新品種“美賜”半同胞子代種苗特性與優株選擇

●陳泉佐 趙賢生 焦玉鵬 張棋淞 楊新麗 楊小軍 姜 磊 張 磊 付順華※

（1.浙江農林大學 林業與生物技術學院 浙江 杭州 311300；2.富陽區農業技術推廣中心經作站 浙江 杭州 311400；3.浦江縣俊果研究所 浙江 金華 322329；4.杭州富陽恒浩家庭農場 浙江 杭州 311402；5.浙江省桐鄉第一中學 浙江 嘉興 314500）

掌葉覆盆子（Rubus chingiiHu）是薔薇科懸鉤子屬的一種藤狀落葉灌木，又稱掌葉復盆子、華東覆盆子，主要分布在中國華東地區。其成熟果實鮮紅美艷，口感酸甜，風味獨特。近成熟青果制干即為有悠久使用歷史的中藥材覆盆子。藥理和化學成分研究表明，掌葉覆盆子根、葉、果均具有藥用價值，有益腎、固精、縮尿、壯陽及養肝明目等作用[1]，可促進消化、緩解腹瀉、補充鐵質[2]，可用于治療細胞的炎癥反應[3]。掌葉覆盆子葉茶多酚含量接近于茶葉，且口感甘甜，有降血脂效果，制成茶劑或其他食品可滿足高血脂人群需求[4]，并可使婦女子宮肌和骨盆肌肉保持正常，提高嬰兒母乳營養價值，促進產婦母乳分泌[5]。掌葉覆盆子葉的乙醇提取物有顯著的抗血栓作用，分離得到的山奈酚、槲皮素和椴樹苷能明顯延遲血液中血漿復鈣時間[6]。同時掌葉覆盆子果實含有豐富的氨基酸和維生素，有抗衰老、保健、美容功效[7-9]，是一種亟待開發的健康功能植物。

20世紀90年代，國內懸鉤子屬植物受到人們關注，得到初級開發利用。人們開始對野生懸鉤子植物進行馴化引種，并開展生物學基礎、栽培性狀等研究，其中重點開展對掌葉覆盆子的研究。從栽植環境、移栽時間和密度、苗期管理措施方面，探索掌葉覆盆子的栽培模式[1]；開展施肥用量和施肥時間等研究，了解合適施肥條件[10]；開展種苗繁殖和組培快繁研究，了解合適采種期、種子貯藏時間、催芽方式[11-13]和組織培養合適條件[7，14-15]；從化學成分和藥理作用的深入研究中，發現果實、葉片中多種類的新型營養物質，包括糖類、有機酸類、維生素類成分和揮發性成分[16-17]，以及抑制原發性肝癌[18]、祛除黃褐斑等新功能[19]。

目前掌葉覆盆子良種選育已有一些初步研究[20-21]，主要是通過比較不同植株個體生長開花結實特性的變異選擇優株，但少有進一步培育出生產上可利用的新品種的報道，涉及以皮刺為主要育種性狀的掌葉覆盆子良種選育研究更是未見報道。半同胞子代有一半的遺傳信息來源于母本，故能夠較好地繼承母本的優良特性，同時又有來自不同父本的遺傳信息，會產生新的基因型和優良表現型。在半同胞子代群體中開展優株選擇，可以有效選擇到綜合父母本雙親優良特性的個體，進而能培育性狀更優良的品種或品系。本試驗以在生產上開始推廣應用的少皮刺型新品種“美賜”半同胞子代（以下簡稱“美賜”）的種子為材料，通過觀測“美賜”種子特性、種子發芽特性、苗期形態特征、分枝特征和皮刺分布，了解其種子種苗生長特性，并開展苗期少（無）刺優良單株選擇，為其后續品種升級換代、保純防衰和創制種質資源提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料“美賜”種子從以掌葉覆盆子新品種“美賜”植株為母本的自由授粉成熟果實中獲得，普通種子從種植基地中的掌葉覆盆子栽培植株上獲得。

