秦川牛宰后成熟期間熱休克蛋白A6對肉品質變化的影響機制

馬旭華，李亞蕾，羅瑞明，張杏亞

（寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021）

動物宰后缺氧缺血狀態激活了細胞凋亡酶，在誘導細胞凋亡的同時，還誘導了熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）的合成，HSPs主要功能是作為分子伴侶與抗凋亡因子，通過阻止宰后肌肉成熟過程中的細胞凋亡、蛋白降解等對肌肉結構發揮防護作用[1]。諸多研究表明，HSPs作為生物標記物在預測嫩度、肉色、保水性方面具有一定潛力[1-2]。丁振江[3]研究發現HSP27可能通過抑制內源酶活性從而延緩宰后牛肉成熟。Bernard等[4]研究夏洛萊牛胸部肌肉時發現，HSP27表達下調能夠改善肉嫩度、多汁性和風味。HSP70家族是HSPs最重要的亞族之一，HSPA6是其家族成員之一，在活體細胞中的各個部分組成性地表達[5]，其功能發揮對與ATP結合、ATP-ADP轉化或HSPA6磷酸化誘發構象變化具有依賴性[6]。動物宰后缺氧缺血信號會調節組織能量水平變化，鮮肉貯藏期間線粒體結構受損、功能失調、呼吸功能中斷等引起氧化還原狀態紊亂，使能量物質發生不同程度的降解。羅輝等[7]研究發現宰后牛肉中能量基本物質水平持續下降。Kopuzlu等[8]研究表明肉牛宰后初期肌肉內葡萄糖及糖原有氧分解迅速轉變為無氧酵解，產生乳酸，pH值持續下降，體內ATP酶催化ATP水解。能量代謝在宰后肌肉向肉品轉化過程中與酸度、肉色、嫩度、保水性及風味等緊密相關。

蛋白質組學是研究特定狀態或時期下組織或細胞全部蛋白質水平變化。目前，蛋白質組學方法在肉品質變化機制研究方面已有較為廣泛的應用[9-10]。在3D分離基礎上，4D-非標記定量（4D-label free quantification，4D-LFQ）蛋白質組學技術增加了離子淌度參數，主要根據離子截面及形狀進行分離，為測定秦川牛肉組織這種復雜體系樣本提供更多的可能。Jia等[11]采用Label-free蛋白質組學研究牛胸最長肌肌漿蛋白時發現，通過檢測活體組織或宰后牛胸最長肌中Peroxiredoxin-6含量可預測嫩度變化。Boudon等[12]采用Label-free蛋白質組學研究夏洛萊×奧布拉克牛肉嫩度生物標志物，發現HSP90AA1可用于肉嫩度預測推定候選蛋白質。魏燕超[13]采用穩定同位素標記蛋白質組學技術（isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ）結合液相色譜串聯質譜聯用（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術研究HSPs表達水平與羊肉嫩度之間關系，發現HSPs表達水平決定了不同品質羊肉嫩度。綜上，蛋白質組學可應用于研究與肉品質相關的蛋白質，包括HSPs。HSP70是HSPs家族中最重要亞族之一，目前鮮有研究闡釋宰后成熟期間肉中HSP70家族成員與能量水平關系，因此，本研究以宰后4 ℃條件下秦川牛背最長肌為研究對象，測定其能量水平變化和肉品質變化，采用4D-LFQ技術分析不同貯藏期牛肉蛋白質水平變化，結合基因本體注釋（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，從分子層面明確HSPA6參與調控的通路，研究HSPA6影響能量代謝的途徑，為后續從HSPA6變化角度闡明宰后肌肉組織能量代謝和品質變化機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

體質量相近的25 月齡秦川公牛由寧夏尚農生物科技產業發展有限公司提供。

三氟乙酸、碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇、尿素、三乙基碳酸氫銨 美國Sigma-Aldrich公司；胰酶美國Promega公司；蛋白質酶抑制劑 上海Calbiochem公司；乙腈 美國Fisher Chemical公司；甲酸 瑞士Fluka公司；BCA試劑盒 江蘇碧云天公司；考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

