超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測毛發(fā)中3種新精神活性物質(zhì)

祁觀,仇文璞,白登文,柴一麟,楊淑頤,楊麗

(四川省毒品監(jiān)測技術(shù)中心(國家毒品實驗室四川分中心),四川 成都 610000)

合成大麻素是新型精神活性物質(zhì)(New Psychoactive Substances,NPS)中濫用最嚴(yán)重、更新迭代最快的一類毒品,其種類占已知新精神活性物質(zhì)的31.2%[1]。

與傳統(tǒng)毒品四氫大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol,Δ9-THC)相類似,合成大麻素進(jìn)入人體后與CB1和CB2受體結(jié)合,入體后能夠模擬△9-THC發(fā)揮作用且效力更顯著,致幻性更強(qiáng),有更好的成癮性效果[2-5]。因為其隱蔽、低廉且難以被檢測,常被用作傳統(tǒng)毒品的替代品進(jìn)行吸食,并且常被不法分子通過互聯(lián)網(wǎng)渠道銷售,常見形態(tài)有電子煙油、草藥、香料等[6-7]。與此同時,近年來濫用合成大麻素的人數(shù)激加,導(dǎo)致急性中毒或死亡的案件越來越多,對人口的健康和公共安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。合成大麻素是我國第一批受到管制的新型精神活性物質(zhì)[8-9],對合成大麻素類新精神活性物質(zhì)的進(jìn)一步監(jiān)測和精細(xì)化管理迫在眉睫。

近年來,國內(nèi)外出現(xiàn)采用GC-MS、LC-MS/MS、UPLC-HR-MS對尿液、血液、體外肝微粒體中合成大麻素類物質(zhì)經(jīng)過液相萃取、固相萃取等方法處理后進(jìn)行檢測的報道[10-14],也有采用GC-MS、GC-MS/MS、LC/MS/MS對毛發(fā)檢測的報道[15-18],但涵蓋物質(zhì)種類有限,難以滿足實際案件檢驗鑒定需求。本文建立了一種靈敏、準(zhǔn)確、高效的毛發(fā)中合成大麻素的檢測方法,對肅清毒情隱患、服務(wù)禁毒大局具有重要意義。

由于合成大麻素在人體內(nèi)廣泛代謝,尿液、血液和唾液中幾乎沒有原型,因而針對毒品原型的檢測方法極易導(dǎo)致該類毒品無法被檢出,造成假陰性的結(jié)果[19]。毛發(fā)作為一種特殊的載體,在吸毒檢驗方面與尿液、血液、唾液等相比有不可比擬的優(yōu)勢:它檢測窗口長,易收集和保存,無損傷性,不易摻假,靈敏度高,可長時間保留吸毒信息,同時,可以反映吸毒的時間范圍、吸毒的程度和吸毒的變化,可以提供吸毒者長期用藥情況,且可以避免暫時性藥物切斷或摻假毛的干擾。

毒品及其代謝物在毛發(fā)檢材中的分布具有特殊性,人類頭發(fā)是由角質(zhì)層衍生而來的獨(dú)特基質(zhì),其主要成分是角蛋白,按照血液中的毒品及其代謝物通過擴(kuò)散進(jìn)入毛囊的機(jī)制,血液中的毒品及其代謝物進(jìn)入毛發(fā)中的能力是不同的。毒品及其代謝物進(jìn)入毛發(fā)是在毛發(fā)形成期間,并且可以隨著毛發(fā)生長進(jìn)入發(fā)干[20]一般脂溶性強(qiáng)(極性小)的組分進(jìn)入毛發(fā)的能力強(qiáng),因此,毛發(fā)中的毒品及其代謝物的分布與血液、尿液中的分布不同,毛發(fā)中的毒品多以母體形式存在,代謝物的含量相對較低[21],正是由于毛發(fā)檢材的獨(dú)特優(yōu)勢,使毛發(fā)檢測成為對合成大麻素類新精神活性物質(zhì)監(jiān)測最理想的檢測手段[22]。