2020年5月和2021年5月兩次在金華市浦江縣花橋鄉掌葉覆盆子種植基地，選擇生長良好的“美賜”植株和普通掌葉覆盆子植株分別取樣。摘取果型飽滿、顏色正常紅艷的成熟果實，分別裝入保鮮袋，做好標記，帶回實驗室即時進行稱重，同時記錄果實形態性狀。隨后對果實進行破碎，用水洗法去除果肉，分離種子，將得到的種子放在陰涼處風干。干燥后進行千粒重測定，隨后將種子進行貯藏。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗地整理 2021年4月，在浙江農林大學平山試驗基地的省級林木種質保育基地大棚內設置試驗圃地。圃地土壤深耕，后將圃地雜草雜物清理，殺菌消毒，清除土壤病蟲害。再在土壤上覆蓋一層2 cm厚的泥炭土，隨后噴水至圃地土壤完全濕潤。

1.2.2 種子播前處理與播種 對2020年5月所采的貯藏后“美賜”種子，于播種前放入清水中浸泡4 h，使種子吸收足夠的水分，促進種子萌發。圃地開播種溝，以條播方式進行播種。完成播種后，種子不覆土，輕度噴霧灑水濕潤，使種子充分接觸土壤。

1.2.3 苗期管理與病蟲害防治 幼苗萌出后，觀察其生長狀況的同時，適時進行水分補充。定期噴霧澆水，以土壤不干為度，進行“美賜”苗期生長性狀觀測和成苗期優株選擇群體。

2021年5～6月，發現小苗葉片有被食葉昆蟲啃食跡象（圖1），確認是短額負蝗（Atractomorpha sinensisB.）成蟲和菜粉蝶（Pieris rapaeL.）幼蟲，隨后使用蘇云金桿菌藥劑滅蟲，8～10 mL藥劑加水制成1.5 L混合溶液，葉面噴灑，數天后葉片被啃食現象消失。當年8月，小苗葉面出現黃色病斑，使用鏈霉素藥劑進行防治后，葉面黃色病斑逐漸減少。

圖1 苗期食葉昆蟲及危害狀

1.2.4 性狀觀測

1.2.4.1 種子正常率與外觀形態 在2021年5月所采“美賜”種子、普通種子中分別隨機選取種子，用刀片小心切開硬種皮，觀察種子內部種胚結構是否完整、正常，如果種胚白色、飽滿，認為是正常種子；如果種胚黑色或棕色、干癟狀態，則認為是不正常種子。各隨機選取30粒種子作為一組，各重復3次，記錄觀測數據。種子正常率計算公式如下：

其中，n為正常種子數，N為總解剖種子數。

使用電子游標卡尺測量種子縱徑、橫徑和側徑。選擇“美賜”種子和普通種子若干，各從中隨機選取10粒種子，分別測定種子縱徑（縱軸方向）、橫徑（平行子葉且與縱軸垂直方向）和側徑（垂直子葉方向）[22]。

1.2.4.2 種子千粒重測定 參照《林木種子檢驗規程》[23]進行種子千粒重測定。從2021年5月所采“美賜”種子和普通種子中按檢驗規程要求，各隨機選取3份1000粒種子，進行稱重。

1.2.4.3 種子發芽率測定 從同期所采“美賜”種子和普通種子里，分別隨機選取相同數量的正常種子，使用無菌、透氣、柔軟的雙圈定性濾紙浸濕作發芽床，將種子按2 mm間隔排列在濾紙上，置透明玻璃培養皿中，觀測記錄發芽情況。種子發芽率計算公式如下：

其中，n為發芽種子總粒數，N為試驗種子總粒數。

1.2.4.4 1年生苗期生長性狀與皮刺觀測 2021年9～11月，對株高、冠幅、地徑、皮刺、分枝高等性狀在所建立的苗期觀測選擇群體中進行特性觀察測量。使用鋼卷尺測量種苗株高、冠幅、分枝高，使用電子游標卡尺測量種苗地徑。從皮刺在莖稈上的分布數量、密度及起點終點位置等觀測植株皮刺生長特性，從分枝數、分枝級數和分枝起點等觀測種苗分枝特性。