NAI-CS150超聲波細胞破碎機 上海那艾精密儀器有限公司；MiniVac Alpha冷凍離心機 美國Scan Speed公司；timsTOF Pro質譜儀、NanoElute超高效液相色譜儀德國Bruker公司；Forma 994－80 ℃超低溫冰箱美國Thermo公司；TA-XT plus質構儀 英國Stable Micro Systems公司；UV-1200紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采樣對象選用屠宰后的左胴體背最長肌，背最長肌樣品平均分割成3 份，共計15 個樣品（每個樣品約150 g）。樣品分割成塊編號后用聚乙烯薄膜包裹，貯存于4 ℃的冰箱中。采集貯存0、2、4、6、8 d的樣品用于測定秦川牛肉品質指標；對于不便立即測定指標的樣本，將手術刀及鑷子進行滅菌處理后，分別采集不同成熟期樣本10 g置于液氮中，速凍2 h后轉移至－80 ℃冰箱保存，待檢測分析使用。

1.3.2 能量基本物質含量的測定

精確稱50 mg樣品置于離心管中，加入4 ℃預冷0.6 mol/L高氯酸和1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）混合液1 mL，勻漿2 min后離心，4 ℃、10 000×g條件下10 min，取700 μL上清液加0.2 mL 1 mol/L的NaOH溶液。搖勻反應5 min，取0.5 mmol/L上清液過膜后－80 ℃冰箱保存。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide，NADH）含量[14]。HPLC條件：流動相：220 mmol/L硫酸鉀（溶劑為體積分數10%甲醇溶液，四丁基氫氧化銨調pH值至6.5），等比洗脫，流速設置為0.8 mL/min，檢測波長設置為254 nm。

1.3.3 剪切力測定

參考李桂霞等[15]方法稍作修改。取肉塊約3 cm×6 cm×6 cm，除去表面脂肪和筋膜，置于蒸煮袋內，抽去袋內空氣，使肉塊表面緊貼蒸煮袋，密封袋口，置于80 ℃水浴鍋加熱至中心溫度70 ℃后立即取出，冷卻至室溫，將肉樣沿肌纖維方向用直徑1.27 cm采樣器平行取4 個肉柱，然后用TA-XT plus質構儀V型活動剪切刀架垂直于肌纖維方向測定其剪切力，剪切速率與剪切距離分別為1.5 mm/s、40 mm，4 次測定取其平均值。

1.3.4 肌原纖維小片化指數的測定

參考Culler等[16]方法稍作調整。稱取經過修整的1 g肉樣于冷凍研磨儀攪碎，放入離心管加入經過預冷（4 ℃）的10 mL緩沖液（含KCl 100 mmol/L、K2HPO411.2 mmol/L、KH2PO48.8 mmol/L、EGTA 1 mmol/L、MgCl21 mmol/L、NaN31 mmol/L），1 200 r/min勻漿2～3 次（每次1 min，兩次間隔1 min），放入離心管4 ℃、1 000×g離心15 min收集上清液，加入10 mL緩沖液再次勻漿后離心，去上清液，再加入5 mL預冷緩沖液使沉淀充分懸浮后用200 目篩過濾沉淀，再用5 mL緩沖液清洗離心管后過200 目篩，收集緩沖液，采用考馬斯亮藍法測蛋白質量濃度。用緩沖液將蛋白質量濃度稀釋至0.5 mg/mL，在595 nm波長處重復測定3 次吸光度，取平均值帶入式（1）計算肌纖維小片化指數（myofibril fragmentation index，MFI）。

1.3.5 離心損失率的測定

參考Zhang等[17]方法并稍作調整。將不同貯藏時間的牛肉樣品分別切成4.0 cm×0.5 cm×0.5 cm，于10 mL離心管中稱質量，40 000×g、4 ℃離心15 min，吸干肉樣表面水分，稱其質量。按式（2）計算離心損失率。

