脈沖電場處理對豬肉中N-羥乙酰神經氨酸含量及豬肉食用品質的影響

劉楚鑫，婁愛華，吳艷陽，何恩祺，鄭婉婷，何榮鑫，沈清武

（湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 414000）

脈沖電場（pulsed electric fields，PEF）作為一種利用高強度（0.1～40 kV/cm）、窄脈沖寬（0～100 μs）和高頻率（0～2 000 Hz）高壓脈沖電的新型食品非熱加工技術[1-2]，具有快速、高效、低功耗和低污染等優點，在食品保鮮以及輔助發酵、提取、干燥、冷凍和解凍等領域已取得大量研究成果[3]。在肉制品領域，PEF技術最大的優點是能改善肉類（牛肉、雞肉、羊肉和豬肉等）嫩度，但在一定電場強度內也會間接影響肉的pH值和色澤，其能破壞動物細胞膜并在處理過程中會產生熱量。除了提高嫩度，PEF技術還會降低冷凍羊肉中脂肪酸含量和增加氨基酸含量，以及提高豬肉腌制時食鹽擴散速率等[4-7]。Kantono等[8]研究發現，PEF處理提高了牛肱二頭肌和半膜肌的嫩度，改善了牛肉色澤，但PEF處理會增加脂肪氧化和飽和脂肪酸含量。在豬肉的生產加工中，PEF技術主要用于提高腌制速率，McDonnell等[9]研究證明PEF處理后豬肉中食鹽含量顯著增加，但是腌制過程中豬肉的pH值和質構特性沒有顯著變化。雖然PEF技術對肉類的嫩化和加速腌制等有一定促進作用，但若將PEF技術在肉類加工領域中普及還需對PEF技術進行更深入的研究。

N-羥乙酰神經氨酸（N-glycolylneuraminicacid，Neu5Gc）屬于一種唾液酸，是一種含有11 個碳原子的酸性氨基糖，常存在于糖蛋白和糖脂分子中聚糖鏈的非還原末端[10-11]。Neu5Gc主要以結合態的形式存在于糖蛋白和神經節苷脂中，在哺乳動物中普遍存在。紅肉為人類提供了高質量的蛋白質、多種脂肪酸、維生素和礦物元素等營養成分，大量流行病學研究得出結論，食用紅肉會加重動脈粥樣硬化和心血管等疾病甚至癌癥[12-13]。紅肉中Neu5Gc引起的慢性炎癥是與紅肉相關的多種疾病的共同發病機制[14]。Kawanishi等[15]采用Cmah－/－小鼠模擬人類攝入Neu5Gc后對動脈粥樣硬化的影響，結果證明動脈粥樣硬化的發病率顯著增加。Martin等[11]也證明了攜帶抗Neu5Gc抗體的杜氏肌肉營養不良癥患者在攝入富含Neu5Gc的食物后會加劇該病癥。我國是豬肉生產和消費大國，近年來我國各種心血管疾病、2型糖尿病和各種癌癥等疾病發病率的增加可能與我國肉類消費量的增加有關。因此，降低長期食用紅肉而帶來的健康風險成為紅肉及其制品研究中的重要課題。紅肉中Neu5Gc的含量直接決定了進入人體胃腸道可被消化吸收Neu5Gc的含量，是決定其生物危害大小的關鍵因素。有研究表明，電刺激能降低牛肉糜中Neu5Gc含量，牛肉糜經120 V、50 s電刺激后其中Neu5Gc含量可降低（74.24±0.69）%，電刺激可以通過電荷轉移和誘導極化效應直接影響Neu5Gc分子[16]。鄭婉婷等[17]研究加工方式對豬肉塊中Neu5Gc含量的影響，經過蒸煮、油炸和腌制處理后，豬肉中Neu5Gc含量顯著降低，其中油炸后Neu5Gc含量可降低53.10%。梁美蓮等[18]也證明了油炸能降低牛肉塊中Neu5Gc含量，具有解離效果。在對降低紅肉中Neu5Gc的報道中，大部分是紅肉加工對其含量影響的研究，對加工前新鮮紅肉的研究較少。

