分級、是否行放射治療、不同年齡段、食管癌、Barrett食管疾病及體質量≤70 kg患者中,TYMS基因高表達與TYMS基因低表達患者的OS率比較差異無統計學意義(P>0.05),見圖4C～4T。

A:體質量>70 kg的ESCA患者TYMS與OS率的關系;B.非Barrett食管ESCA患者TYMS與OS率的關系;C:T1期ESCA患者TYMS與OS率的關系;D:T2期ESCA患者TYMS與OS率的關系;E:T3期ESCA患者TYMS與OS率的關系;F:N0期ESCA患者TYMS與OS率的關系;G:N1期ESCA患者TYMS與OS率的關系;H:N2期ESCA患者TYMS與OS率的關系;I:M0期ESCA患者TYMS與OS率的關系;J:M1期ESCA患者TYMS與OS率的關系;K:病理分級II級ESCA患者TYMS與OS率的關系;L:病理分級III級ESCA患者TYMS與OS率的關系;M:病理分級IV級ESCA患者TYMS與OS率的關系;N:未行放射治療ESCA患者TYMS與OS率的關系;O:行放射治療ESCA患者TYMS與OS率的關系;P:≤60歲患者ESCA患者TYMS與OS率的關系;Q:>60歲患者ESCA患者TYMS與OS率的關系;R:體質量≤70 kg的ESCA患者TYMS與OS率的關系;S:食管鱗狀細胞癌ESCA患者TYMS與OS率的關系;T:Barrett食管ESCA患者TYMS與OS率的關系。圖4 不同臨床特征ESCA患者TYMS基因表達水平與OS率的關系Fig.4 Relationship between expression level of TYMS and OS rate in ESCA patients with different clinical characteristics

2.6 ESCA生存率預測列線圖

從ESCA患者體質量及非Barrett食管ESCA患者2個方面,構建TYMS水平預測ESCA患者生存列線圖,圖中顯示隨總分值的增加,1、2、3 a生存率下降,見圖5A。該預測模型的校準曲線顯示,預后列線圖的C指數達到0.563(0.474～0.650),所建立的1、2、3 a存活曲線與理想存活曲線匹配,見圖5B。

A:預測ESCA患者1、2、3 a生存率的列線圖;B:列線圖的校準曲線圖。圖5 TYMS預測ESCA患者1、2、3 a生存率的列線圖和校準曲線圖Fig.5 Column and calibration plots of TYMS in predicting 1,2 and 3 years survival rates of ESCA patients

2.7 ESCA患者OS率影響因素的單因素和多因素Cox回歸分析

單因素分析顯示,M期、N期和初次治療結果與ESCA患者的OS率相關(P<0.05),TYMS基因表達量與ESCA患者的OS率無關(P>0.05),見表2。多因素分析顯示,腫瘤分期M期、N期是影響ESCA患者生存期的獨立危險因素(P<0.05),見表3。

表2 ESCA患者OS率影響因素的單因素Cox回歸分析Tab.2 Univariate Cox regression analysis of influencing factor of OS rate in ESCA patients

表3 ESCA患者OS率影響因素的多因素Cox回歸分析Tab.3 Univariate Cox regression analysis of influencing factor of OS rate in ESCA patients

2.8 TYMS表達量與免疫浸潤的相關性分析

在162例ESCA患者中,TYMS的表達水平與肥大細胞(r=0.302,P<0.05)、嗜酸性粒細胞(r=0.244,P<0.05)、樹突狀細胞(dendritic cell,DC)(r=0.256,P<0.05)和輔助性T細胞17(T helper cell 17,Th17)細胞的富集(r=0.270,P<0.05)呈負相關,見圖6。

圖6 ESCA患者TYMS表達水平與免疫細胞浸潤水平的關系Fig.6 Relationship between the expression level of TYMS and the infiltration level of immune cells in ESCA patients

3 討論

ESCA是發生在食管上皮組織的惡性腫瘤,與環境、生活習慣及遺傳等因素相關[7],占所有惡性腫瘤的2%。我國ESCA的病死率位居惡性腫瘤的第6位[8],5 a生存率僅20%[9]。盡管關于食管癌的手術切除和新輔助治療技術不斷改進,但食管癌的OS率仍低于其他實體瘤,且僅有不到20%的晚期ESCA患者受益于新輔助治療;因此,尋找有效的ESCA生物標志物,可提高診斷和治療效率,甚至提高對發病機制的認識[10]。