筆者所在實驗室近1年來接收合成大麻素類相關(guān)案件數(shù)百例,其中最常見的為N-(1-氨甲酰基-2,2-二甲基丙基)-1-丁基吲唑-3-甲酰胺(ADB-BUTINACA)、1-戊基吲哚-3-甲酸-8-喹啉酯(PB-22)、N-(1-氨基-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)-1-(4-戊烯-1-基)-1H-吲唑-3-甲酰胺(ADB-4en-PINACA)3種合成大麻素類新精神活性物質(zhì)。基于實際案件需要,設(shè)計本實驗。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC I-Class TQ-XS 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國 Waters 公司);Milli-Q Advantage 超純水系統(tǒng);YETO Vortex-2旋渦混合器;SCINTZ SB-5200D超聲波清洗器。

標(biāo)準(zhǔn)品:ADB-BUTINACA,ADB-4en-PINACA,PB-22(國家毒品實驗室);甲醇(色譜純,Thermo Fisher Scientific);乙腈(色譜純,Thermo Fisher Scientific);甲酸(色譜純,Thermo Fisher Scientific);超純水;空白毛發(fā)樣品采集自10名無吸毒史的健康志愿者(男女性各5名,平均年齡26歲),用于制備校正曲線和質(zhì)量控制(Quality Control,QC)樣品。ADB-BUTINACA毛發(fā)實際樣品(案件中繳獲)。

1.2 色譜-質(zhì)譜條件

1.2.1 色譜條件

選用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm ×100 mm,1.7 μm);A相(0.1%甲酸-水緩沖液);B相(0.1%甲酸-乙腈);流速0.4 mL/min;柱溫40 ℃;洗脫梯度見表1。

表1 色譜洗脫梯度

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子化源模式:ESI+;霧化溫度:450 ℃;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測方式(MRM);毛細(xì)管電壓:3.00 kV;脫溶劑氣流量:800 L/h;碰撞氣流量:0.15 mL/min;錐孔電壓:20 V。各化合物參數(shù)見表2。

表2 3種化合物的質(zhì)譜參數(shù)T

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液與質(zhì)控樣的制備

3種NPS標(biāo)準(zhǔn)品均取適量溶于甲醇中,配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的一級儲備液,儲存于冰箱(-20 ℃)中備用。取3種NPS的儲備液各適量,用甲醇稀釋成各組分質(zhì)量濃度均為200 ng/mL的二級儲備液。取二級儲備液適量,加入等體積的A相緩沖液,配置成各NPS組分質(zhì)量濃度均為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。取等體積的A相緩沖液與甲醇配置成稀釋液,以100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液為第一級使用稀釋液逐級稀釋,配置成0.2～40 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

1.4 樣品前處理

取頭發(fā)置于蒸發(fā)皿中,用含0.1%十二烷基磺酸鈉水溶液、去離子水、甲醇依次清洗,將蒸發(fā)皿中頭發(fā)置于通風(fēng)櫥晾干,最后一次清洗液留存分析。稱取頭發(fā)20 mg裝入破碎管,加入1 mL提取液(甲醇)。將破碎管放入研磨儀冷凍研磨5 min后,加入1 mL 0.1%甲酸水溶液,混勻,冰浴超聲30 min后提取,經(jīng)0.22 μm有機(jī)膜過濾后分析。

采用相同步驟做空白毛發(fā)試驗。

2 定性實驗方案及結(jié)果確認(rèn)

2.1 選擇性

2.1.1 目的

測試不同毛發(fā)基質(zhì)和各種常見毒品是否會對ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22的定性分析造成干擾。

2.1.2 實驗方案

選取3種不同來源的空白毛發(fā)分別測定后按定性評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定,確認(rèn)不同空白基質(zhì)是否導(dǎo)致假陽性情況。

將ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入空白毛發(fā)中,經(jīng)前處理后得到ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22質(zhì)量濃度為20 ng/mL的溶液,分別測定后按定性評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定,確認(rèn)各物質(zhì)是否會對除本身外其他2種目標(biāo)物的分析導(dǎo)致假陽性情況。

2.1.3 實驗結(jié)果

選擇性實驗結(jié)果見表3。

表3 選擇性實驗結(jié)果

由表3可知:空白毛發(fā)基質(zhì)不會對ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22等3種目標(biāo)物的定性分析造成干擾;ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22等3種目標(biāo)物均不會對毛發(fā)中除本身以外的其他目標(biāo)物的定性分析造成干擾。