本研究首先分析PEF處理對Neu5Gc標準品水溶液和豬頜下腺黏蛋白（porcine submaxillary gland mucin，PSM）水溶液中Neu5Gc的影響，在發現PEF技術對結合態Neu5Gc有顯著降低效果后，進而探究PEF處理對豬肉塊和豬肉糜中Neu5Gc的影響，最后研究PEF處理對豬肉塊和肉糜pH值、色澤和質構特性的影響，旨在為降低豬肉中Neu5Gc含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬里脊肉 長沙濱湖東之源超市；新鮮豬頜下腺 長沙廣聯豬場。

連二亞硫酸鈉、三氟乙酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；β-巰基乙醇（色譜純） 美國Amresco公司；Neu5Gc標準品、1,2-二氨基-4,5-亞甲基二氧苯鹽酸鹽（1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene dihydrochloride，DMB）美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

PEF儀由華南理工大學自制；MJ-LZ225絞肉機廣東美的生活電器制造有限公司；LC-20A熒光高效液相色譜儀 島津企業管理（中國）有限公司；T滲透205便攜式pH計 德圖儀表（深圳）有限公司；CS-580 A分光測色儀 杭州彩譜科技有限公司；食品物性測試儀英國Stable Micro Systems公司；T 10 basic S25勻漿機艾卡（廣州）儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豬肉塊和肉糜制備

新鮮豬里脊肉切成半徑4 cm、高1 cm、質量70 g的圓柱形肉塊，備用。

新鮮豬里脊肉切碎，用絞肉機絞成肉糜，壓成半徑4 cm、高度1 cm、質量70 g的圓柱形肉糜，備用。

1.3.2 PSM制備

參照Banda等[19]的方法提取PSM。稱取豬頜下腺肉樣50 g，洗凈、去除表面脂肪、筋膜等雜質。將處理好的肉樣切碎，加入5 倍體積水，勻漿，8 000 r/min、4 ℃冷凍離心15 min。離心完成后上清液用玻璃棉過濾。調節濾液pH值至3.5，4 ℃搖晃12 h，再放入4 ℃冰箱靜置12 h。去除樣品中靜置后的上清液，沉淀用4 ℃超純水清洗后400 r/min、4 ℃離心10 min，去除上清液，再重復離心。去除上清液，將沉淀pH值調至8.0，裝入截留分子質量為10 kDa的透析袋，加入20 倍體積的水，4 ℃透析24 h，每隔12 h換一次透析液，直至透析袋中樣品體積膨脹5 倍以上。溶液冷凍干燥24 h以上備用。

1.3.3 PEF處理

將Neu5Gc標準品與PSM溶于水，0.33 mg/mL Neu5Gc標準品水溶液和1 mg/mL PSM水溶液各取3 mL，置于半徑為1 cm的圓柱形處理室中，液體高度為1 cm，進行PEF處理。

將制備好的豬肉塊和肉糜分別置于半徑為4 cm的圓柱形處理室中，肉塊和肉糜高度為1 cm，進行PEF處理。

PEF處理參數為1、2、3、4 kV/cm，各電擊50 次。以未經PEF處理的樣品為對照組。

1.3.4 Neu5Gc定量分析

參考Samraj等[14]的方法，采用高效液相色譜法對樣品中Neu5Gc進行定量分析。Neu5Gc標準品水溶液和PSM水溶液與0.11 mmol/L氫氧化鈉溶液混勻后備用。肉樣在液氮中研磨，加入0.1 mmol/L氫氧化鈉溶液，用勻漿機勻漿后37 ℃水浴30 min并用鹽酸中和。然后取適量樣品于80 ℃水解，將結合態Neu5Gc水解為游離態Neu5Gc，用于測定樣品中總Neu5Gc。另取適量樣品在室溫放置，用以測定樣品中游離態Neu5Gc。