式中：m1為離心前樣品質量/g；m2為離心后樣品質量/g。

1.3.6 4D-LFQ蛋白質組學技術檢測蛋白質含量

參照張杏亞等[18]的方法提取蛋白質并測定蛋白質含量，參照羅輝等[19]的方法進行數據庫搜索、生物信息學分析，篩選差異蛋白質利用DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）作GO、KEGG通路分析。

1.4 數據處理與分析

所得數據以平均值±標準差表示，運用SPSS 24軟件單因素方差分析和Duncan法進行比較，確定數據間是否具有顯著性差異，P＜0.01為差異極顯著，P＜0.05為差異顯著，利用Origin 8.0軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 宰后牛肉貯藏過程中品質的變化

2.1.1 HSP70家族成員篩選及其表達量變化

采用4D-LFQ蛋白質組學技術研究秦川牛宰后蛋白質組的豐富度變化，利用Maxquant（v1.6.6.0）軟件對所得的蛋白質二級結構進行質譜檢索，共鑒定出1 149 個蛋白質，通過逐一搜索，僅篩選出HSP70家族成員HSPA6，其表達量變化情況如表1所示。HSPA6表達量在宰后0 d最大（1.51），隨貯藏時間延長呈顯著下降趨勢（P＜0.05）。宰后初期由于動物缺血缺氧引起應激反應，HSPA6作為應激分子迅速被合成，因此0 d時其表達量較高，隨成熟時間延長，蛋白質降解程度加劇，使其表達量顯著降低。0～4 d其表達量降幅較低，表明少量HSPA6發生降解；4～8 d降幅較大，表明HSPA6降解主要發生在成熟后期。因此，牛肉宰后的成熟初期HSPA6能夠較好地執行其功能。

表1 宰后貯藏過程中秦川牛背最長肌HSPA6表達量的變化Table 1 Changes in HSPA6 expression in beef Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during storage

2.1.2 能量代謝基本物質ATP、ADP、AMP、NADH含量的變化

采用HPLC法檢測宰后秦川牛背最長肌能量代謝基本物質含量，結果如表2所示。隨著貯藏時間的延長，ATP含量呈顯著下降趨勢（P＜0.05），由0 d時的9.63 μmol/g下降至8 d時0.50 μmol/g，0～2 d期間下降速率較快，2～8 d降幅較緩，8 d時基本檢測不出ATP。ADP、AMP的含量在整個成熟期（0～8 d）均呈顯著下降趨勢。結果表明，宰后由于有氧代謝逐漸減弱，組織中ATP迅速發生降解，促使糖酵解被激活，同時引起AMP、ADP含量下降。貯藏過程中NADH含量變化可反映組織細胞中氧化還原和能量變化狀態。0～8 d期間NADH含量逐漸降低，引起該現象的原因可能是宰后肌肉組織細胞中線粒體受損，呼吸功能失調[18]。

表2 秦川牛背最長肌在貯藏時間過程中ATP、ADP、AMP、NADH含量的變化Table 2 Changes in ATP,ADP,AMP and NADH contents in beef Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during storage

2.1.3 剪切力的變化

肉的嫩度直接影響其食用時的口感，故嫩度是牛肉的重要品質指標之一[20]。而剪切力是評價肉品宰后成熟過程中嫩度的重要指標，其代表肌肉纖維對抗剪切的作用力。宰后成熟期間秦川牛背最長肌剪切力變化趨勢如表3所示。牛肉貯藏0 d時剪切力為121.67 N，0～4 d期間顯著上升，4 d達到其最大值（155.03 N），4～8 d呈顯著下降趨勢，8 d時剪切力為94.3 N。剪切力變化趨勢表明，宰后初期秦川牛肉嫩度較差，這可能是因為宰后初期肌凝蛋白凝固、肌纖維硬化，肌肉發生僵直，貯藏至8 d時嫩度較好，本研究結果與Rhee等[21]對韓國本土牛肉的研究結果一致，秦川牛肉剪切力變化分析結果表明宰后成熟有助于改善肉品嫩度，適度條件的成熟有助于改善肉品嫩度是因為宰后內源酶被激活，有效加速細胞骨架蛋白的降解。