1.2.5 優株選擇 2021年12月，在“美賜”1年生苗群體中，以植株皮刺數少為選擇目標，制定選優標準，進行優株選擇，以皮刺性狀遺傳力預期值為0.60（無性繁殖時預期重復力為0.90），計算選擇差、選擇強度、選擇響應和遺傳增益等遺傳育種參數。并對初選優株進行詳細調查，綜合評價各優株特性。計算各遺傳參數。參考《林木遺傳學基礎》[24]和《森林遺傳學》[25]，公式如下：

式中x為入選群體平均值，μ為群體平均值，σp為標準差，h2為預期遺傳力（無性繁殖時為預期重復力）。

優株入選率的計算公式如下：

其中y為入選優株數，Y為總株數估計值。

1.3 數據處理及分析

借助Excel 2018、SPSS 22.0、Origin29.0等軟件統計處理數據和做圖，進行顯著性檢驗，計算平均值、標準差、相關系數及育種參數等。

2 結果與分析

2.1 種子特性分析

2.1.1 種子正常率與種子千粒重分析 從表1可知，“美賜”種子正常率平均值為82.80%，而普通種子正常率平均值為70.00%。獨立樣本t檢驗顯示，“美賜”種子正常率與普通種子存在顯著性差異（p=0.013），表明“美賜”種子正常率顯著高于普通種子。

表1 “美賜”種子與普通種子特性比較

從表1可知，“美賜”種子千粒重平均值為1.00 g，普通種子千粒重平均值為1.29 g，表明美賜種子千粒重小于普通種子；兩者的標準差都較小，美賜種子千粒重標準差是0.05 g，普通種子為0.03 g，表明兩者的種子千粒重在個體間差異并不顯著。

2.1.2 種子外觀形態及種子個體間形態差異比較 種子外觀形態及種子個體間形態差異觀測結果，見表2。

表2 “美賜”種子與普通種子外觀性狀比較

由表2可知，“美賜”種子外觀形態比普通種子略小。“美賜”種子縱徑、橫徑、側徑平均值為2.092，1.270，0.834 mm，普通種子的縱徑、橫徑、側徑平均值為2.265，1.492，0.981 mm，美賜種子縱徑、橫徑、側徑分別比普通種子小7.51%，14.88%，14.98%，這與“2.1.1”節中種子千粒重的研究結果一致。

從種子外觀形態個體間的差異看，“美賜”種子的個體間變異比普通種子大。“美賜”種子的縱徑、橫徑和側徑3個外觀性狀值的方差（0.017，0.031，0.012 mm2）、標準差（0.133，0.181，0.110 mm）和變異系數（6.36%，14.25%，13.19% ）均明顯大于普通種子的相應外觀性狀值的方差（0.005，0.004，0.012 mm2）、標準差（0.074，0.069，0.115 mm）和變異系數（3.26%，4.62%，11.72%），尤其是“美賜”種子的橫徑變異更大，最大值/最小值為1.77（1.70/0.96），變異系數達14.25%，普通種子的橫徑變異較小，最大值/最小值為1.17（1.60/1.37），變異系數僅為4.62%。反映出“美賜”種子的個體間分化比普通種子更大。

2.2 種子發芽特性及發芽率分析

利用2021年5月所采的“美賜”種子和普通種子進行發芽試驗，結果見圖2。由圖2可知，在9月至翌年1月的秋冬季節，“美賜”種子和普通種子經過長達近半年的發芽過程中，前3個月的發芽率都極低，表明此階段掌葉覆盆子種子休眠特性仍未完全解除，不易發芽。100 d后，無論“美賜”種子還是普通種子的發芽率均開始明顯上升，但“美賜”種子發芽率更高。曼-惠特尼U檢驗結果（p=0.000）顯示，“美賜”種子和普通種子的發芽率存在顯著差異，試驗結束時觀測，“美賜”發芽率達14.48%，而普通種子的發芽率僅4.21%。“美賜”種子發芽率高于普通種子，這個結果與上述“2.1.1”種子正常率的研究結果一致。