2.2 檢出限

2.2.1 目的

測試毛發(fā)中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22能被準(zhǔn)確定性的最低濃度。

2.2.2 實驗方案

將ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入空白毛發(fā)中,經(jīng)前處理后得到ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22的5個不同質(zhì)量濃度的溶液,分別為0.01,0.02,0.05,0.1和0.2 ng/mL,每個濃度重復(fù)測定10次,按定性評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定,確認(rèn)各濃度的陽性檢出率,以陽性率100%的最低濃度作為定性檢出限。

2.2.3 實驗結(jié)果

檢出限實驗結(jié)果見表4。

表4 檢出限實驗結(jié)果

由表4可知:ADB-BUTINACA最低檢出限為:0.1 ng/mL,ADB-4en-PINACA最低檢出限為:0.2 ng/mL,PB-22最低檢出限為:0.05 ng/mL。

2.3 穩(wěn)健度

2.3.1 目的

測試實驗中合理變化因素對定性結(jié)果的影響。

2.3.2 實驗方案

將ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入空白毛發(fā)中,經(jīng)前處理后得到PB-22質(zhì)量濃度為0.05 ng/mL的溶液1 份,ADB-BUTINACA質(zhì)量濃度為0.1 ng/mL的溶液1 份,ADB-4en-PINACA質(zhì)量濃度為0.2 ng/mL的溶液1份提取液放置24 h后再進(jìn)行測定。

2.3.3 實驗結(jié)果

穩(wěn)健度實驗結(jié)果見表5。

表5 穩(wěn)健度實驗結(jié)果

由表5可知:樣品提取溶劑放置24 h對定性結(jié)果不會造成影響。

3 定量實驗方案及結(jié)果確認(rèn)

3.1 定量限和線性范圍

3.1.1 目的

測試毛發(fā)中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22能被確定量的最低濃度,以及ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22的色譜峰面積與濃度呈線性關(guān)系的濃度范圍。

3.1.2 實驗方案

將ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入空白毛發(fā)中,經(jīng)前處理后得到含ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22的8個校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)濃度點溶液,分別為0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10,20,40 ng/mL,每個校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)濃度點重復(fù)測定10次,計算各濃度點的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD,確定RSD小于15%的最低濃度。以所有RSD小于15%的濃度為橫坐標(biāo)、各濃度點測得的面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線采用線性回歸,權(quán)重1/X。如果線性回歸相關(guān)系數(shù)r大于0.998,且所有濃度擬合相對誤差小于15%,則參與擬合的最低濃度為定量限,最低濃度至最高濃度為線性范圍。如果線性回歸相關(guān)系數(shù)小于0.998,或存在某個濃度擬合相對誤差大于10%或在最低定量限附近RSD大于15%,則應(yīng)舍去最低濃度,重新進(jìn)行線性回歸直至符合要求為止。

3.1.3 實驗結(jié)果

各濃度點測定結(jié)果精密度分析結(jié)果見表6,線性范圍分析結(jié)果見表7。

表6 各濃度點測定結(jié)果精密度分析

表7 線性范圍分析

由表6、7可知,ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22最低定量限均為:0.2 ng/mL,在 0.2～40 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,R2均大于0.998。

3.2 準(zhǔn)確度

3.2.1 目的

測試毛發(fā)中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22的定量結(jié)果是否存在偏倚。

3.2.2 實驗方案

將ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入空白毛發(fā)中,經(jīng)前處理后得到ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22質(zhì)量濃度為0.2,6,50 ng/mL的溶液,每個濃度點平行測定10次。準(zhǔn)確度為測定平均值與參照值的百分比,其值應(yīng)在90%～110%范圍內(nèi),在最低定量限附近可在85%～115%范圍內(nèi)。

3.2.3 實驗結(jié)果

準(zhǔn)確度實驗結(jié)果見表8。

表8 準(zhǔn)確度實驗結(jié)果

由表8可知:ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22各濃度點準(zhǔn)確度均滿足要求。

3.3 重復(fù)性

3.3.1 目的

測試毛發(fā)中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22在重復(fù)性測量條件下測定結(jié)果的精密度。