表3 秦川牛背最長肌在貯藏過程中剪切力、MFI和離心損失率的變化Table 3 Changes in shear force,MFI and centrifugal loss of beef Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during storage

2.1.4 MFI的變化

MFI代表肌原纖維蛋白被降解及肌原纖維結構破壞的程度，能反映細胞骨架蛋白碎裂程度，常被用于間接表征肉品的嫩度[22]。如表3所示，MFI隨成熟時間延長呈顯著上升趨勢（P＜0.05），貯藏0 d時MFI為30.30，8 d時達到整個貯藏過程的最高值（99.00），與0 d時相比增長了226.73%。MFI變化趨勢表明，隨著貯藏時間的延長，秦川牛肌肉結構蛋白的水解程度加劇，肌肉結構蛋白質在內源酶的作用下被降解為片段。李升升[23]在牦牛平滑肌嫩度形成機理的研究中發現，牦牛平滑肌的MFI隨冷藏時間延長而顯著上升（P＜0.05），本研究結果與其一致。

2.1.5 離心損失率的變化

離心損失率常被用于表征肉的保水性，能夠反映在施加離心力時牛肉保持其自身水分及吸收水分的能力[24]。如表3所示，宰后0～4 d時牛肉的離心損失率顯著升高，4 d時達到最大值，4～8 d顯著降低。表明4 d時牛肉中肌漿蛋白凝結到肌原纖維上，蛋白質溶解度下降，造成了水分的流失，離心損失率達到最大，保水性最差。

2.1.6 HSPA6表達量與能量物質及品質指標的相關分析

為探究宰后成熟期間秦川牛背最長肌中HSPA6與能量物質及肉品質的關系，對HSPA6表達量與能量基本物質及品質指標進行Pearson相關性分析。由表4可知，宰后成熟期間秦川牛背最長肌中HSPA6表達量與ATP含量、ADP含量、AMP含量、NADH含量、剪切力呈顯著正相關（P＜0.05），相關系數r分別為0.529、0.542、0.578、0.737、0.550；與MFI、離心損失率呈極顯著負相關（P＜0.01），相關系數r分別為－0.771、－0.153；與ADP、AMP含量無顯著相關性。HSPA6具有分子伴侶、免疫調節、抗癌細胞增殖、抗細胞凋亡等功能，可保護組織免受氧化應激，保護重要蛋白質不發生不可逆變性[25]。動物宰后機體由于缺血、缺氧會刺激HSPA6表達，HSPA6的表達量與細胞損傷程度成反比[26]，這說明HSPA6對細胞結構具有保護作用。本研究中宰后成熟初期HSPA6僅發生少量降解，能夠較好地執行其生理功能，抑制蛋白降解和細胞凋亡。隨著貯藏時間延長，尤其是在貯藏后期，由于細胞凋亡酶發生作用，HSPA6對抗凋亡作用的能力降低，導致肌肉結構降解程度加劇，因而剪切力降低，嫩度增加。Zhang Muhan等[27]研究發現雞胸肉中HSP70表達量與滴水損失率呈正相關，與本研究結果不一致，可能是實驗材料存在差異或樣品處理方式不同所導致。D’Alessandro等[28]通過牛肉的嫩度指標及其與蛋白質組學和代謝組學分析結果的相關性發現牛肉中HSP70表達量與嫩度呈正相關，與MFI呈負相關，本研究結果與其一致。di Luca等[29]采用蛋白質組學研究豬肉在成熟過程中保水性，發現HSPs表達量與滴水損失率呈負相關，滴水損失率大則系水率低；本研究中HSPA6表達量與離心損失率也呈極顯著負相關（P＜0.01），二者結果一致。

表4 HSPA6表達量與品質各指標之間的相關性分析Table 4 Correlation analysis between the expression of HSPA6 and various quality indicators