圖2 “美賜”種子與普通種子秋冬季發芽率比較

2021年春，利用2020年5月所采集的“美賜”種子進行發芽試驗觀測，其結果如圖3所示。試驗處理種子320粒最終發芽種子數為193粒，發芽率為60.31%，開始發芽時間為第26天。4月5日的發芽種子數最多，為39粒，4月9日、4月15日的發芽種子數最少，均僅4粒，這可能與氣溫的明顯升降變化有關。結合圖2“美賜”種子秋冬季經過150 d發芽率才達到14.48%，顯示種子采收貯藏后的翌年春季是“美賜”種子的較合適發芽時期。除了“美賜”種子是否已解除休眠因素外，光照、溫度等因素可能都是它不同季節發芽率差異的重要原因。

圖3 “美賜”種子春季發芽情況

2.3 “美賜”1年生苗期特性分析

2.3.1 “美賜”1年生苗生長性狀及相關性 在“美賜”1年生苗的秋季生長的時期Ⅰ（9月9日）、時期Ⅱ（10月14日），對株高、冠幅和地徑形態指標分別進行了觀測，并分析了生長性狀間的相關性，結果見表3。

表3 “美賜”1年生苗株高、冠幅和地徑生長變化及性狀間相關性

從表3可知，在時期Ⅰ測定時，“美賜”苗的株高、冠幅、地徑平均值分別為33.65 cm、21.48 cm、2.45 mm，到時期Ⅱ測定時，“美賜”苗的株高、冠幅、地徑平均值分別為47.34 cm、41.10 cm、3.69 mm，時期Ⅱ“美賜”苗的株高、冠幅、地徑平均值分別比時期Ⅰ增加40.68%，91.34%，50.61%，表明在秋季這個階段，“美賜”1年生苗隨著溫度變涼適宜生長，形態建成較為快速。同時，隨著個體形態建成，群體內的個體分化也變得非常明顯，時期Ⅰ的標準差分別為10.22 cm、7.20 cm、0.83 mm，變化為時期Ⅱ的標準差13.68 cm、20.28 cm、1.41 mm，時期Ⅱ“美賜”苗的標準差分別比時期Ⅰ擴大33.86%，181.67%，69.88%，其中以冠幅分化更大，地徑分化次之。

“美賜”1年生苗的生長性狀株高、冠幅及地徑兩兩之間均存在極顯著正相關（表3）。其中株高與冠幅的相關系數為0.851（P＜0.01），相關系數最大。株高與地徑的相關系數為0.473（P＜0.01），冠幅與地徑的相關系數為0.451（P＜0.01），相關系數中等。

2.3.2 “美賜”1年生苗分枝特征 隨著“美賜”1年生苗的生長發育，其植株形態開始發生劇烈變化（表4）。在較短的生長階段內由單莖分枝變為多基生一級分枝莖并在一級分枝莖稈上再產生二級分枝。

表4 “美賜”1年生苗分枝特性

由表4可知，在1年生苗生長的當年，時期Ⅱ（10月4日）至時期Ⅲ（11月29日）時間段，“美賜”種苗出現分枝的植株比例由40.00%增加到了90.91%，其中，大多為基生一級分枝（即分生枝從近地面長出），植株比例達到87.50%。同時植株個體分枝結構也進一步發生分化，在群體里表現不一，有部分植株出現一級分枝后開始繼續出現二級分枝。

