桃紅四物湯治療肢體缺血再灌注損傷的作用機制探討*

程群，朱付平

1 湖南中醫藥大學 湖南長沙 410208

2 湖南中醫藥大學第一附屬醫院 湖南長沙 410007

肢體缺血-再灌注損傷（limb ischemia reperfusion injury，LI-RI），是指肢體在血流減少或停止后，肢體的血流恢復，肌肉等組織的受損傷程度更加嚴重的一種綜合征[1]，是骨科疾病中致殘、致死率較高的疾病之一。[2]西醫治療手段以消炎、止痛、消腫為主，對LI-RI治療效果一般。中醫認為LI-RI辨病屬于股腫、脈痹等范疇，與氣行不暢，血瘀脈中有關。[3]隨著中醫的發展，中醫藥在此病的治療方面表現出一定的優勢。有研究表明[4-5]桃紅四物湯可以減輕炎癥反應，改善血液循環，對LI-RI有著不錯的治療效果。桃紅四物湯作為治療LI-RI的有效方，其作用機制尚不清楚。本研究采用網絡藥理學方法研究桃紅四物湯治療LI-RI的作用機制，為臨床用藥和基礎研究提供一定理論依據。

資料與方法

1 桃紅四物湯有效成分和靶點的搜集

在中藥系統藥理數據庫和分析平臺[6]（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）中，以口服生物利用度（OB）≥30% 和類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，分別篩選出桃紅四物湯中桃仁、紅花、熟地黃、當歸、白芍、川芎六位中藥的有效成分，然后用Uniprot數據庫[7]查找與其相對應的官方基因名稱，得到并整理數據后，將整理好的數據導入Cytoscape3.8.2[8]軟件得到“成分-靶點”網絡。

2 LI-RI靶點的搜集及韋恩圖的繪制

以“Limb ischemia-reperfusion injury”“ischemiareperfusion injury”為關鍵詞，在Gen eCards數據庫[9]、OMIM數據庫中[10]，檢索與肢體缺血-再灌注損傷有關靶點，得到相關疾病基因靶點。將藥物基因名稱與疾病基因名稱整理、去重后，運用Venny2.1平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），繪制韋恩圖，得到藥物-疾病的交集基因。

3 PPI網絡構建

將得到的交集基因輸入到STRING 11.5（https：//cn.string-db.org/）數據庫[11]中，設置物種為“Home sapiens”（人類），得到PPI網絡圖和TSV文件，將TSV文件導入到Cytoscape3.8.2軟件中進行分析，得到核心靶點。

4 GO富集及KEGG信號通路富集分析

將得到的交集基因靶點導入到Metascape（https：//metascape.org/）數據庫中[11]，設置物種為“Home sapiens”（人類），進行GO富集和 KEGG 信號通路富集分析。GO分析包括生物過程（Biological Process，BP）、細胞組分（Cellular Components，CC）、分子功能（Molecular Functions）。利用微生信在線平臺繪制富集分析柱狀圖、氣泡圖。

5 主要有效成分與核心靶點分子對接

將得到的主要有效成分和核心靶點進行整理，核心靶點的蛋白結構從PDB 蛋白數據庫[12]（http：//www.pdb.org）下載；有效成分的化合物結構在Pub-Chem數據庫[12]（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載，然后使用 Autodock Vina軟件進行分子對接，去驗證桃紅四物湯治療LI-RI的可能核心靶點的準確性。

結 果

1 桃紅四物湯活性成分及靶點

在TCMSP數據庫中通過篩選，共得到69個有效成分，桃仁23個，熟地黃2個，當歸2個，白芍13個，紅花22個，川芎7個。以OB值排名前20為例，見表1。在Uniprot數據庫查找與其相對應的官方基因名稱共240個。