HSPA6作為HSP70蛋白家族成員之一，具有其家族特有的兩個亞結構域：N端高度保守ATPase功能域和C端底物結合功能域，ATPase功能域具有水解ATP的活性，可以處于與ATP、ADP結合狀態或者無核苷酸結合狀態，C端底物結合功能域可以與未折疊多肽底物暴露在外的疏水區域結合。HSP70 ATPase功能域的結合（與ATP結合）或水解狀態（ATP→ATP，變成與ADP結合狀態）會引起底物結合功能域與多肽的結合狀態和結構的改變，因此HSP70通過C端底物結合、釋放并伴隨N端ATP-ADP轉換來發揮功能，可以保護蛋白質免受壓力、折疊的影響，促進錯誤折疊蛋白質的分解、形成蛋白質復合物和促進蛋白質復合物解離等。本研究中，宰后成熟期間秦川牛背最長肌中HSPA6表達量呈顯著下降趨勢，并與ATP、NADH含量呈顯著正相關，結果表明HSPA6可能通過利用結構域具有ATP-ADP轉換活性執行宰后成熟期間秦川牛肉中的蛋白翻譯后修飾。Leu等[30]通過抑制應激誘導的HSP70表達，發現抑制HSP70表達會導致線粒體蛋白發生顯著變化、線粒體膜電位降低、耗氧率降低、ATP損耗等，與本研究結果一致。

2.2 蛋白質組學數據分析

設置1.3 倍為標準差異倍數，4 d與0 d、8 d與0 d、8 d與4 d相比分別鑒定出30、61、31 個差異表達蛋白質，并對3 個貯藏時間段樣品的蛋白質組學結果進行蛋白質組間相關性分析，如圖1所示。結果表明，貯藏時間可將樣本很好地區分開，同一貯藏時間樣本之間區分不明顯，不同貯藏時間樣本之間區分明顯，表明本實驗樣本采集合理，蛋白質組學數據可靠，滿足后續分析要求。

圖1 貯藏0、4、8 d背最長肌樣品差異蛋白組間相關性分析Fig.1 Correlation analysis of differential proteins between Longissimus dorsi muscle stored for 0,4 and 8 days

2.2.1 差異蛋白質篩選

通過Uniprot數據庫對鑒定出的差異蛋白進行逐一搜索，通過功能特性篩選出24 種與HSPA6表達相關的差異蛋白質，并將其表達豐度與HSPA6表達量進行相關性分析，結果如表5所示。

表5 秦川牛背最長肌貯藏0、4、8 d與HSPA6相關的差異蛋白對比Table 5 Comparison of HSPA6-related differential proteins between Longissimus dorsi muscle stored for 0,4 and 8 days

2.2.2 GO分析

對差異蛋白質及HSPA6通過GO富集分析，通過生物過程、分子功能、細胞組分解析其功能，顯著富集到9 個生物過程、8 個分子功能、8 個細胞組分，如表6所示。此類差異蛋白質能夠催化復合體、蛋白質復合體、細胞骨架部分等位置發生變化，同時在細胞內具有催化、水解酶等活性，并通過與碳水化合物衍生物、嘌呤核苷三磷酸結合等分子功能，引起蛋白酶體介導的泛素依賴性蛋白質分解代謝、蛋白分解參與細胞蛋白分解等生物過程，進而使宰后秦川牛肌肉結構發生變化，影響肌肉蛋白質水解，引起肉的能量水平及相關品質發生變化[31]。

表6 與HSPA6表達量相關差異蛋白的GO富集分析Table 6 Gene ontology (GO) enrichment analysis of differential proteins associated with HSPA6 expression

2.2.3 KEGG通路分析

對差異蛋白質及HSPA6進行KEGG通路富集分析，其顯著注釋于剪接體（bta03040）與內質網中蛋白質加工（bta04141），如表7所示。HNRNPK為異質性核蛋白K，是RNA結合蛋白，可能影響不均一核RNA的加工以及mRNA代謝和運輸，在不均一核RNA剪接過程中介導ATP水解。DNAJA2為細胞周期進程恢復基因2，該蛋白屬于進化保守DNAJ/HSP40蛋白家族，通過刺激ATP酶活性來調節分子伴侶活性，DNAJ蛋白在體外蛋白質折疊導入中作為HSP70的輔助伴侶。P4HB為蛋白質二硫鍵異構酶，來源于硫氧還原蛋白超家族的二硫醇-二硫化物氧化還原酶分子伴侶，具有氧化還原酶、異構酶和分子伴侶作用[32]。剪接體是由核小RNA和蛋白質因子動態組成，可識別RNA前體并催化核糖核蛋白復合體的剪接反應。內質網中蛋白質加工過程包括蛋白質的糖基化、酰基化、羥基化等。以上結果表明，HSPA6參與了宰后成熟期間秦川牛肉中蛋白質翻譯后修飾。