總Neu5Gc 含量的測定：將水解后的樣品與含14 mmol/L DMB、18 mmol/L連二亞硫酸鈉、0.75 mol/Lβ-巰基乙醇、1.6 mol/L冰醋酸的溶液混合進行衍生，于50 ℃避光衍生2.5 h。用超純水稀釋5 倍后過濾備用。

游離態Neu5Gc含量的測定：將水解后的樣品與含14 mmol/L DMB、18 mmol/L連二亞硫酸鈉、1 mol/Lβ-巰基乙醇、40 mmol/L三氟乙酸的溶液混合進行衍生，于4 ℃避光衍生48 h。用超純水稀釋5 倍后過濾備用。

檢測條件：色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；熒光檢測器激發波長373 nm，發射波長448 nm；流動相為甲醇-乙腈-超純水（7∶5∶88，V/V）；流速0.9 mL/min；進樣體積10 μL。

通過比較標準品溶液及樣品中游離態Neu5Gc保留時間進行定性，用標準品溶液所得色譜峰響應值繪制標準曲線，根據待測組分的峰面積，利用外標法計算樣品中游離態Neu5Gc含量。結合態Neu5Gc含量按下式計算。

式中：C0為結合態Neu5Gc含量/（μg/g）；C1為游離態Neu5Gc含量/（μg/g）；C2為總Neu5Gc含量/（μg/g）。

1.3.5 豬肉塊和肉糜pH值測定

將pH計與豬肉塊和肉糜充分接觸，待數值穩定后，讀取并記錄數據。每組重復測定3 次，計算平均值。

1.3.6 豬肉塊和肉糜色澤測定

PEF處理后的豬肉塊和肉糜放入培養皿中，隨機選取5 點測定亮度（L*）、紅度（a*）、黃度（b*）值。

1.3.7 豬肉塊和肉糜質構特性測定

將豬肉塊和肉糜切成2 cm×2 cm×1 cm的小塊，使用食品物性測試儀對其質構特性進行測定，每組5 個平行。檢測參數：P/36R探頭、測前速率1 mm/s、測中速率2 mm/s、測后速率2 mm/s、觸發力5.0 g、應變50.0%、時間5.00 s。

1.4 數據處理與分析

使用SPSS Statistics 25軟件對實驗數據進行方差分析（以P＜0.05表示差異顯著），每組實驗3 個平行。采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 PEF對Neu5Gc標準品水溶液和PSM溶液中游離態Neu5Gc和結合態Neu5Gc含量的影響

由圖1可知，在Neu5Gc標準品水溶液中，與對照組相比，在1 kV/cm和2 kV/cm電場強度下，PEF處理后游離態Neu5Gc質量濃度無顯著變化（P＞0.05），當電場強度增加到3 kV/cm以上時，游離態Neu5Gc質量濃度顯著下降（P＜0.05），從對照組的0.29 mg/mL下降至0.26 mg/mL。

圖1 PEF處理對Neu5Gc標準品水溶液中游離態Neu5Gc質量濃度的影響Fig.1 Effect of PEF treatment on the content of free Neu5Gc in Neu5Gc standard solution

由圖2可知，PSM中含有大量結合態Neu5Gc，PEF處理后，隨著電場強度的增加，PSM溶液中總Neu5Gc質量濃度顯著下降（P＜0.05），從49.66 μg/mL下降至4.55 μg/mL，游離態Neu5Gc質量濃度從3.36 μg/mL下降至0.45 μg/mL。PSM中結合態Neu5Gc質量濃度顯著下降（P＜0.05），從46.30 μg/mL下降至1.19 μg/mL。

在紅肉中，Neu5Gc主要以結合態的形式存在，游離態Neu5Gc含量很少。根據Banda等[19]的報道，結合態Neu5Gc會在人體內沉積，而游離態Neu5Gc則隨著人體代謝排出，因此對人體健康產生危害的主要為結合態Neu5Gc。由于Neu5Gc主要存在于糖蛋白上，目前尚未有成熟的結合態Neu5Gc定量檢測方法，最常見的方法是將結合態Neu5Gc解離成游離態Neu5Gc，采用液相色譜法測定總Neu5Gc含量和游離態Neu5Gc含量，通過這種間接的方法分析結合態Neu5Gc含量的變化。