表1 桃紅四物湯中部分有效成分

2 成分-靶點圖的構建與分析

將搜集到的240個基因，去重、整理數據后，將數據導入Cytoscape3.8.2軟件，得到成分-靶點網絡圖，見圖1。該網絡包含310個節點，909條邊，其中菱形表示靶點基因，圓形表示有效成分，正三角形表示藥物。然后運用“Analyze Network ”功能進行拓撲分析，得到度值（ Degree） 排名前三的有效成分為quercetin（槲皮素）、kaempferol（山柰酚）、luteolin（木犀草素），推測這三個成分可能是桃紅四物湯治療LI-RI的主要有效成分。

圖1 成分-靶點網絡

3 桃紅四物湯治療LI-RI的靶點

在GeneCards、OMIM數據庫對肢體缺血-再灌注損傷或缺血再灌注損傷進行檢索得到相關靶點1211個，與桃紅四物湯共同靶點基因133個，運用Venny2.1平臺，繪制得到藥物-疾病的韋恩圖。見圖2。

圖2 桃紅四物湯與LI-RI共同靶點

4 PPI網絡構建

將得到的133個交集基因，導入到STRING 11.5數據庫中，得到PPI網絡圖與TSV文件，PPI網絡中含有132個節點（隱藏了1個不參與網絡的節點），2551條相互作用線，見圖3；將TSV文件導入到Cytoscape3.8.2軟件中，運用“Network analyze”功能進行拓撲分析，得到排名前11的為核心靶點，見圖4（X 軸表示度值，Y 軸表示靶點名稱）。degree值越大，證明該節點在網絡中發揮的作用越重要。

圖3 桃紅四物湯治療LI-RI靶點PPI網絡

圖4 PPI網絡中排名前11的關鍵靶點

5 GO富集分析

將得到的133個交集基因靶點導入到Metascape平臺中，進行GO富集，得到生物過程1788個，細胞組分100個，分子功能152個，整理數據后得到排名前20的生物過程（Biological Process，BP）、細胞組分（Cellular Components，CC）、分子功能（Molecular Functions，MF）。然后利用微生信在線繪制富集分析柱狀圖。見圖5（X軸表示 GO 分析條目，Y軸表示富集分數）。BP富集包括對脂多糖的反應、炎癥反應、細胞凋亡反應、平滑肌細胞增殖調節等。CC富集包括膜筏、細胞外基質、細胞器外膜、內質網腔等。MF富集包括DNA結合轉錄因子、蛋白激酶結合腫、瘤壞死結合因子受體結合、抗氧化活性等。將GO富集排名前20條目，用氣泡圖表示，見圖6（氣泡越大表示基因越多，顏色越深表示P值越大） 。

圖5 GO富集分析分類

圖6 GO分析氣泡

6 KEGG信號通路富集分析

將得到的133個交集基因靶點導入到Metascape平臺中，進行KEGG富集，分析得到202條信號通路，主要包括AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等，整理數據后得到排名前20的信號通路，利用微生信在線繪制富集分析柱狀圖，見圖7（Y軸表示信號通路，X軸表示基因數目）。選取關鍵通路并整理數據后，數據導入Cytoscape3.8.2軟件得到“靶點-信號通路”網絡，見圖8（藍色六邊形表示通路，黃色菱形表示靶點）。

圖7 KEGG通路富集分析

圖8 靶點-通路網絡

7 分子對接結果

將得到主要有效成分槲皮素、山柰酚、木犀草素與核心靶點ALB、TNF、AKT1進行對接，對接分數見表2。運用 Pymol 軟件對結果進行輸出優化，見圖9。結合能越低，表示靶點蛋白與有效成分結合能力越強[13]。