由表4可知，在產生分枝的“美賜”1年生種苗群體中一級分枝具1枝的植株占60.00%，具2枝的植株占33.33%，平均一級分枝數為1.47枝。同時該群體中，無二級分枝的植株占66.67%，具二級分枝1枝的植株占6.67%，具2枝的植株占26.67%，平均二級分枝數為0.60枝。表明“美賜”1年生苗的植株基本結構是具1～2個一級分枝，較少二級分枝。

2.3.3 “美賜”苗期皮刺生長特性分析

2.3.3.1 “美賜”苗期皮刺生長的時間變化 “美賜”1年生種苗生長期形態發生快速變化的同時，皮刺生長也有較大變化。在時期Ⅰ（9月9日）、時期Ⅲ（11月29日）兩個時間點，對“美賜”種苗的皮刺分布情況進行了觀測，結果見表5。

表5 “美賜”1年生苗莖稈皮刺分布變化

由表5可知，在此生長過程中“美賜”種苗群體由少數植株有刺（25.00%）快速生長成為了絕大部分植株有刺（92.32%）。“美賜”無刺植株逐漸變得很少，可能是反映了“美賜”控制皮刺生長性狀的基因表達是在幼苗的后期階段。苗期出現皮刺可能也是“美賜”植株從幼苗轉化為成苗的形態上變化特征之一。

同時，隨著植株的生長，樹高增加，植株上皮刺分布的最低位置也發生一定改變。由表5可知，隨著“美賜”植株1年生后期生長，基部離地面向上出現第1枚刺的位置有上移趨勢，平均分布高度由15.13 cm變為18.77 cm。原因可能是由于植株生長的徑向拉伸導致植株整體伸長所引起的，如竹子、楊樹等都有類似情況[26]。

2.3.3.2 “美賜”苗期皮刺數量分布特性與密度分布特征

“美賜”1年生苗期皮刺數量分布與密度分布測定結果，見表6。

表6 “美賜”1年生苗皮刺分布特性

從表6可知，“美賜”植株基部出現第1枚刺的平均高度為18.77 cm，莖稈上端出現最后1枚刺的高度平均為65.91 cm。皮刺分布的高低位置個體間差異較大，尤其是莖稈上端分布位置（標準差為16.95 cm）比基部分布位置（標準差為12.51 cm）波動更大。

同時，“美賜”植株上的皮刺分布密度不是均勻的，在植株離地面0～60 cm高度內集中分布了95.24%的皮刺量。而在分生枝莖稈上的各段分布也不均勻。如圖4所示，在距離分枝起點10 cm以下莖段皮刺分布較少，平均只有0.92枚；在10～20 cm、20～30 cm、30～40 cm的皮刺分布平均值分別為3.75，4.33，2.17枚；在超過距離分枝起點60 cm以上部分，皮刺分布數量很少，分布平均值僅0.67枚。

圖4 “美賜”1年生苗距離分枝起點不同高度莖稈上的皮刺數量

2.4 皮刺性狀的優株選擇

對“美賜”1年生苗群體進行皮刺數量分布進行測定，植株個體平均皮刺數量值μ為24.80枚，個體間分化變異大，標準差σp為14.51枚，以X=μ-σp為入選標準，確定皮刺性狀入選標準為數量≤10.29枚，植株皮刺數量少于此值為候選少（無）刺優株，綜合其他性狀比較，最后確定5個優株，記為優-1、優-2、優-3、優-4、優-5，最終優株入選率為6.41%，各育種參數如表7所示。通過選擇，在有性繁殖情況下選擇可得理論遺傳增益?g1為57.10%，在無性繁殖情況下，通過選擇可得理論遺傳增益?g2為85.65%，皮刺性狀改良效果將極為明顯。