TYMS是細胞分裂中的關鍵蛋白質,是嘧啶“從頭”合成的限速酶,對于DNA復制至關重要[11],在細胞有絲分裂間期,需要dTMP對DNA進行復制、修復,在細胞快速分裂中的作用至關重要;抑制TYMS會導致核苷酸失衡,從而導致細胞死亡,因此TYMS基因在細胞的增殖和存活方面起著至關重要的作用,TYMS基因的異常表達則可能導致惡性腫瘤的發生。目前研究證實,TYMS基因在胰腺癌[5]、乳腺癌[12]、非小細胞肺癌[13]以及前列腺癌[14]中高表達。本研究結果顯示,總樣本中,ESCA組織中TYMS表達水平顯著高于正常樣本;在8例配對ESCA組織和鄰近癌旁組織中,ESCA組織中TYMS表達水平顯著高于鄰近癌旁組織;說明TYMS基因在ESCA組織中呈高表達,該結果與其在其他腫瘤中報道的結果一致[5,12-14]。有研究表明,TYMS基因存在多態性,TYMS基因的表達受多態性的影響,TYMS基因多態性可能是評估腫瘤易感性的重要指標[15],即TYMS基因多態性可能為可靠的診斷指標,但并非可靠的預后指標。徐望紅[16]研究報道,TYMS rs3819102的變異等位基因增加子宮內膜癌的發病風險,但與預后無直接關聯。有研究報道,位于microRNA結合位點的3種SNP的TYMS等位基因和TYMS基因單體型的表達可提示ESCA高發病風險,但與患者的OS無關[17]。本研究結果顯示,TYMS診斷ESCA的曲線下面積為0.949,95%CI為0.896～1.000,敏感度為0.909,特異度為0.791,說明TYMS對ESCA具有較高的診斷價值。但是,本研究結果顯示,TYMS高表達患者與TYMS低表達患者的OS率、DSS率和PFI率比較差異無統計學意義,說明TYMS高表達對ESCA患者的OS率、DSS率及PFI率無明顯影響,這可能與TYMS基因的多態性相關,與上述報道基本一致[15-17],具體機制需進一步驗證。

研究表明,肥胖個體的血漿中腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6等促炎細胞因子和脂肪因子的異常,可促進ESCA的發展[18]。研究證實,肥胖個體的可溶性腫瘤壞死因子受體2、抵抗素、纖溶酶原激活物抑制劑1、C-反應蛋白和血清淀粉樣蛋白A已被確定為肥胖-食管腺癌相關性的潛在介質[19]。Barrett食管是一種食管疾病,通常由長期的胃食管反流引起。這種疾病會導致食管黏膜發生變化,從而增加了患上食管癌的風險。本研究單因素和多因素Cox分析結果顯示,TYMS基因表達水平與ESCA患者的OS率無關;但在84例體質量>70 kg的ESCA患者中,TYMS高表達患者的OS率顯著低于TYMS低表達患者;在非Barrett食管疾病的ESCA患者中,TYMS高表達患者的OS率顯著低于TYMS低表達患者;這說明,在體質量大、非Barrett食管的ESCA患者中TYMS是不良預后的影響因素,提示TYMS高表達可能為體質量大、非Barrett食管ESCA患者具有較高預后評估價值的生物標志物,但具體機制需進一步驗證。此外,本研究從ESCA患者體質量及非Barrett食管ESCA患者2個方面構建TYMS水平預測ESCA患者生存列線圖,結果顯示,隨總分值的增加,1、2、3 a生存率下降;該預測模型的校準曲線顯示,預后列線圖的C指數達到0.563(0.474～0.650),所建立的1、2、3 a 存活曲線與理想存活曲線匹配,表明該模型在預測ESCA患者OS方面具有一定的潛力。

近年來,在癌癥發生發展中,免疫細胞的作用受到廣泛關注[20]。研究表明,肥大細胞通過調節腫瘤的生物學過程如細胞增殖和存活、血管生成、侵襲和轉移,在腫瘤微環境中發揮多方面的作用[21];嗜酸性粒細胞浸潤多個腫瘤,并能夠通過與腫瘤細胞相互作用直接或通過塑造腫瘤微環境間接調節腫瘤進展[22];DC作為最有效的抗原呈遞細胞在抗腫瘤免疫反應的啟動、進展和誘導方面起關鍵作用。大量研究表明,在多種腫瘤類型中都存在腫瘤浸潤性DC[23];Th17細胞產生高水平IL-17,增強自然殺傷細胞和細胞毒性T淋巴細胞功能,通過激活腫瘤血管生成來產生抗腫瘤作用并促進腫瘤發展[24]。本研究結果顯示,ESCA患者TYMS的表達水平與肥大細胞、嗜酸性粒細胞、DC和Th17細胞的表達量呈負相關,說明TYMS高表達會引起肥大細胞、嗜酸性粒細胞、DC和Th17細胞表達量下降,提示TYMS可能在調節ESCA免疫微環境中發揮重要作用,TYMS基因高表達會不同程度地促進腫瘤發展,然而,TYMS影響ESCA腫瘤免疫微環境和腫瘤進展的具體機制仍不清楚。

4 結論

TYMS基因在ESCA組織中呈高表達,其可在調節ESCA免疫微環境中發揮重要作用,不同程度地促進腫瘤發展;且TYMS可作為ESCA的診斷和部分類型ESCA患者預后預測的潛在生物標志物。但本研究存在一些問題:(1)TCGA數據庫中包含的樣本量較少,仍需要納入更多的數據以提高結果的可靠性;(2)ESCA是惡性程度較高的腫瘤之一,并非某一個基因就可以對其預后起到決定性作用的,TYMS基因存在多態性,很可能會受到其他因素影響;(3)本模型以TCGA數據庫為基礎構建,缺少亞洲人群的轉錄組數據,在預測國人生存期方面的準確性較差;(4)此次研究TYMS基因的分子生物功能為生物信息預測工具所得,尚需要實驗進一步驗證。