圖9 有效成分與核心靶點的分子對接

表2 主要有效成分與核心靶點對接情況

討 論

LI-RI的臨床表現為肢體皮膚蒼白、腫脹、疼痛，更嚴重的會導致截肢或者死亡。中醫根據其臨床表現認為其病機主要是氣行不暢，血瘀脈中[14]。一般以活血化瘀、理氣通絡為治法[15]，治療后氣血通暢，筋骨肌肉得到濡養，臨床癥狀可以得到好轉。活血化瘀經典方桃紅四物湯具有活血化瘀，祛瘀通絡的作用。同時桃紅四物湯具有抗炎、止痛、消腫的功效[16-17]，符合西醫治療LI-RI的原則。申震等[18]發現桃紅四物湯可以減輕LI-RI中的炎癥反應及其細胞凋亡率。

通過TCMSP數據庫檢索出桃紅四物湯主要有效成分，對藥物-成分靶點網絡進行拓撲分析，發現排名前三的有效成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素。有研究表明[19]，槲皮素可以直接抑制炎癥因子（TNF-α、IL-6等）的分泌，也可以通過抑制核因子κB的表達，來抑制炎癥介質的分泌。山奈酚是一種黃酮類化合物，有研究證實[20-22]其具有抗氧化、抗炎、改善血液動力學作用。沈瑞明等[23]發現木犀草素可以舒張血管，影響纖維細胞增殖和分化。

通過PPI網絡篩選得到degree值排名前3位分別是是ALB（白蛋白）、TNF（腫瘤壞死因子）、AKT1（蘇氨酸-蛋白激酶）。ALB具有維持血液滲透壓、具有抗休克、調節細胞凋亡、減輕水腫、抗凝等功能，ALB水平下降，則機體免疫功能受損，淋巴細胞數量下，吞噬作用減弱，并影響組織代謝及其功能[24]，導致LI-RI患者肢體水腫等癥狀。TNF可以通過NF-κB、MAPK 信號通路刺激炎癥反應的發生[25]，加重LI-RI的疼痛、組織壞死等臨床癥狀。申震等[26]研究發現腫瘤壞死因子α與LI-RI有密切關系，則血清中TNFα的表達水平可以作為評估LI-RI的臨床指標。

桃紅四物湯治療LI-RI的GO富集和KEGG信號通路富集分析得出，其中生物過程與分子功能都與炎癥反應、細胞凋亡、信號通路等有關，在治療LI-RI中起重要作用。KEGG信號通路分析發現桃紅四物湯治療LI-RI可能與AGE-RAGE、TNF、IL-17等信號通路有關。

AGE-RAGE信號通路[27]通過細胞內氧化應激反應激活NF-κB信號通路[28]，誘導多種炎癥因子的表達增加，促進細胞的增殖、分化與凋亡。有研究表明桃紅四物湯可以降低LI-RI中的細胞凋亡率[16]。TNF信號通路參與許多細胞活動，例如炎癥反應、細胞凋亡等[29]，亦可以對其他通路起激活作用，誘發連鎖反應，導致LI-RI患者的疼痛產生或加劇[30]。IL-17信號通路的激活，與炎癥因子的產生、免疫應答有關，可以導致多種炎癥反應的發生和自身免疫疾病的形成[31-33]。

通過分子對接可以看到有效成分與核心靶點的結合能均≤-6kcal/mol，對接最穩定是木犀草素與ALB的結合（-9.8kcal/mol），所有的結合位點均有穩定的氫鍵、疏水鍵，構建穩定，分子結果表示桃紅四物湯有效成分能與受體蛋白穩定結合，對LI-RI有治療作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學與分子對接方法，對桃紅四物湯治療LI-RI的作用機制進行了探討，桃紅四物湯治療LI-RI具有多靶點、多通路等特點，其機制可能與桃紅四物湯中有效成分槲皮素、山柰酚、木犀草素等，通過ALB、TNF、AKT1等靶點，激活AGE-RAGE、TNF、IL-17等信號通路，調控炎癥反應與細胞凋亡等有關，為桃紅四物湯治療LI-RI提供了理論支持。但是，目前仍需要更多的相關實驗和臨床研究，去進一步研究其具體的治療機制。