表7 “美賜”1年生苗期皮刺性狀選擇的育種參數

5個優株詳細特征如下：

2.4.1 優-1 皮刺數2，分布于距分枝點20～25 cm，向外著生；莖稈數2，綠；葉數17，綠，大小中等，掌狀；無病蟲害。

2.4.2 優-2 皮刺無；莖稈數2，莖1：綠色（夾雜少許紫），莖2：上端綠，基部紫；葉數26，綠，小，掌狀；無病蟲害。

2.4.3 優-3 皮刺無；莖稈數2，綠（少部分紫）；葉數24，綠，小，掌狀；無病蟲害。

2.4.4 優-4 皮刺無；莖稈數2，莖1：綠（少許紫），莖2：紫（少部分綠）；葉數11，綠，小，掌狀；無病蟲害。

2.4.5 優-5 皮刺數4，分布于距分枝點14～25 cm，向外著生；莖稈數1，綠；葉數12，綠，小，掌狀；無病蟲害。

3 討論與結論

本次試驗中，測定的“美賜”種子千粒重為1.00 g，較普通掌葉覆盆子種子（1.29 g）輕，兩者之間存在顯著性差異。劉宇等[27]在研究種子千粒重方面發現，多倍體家系種子千粒重普遍較重，其平均值較普通二倍體家系重22.42%；同時多倍體植物由于染色體組增加，器官往往變大，花期延后，而“美賜”萌芽、開花均早于普通掌葉覆盆子。由于“美賜”是普通掌葉覆盆子中出現的變異類型，這是否可能表明“美賜”是由于發生了遺傳變異而遺傳物質質量變小有待后續試驗驗證。

本試驗發現，“美賜”1年生苗群體一級分枝數多為1枝，二級分枝數多為0枝。潘彬榮等[21]也發現掌葉覆盆子一般當年抽發新枝，不具二級分枝，第2年抽發二級分枝。王碩等[28]認為植物激素、遺傳因子對植株形態調控起主要作用，植物激素獨腳金內酯會影響植株分枝數。胡盼盼等[29]探究獨腳金內酯對草莓新莖分枝的調控機制時發現，草莓品種“紅顏”在定植60 d后進入分枝盛期、分枝數平均值為2.5枝，認為獨腳金內酯含量降低促進草莓分枝，在分枝盛期新莖中積累了較多獨腳金內酯而抑制了分枝數。美賜種苗分枝數目較少可能也是由于其體內積累較多的獨腳金內酯，而抑制其分枝數目增加。這有待后續試驗證實，同時也為美賜植株形態調控研究提供了思路借鑒。

試驗中發現“美賜”1年生苗群體中無刺植株占比為3.80%，這與代漢萍等[30]在樹莓無刺性狀雜交試驗中“無刺紅”與“費爾圖德”雜交后代出現無刺實生苗比率2.5%相近。此外，朱報著等[31]研究美麗異木棉子代苗木皮刺時，以多皮刺的WY05為母本、少皮刺的XS22無性系為父本，發現子代有無刺植株6株，占6.67%。這些研究結果進一步表明，植株的皮刺性狀存在豐富的遺傳多樣性，掌葉覆盆子無刺型新品種選育可以通過更多的雜交組合試驗，在雜交子代群體中進一步選擇優株來實現。

通過本試驗觀測“美賜”種子特性、發芽特性、苗期特性和苗期皮刺選擇，可得到如下結論：“美賜”種子正常率較高，種子形態縱徑、橫徑、側徑和種子千粒重均小于普通種，兩者有顯著性差異。在相同的發芽環境條件下，“美賜”種子發芽率高于普通種，兩者發芽特性差異明顯。“美賜”1年生種苗生長性狀株高、冠幅、地徑之間均存在極顯著的正相關關系。“美賜”1年生種苗植株皮刺分布主要集中在0～60 cm高度范圍內。“美賜”1年生種苗以基生一級分枝植株為主，一級分枝起點基本接近地面。對“美賜”1年生苗皮刺性狀進行優株再選擇，理論遺傳增益在有性繁殖情況下達57.10%，在無性繁殖情況下可達85.65%，植株少刺改良效果明顯，“美賜”品種優良特性可取得進一步提升，使更多更優的新品種選育獲得豐富的育種材料和育種前景。