3.3.2 實驗方案

將ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入空白毛發(fā)中,經(jīng)前處理后得到ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22質(zhì)量濃度為0.2,6,40 ng/mL的溶液。由同一實驗人員使用同一儀器對樣品平行測定10次,計算10次測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD應(yīng)小于10%,在最低定量限附近RSD可小于15%。

3.3.3 實驗結(jié)果

重復(fù)性實驗結(jié)果見表9。

表9 重復(fù)性實驗結(jié)果

由表9可知:ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22各濃度點重復(fù)性均滿足要求。

3.4 提取回收率

3.4.1 目的

測試毛發(fā)中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22測定結(jié)果的提取回收率。

3.4.2 實驗方案

將ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入空白毛發(fā)中,經(jīng)前處理后得到質(zhì)量濃度為0.2和40 ng/mL的ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22溶液,每個濃度點6個平行樣本,記錄峰面積,計算6份樣本平均峰面積Aa。分別利用空白毛發(fā)提取液配制對應(yīng)濃度的分析物,每個濃度點6個平行樣本,記錄檢測峰面積,計算6份樣本平均峰面積Ab,提取回收率=Aa/Ab。提取回收率應(yīng)在85%～115%范圍,在最低定量限附近可在80%～120%范圍。

3.4.3 實驗結(jié)果

回收率實驗結(jié)果見表10。

表10 回收率實驗結(jié)果

由表10可知:ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22回收率在94.63%～100.4%范圍內(nèi)。

3.5 基質(zhì)效應(yīng)

3.5.1 目的

測試毛發(fā)中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22測定結(jié)果的基質(zhì)效應(yīng)。

3.5.2 實驗方案

分別利用空白毛發(fā)提取液配制質(zhì)量濃度為0.2和40 ng/mL的ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22溶液,每個濃度點6個平行樣本,記錄檢測峰面積,計算6份樣本平均峰面積Ab。配制質(zhì)量濃度為0.2和40 ng/mL的ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,每個濃度點6 個平行樣本,記錄峰面積,計算6份樣本平均峰面積Ac,基質(zhì)效應(yīng)=Ab/Ac。基質(zhì)效應(yīng)應(yīng)在50%～150%范圍。

3.5.3 實驗結(jié)果

基質(zhì)效應(yīng)實驗結(jié)果見表11。

表11 基質(zhì)效應(yīng)實驗結(jié)果

由表11可知:ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22基質(zhì)效應(yīng)在93.47%～130.27%范圍內(nèi)。

4 實驗結(jié)論

本實驗定性檢測的選擇性和穩(wěn)健度,定量檢測的選擇性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)等特性參數(shù)均達(dá)到預(yù)期要求。本方法檢出限、定量限、線性范圍如表12所示。

表12 實驗結(jié)論

該方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、適用性廣等突出特點,能夠滿足相關(guān)合成大麻素在毛發(fā)中定性定量分析的要求,可以為相關(guān)案件中毛發(fā)中的新精神活性物質(zhì)的檢驗鑒定提供借鑒。對于打擊毒品犯罪、服務(wù)和保障人民群眾的人身安全以及維護(hù)社會穩(wěn)定具有重要的意義。

5 實際案例分析

將3份嫌疑人毛發(fā)樣品經(jīng)甲醇提取液破碎溶解后,與0.1%甲酸水溶液按1∶1體積比例,渦旋混勻后超聲10 min,經(jīng)0.22 μm 濾膜后,上機(jī)測試,在該檢材中檢出ADB-BUTINACA成分,樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間相對偏差小于2%,樣品的定性離子和定量離子的相對離子豐度比在標(biāo)準(zhǔn)品相對離子豐度比率±10%范圍內(nèi)。經(jīng)定量計算后,三位嫌疑人毛發(fā)中ADB-BUTINACA的含量為0.03,0.42,3.01 ng/mg。ADB-BUTINACA 20 ppb標(biāo)準(zhǔn)品和三份毛發(fā)案件樣品色譜圖如圖1所示。

圖1 ADB-BUTINACA 20 ppb標(biāo)準(zhǔn)品和三份毛發(fā)案件樣品色譜圖