表7 8 d對比0 d組差異蛋白KEGG通路富集Table 7 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis of differential proteins in Longissimus dorsi muscle stored for 8 vs 0 days

2.2.4 基于蛋白質組學研究秦川牛宰后貯藏期間HSPA6及相關差異蛋白變化

已知HSP70 N端ATPase功能域具有微弱的ATP水解活性和ATP合成活性，即ATP-ADP轉換活性[6]，可能會通過影響ATP合酶參與ATP合成與消耗從而影響機體細胞供能和耗能。HSPA6作為HSP70家族一員，缺血缺氧激活了細胞凋亡酶，同時應激誘導了HSPA6的合成，阻止宰后肌肉成熟過程中細胞凋亡，并保持或降低HSPA6對肌肉細胞蛋白質的影響[33]，然而其調控能量代謝變化及肉品質變化的機制尚不明確。

HSPA6及相關差異蛋白質主要在細胞質中發揮生物作用，并且HSPA6所含HSP70家族特有的EEVD基序可以與具有四肽重復結構域的伴侶蛋白結合，如E3泛素連接酶，同時伴侶蛋白之間存在競爭關系，DNAJB4限制了HSP70與E3泛素連接酶復合物的泛素化活性，而E3泛素連接酶抑制了HSP70-DNAJB4復合物重折疊活性[34]。因此，HSPA6在細胞質中可與DNAJB4、E3泛素連接酶等伴侶蛋白共同作用，同時作為維持蛋白質穩定的重要參與者，在蛋白質折疊和降解中發揮作用，控制應激狀態下的蛋白質穩態[35]。HNRNPK是與mRNA結合的主要蛋白質，可能在RNA轉錄激活和抑制過程中發揮作用[36]，促進細胞糖基化，誘導細胞凋亡。DDX39B是參與剪接和未剪接mRNA核輸出的主要蛋白，亦是組裝TREX復合物的組分，在TREX組裝過程中可能會經歷幾輪ATP水解，以驅動隨后的成分加載到mRNA上，ATPase活性被RNA和TREX的復合體共同刺激，ATP水解觸發了RNA的解離，參與轉錄延伸和基因組穩定。DDX3作為RNA解旋酶，其C端優先與未甲基化的HNRNPK結合[37]。已有研究發現，HNRNPK的精氨酸甲基化通過干擾DDX3-HNRNPK相互作用來抑制U2OS細胞的凋亡；另一方面，DDX3-HNRNPK具有促凋亡作用，DDX3-HNRNPK水平可以作為反映骨肉瘤細胞凋亡的程度[38]，與本研究結果一致。HSPA6可能通過ATP-ADP轉換活性的功能降低組織能量水平，并通過抗細胞結構蛋白降解最終影響秦川牛肉的肉色、嫩度及保水性。

3 結論

宰后0～8 d內，隨貯藏時間的延長，秦川牛肉中HSPA6表達量持續下降，ATP、ADP、AMP、NADH含量持續下降，剪切力與離心損率失先升高后降低。利用4D-LFQ蛋白質組學分析發現，貯藏0～8 d秦川牛背最長肌所含HSPA6及相關差異蛋白質表達量發生變化，這些蛋白質位于催化復合體、蛋白質復合體、細胞骨架，通過與碳水化合物衍生物、蛋白質或嘌呤核苷三磷酸結合，參與蛋白質分解代謝，引起蛋白質降解、細胞凋亡和蛋白水解等變化，進而影響肌肉結構發生變化，導致組織能量水平降低，最終影響秦川牛肉的嫩度、MFI及保水性。