游離態Neu5G屬于氨基糖，具有較強的穩定性，在分子內可形成3 個較強的氫鍵，這可能是其穩定的原因，破壞其結構可能需要更高的電場強度[20-21]。在PSM中，大部分Neu5Gc存在于蛋白質寡糖鏈上，兩者以共價鍵相連。據報道，PEF能誘導蛋白質的某些修飾，如折疊、聚集，從而改變蛋白結構和功能特性，這可能是PSM中結合態Neu5Gc含量降低的原因[22-23]。研究表明，當電場強度超過35 kV/cm時，大豆分離蛋白二級結構中的氨基酸側鏈、反平行β-折疊、β-折疊和β-轉角相對含量發生顯著改變[24]。這也證明了PEF具有改變蛋白質結構的能力，但是PEF處理后PSM中結合態Neu5Gc結構變化情況仍然未知，其解離機制還需進一步研究。

2.2 PEF對豬肉中Neu5Gc含量的影響

由圖3可知，與對照組相比，肉塊中總Neu5Gc含量呈下降趨勢，在4 kV/cm時顯著下降（P＜0.05），從對照組的6.41 μg/g下降到4.46 μg/g。肉塊中結合態Neu5Gc含量整體呈下降趨勢，在4 kV/cm時其含量低于其他處理組，從對照組的4.16 μg/g下降到2.21 μg/g。

圖3 PEF處理對豬肉塊中Neu5Gc含量的影響Fig.3 Effect of PEF treatment on the content of Neu5Gc in meat pieces

為探究將豬肉塊結構破壞后再進行P E F處理對Neu5Gc含量的影響與肉塊是否不同，將豬肉塊絞成肉糜再進行PEF處理。由圖4可知，與對照組相比，PEF處理后肉糜中總Neu5Gc含量顯著降低（P＜0.05），從對照組的10.39 μg/g下降到4 kV/cm時的5.63 μg/g。肉糜中游離態Neu5Gc含量僅1 kV/cm PEF處理組與對照組相比有顯著差異（P＜0.05），其他電場強度組與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。PEF處理后肉糜中結合態Neu5Gc含量顯著下降（P＜0.05），從8.87 μg/g下降到了4.11 μg/g。在4 kV/cm時，豬肉塊和肉糜中結合態Neu5Gc含量均較對照組顯著下降（P＜0.05），但是PEF處理對肉糜中結合態Neu5Gc解離的效果較肉塊好。從豬肉塊和肉糜中Neu5Gc含量變化情況可知，PEF處理能一定程度降低豬肉中Neu5Gc含量，但是其降低程度低于PSM溶液中結合態Neu5Gc降低程度。

圖4 PEF處理對豬肉糜中Neu5Gc含量的影響Fig.4 Effect of PEF treatment on the content of Neu5Gc in minced meat

相比于水溶液，豬肉含有結締組織、脂肪組織和肌肉組織等，PEF在豬肉中產生的影響也更復雜。PEF處理豬肉時，由于細胞膜電阻比細胞內和細胞外液中的電解質高，因此電場主要作用于細胞膜，導致細胞膜磷脂雙層被擊穿并破壞細胞膜上的蛋白質，存在于豬肉細胞膜蛋白聚糖鏈末端的Neu5Gc也受到破壞，這可能是PEF處理使豬肉中結合態Neu5Gc解離的主要原因[25-26]。PEF在豬肉糜中的作用情況較肉塊更復雜，PEF技術降低肉糜中結合態Neu5Gc含量的效果要比肉塊好的原因、豬肉中Neu5G和與其相連的蛋白在PEF作用下結構的變化規律以及是否還存在影響Neu5Gc含量的其他因素，還有待進一步研究。

2.3 PEF對豬肉pH值的影響

由圖5可知，1 kV/cm PEF處理后豬肉塊的pH值與對照組相比無顯著變化（P＞0.05）。Chian等[27]使用1.00～1.25 kV/cm的電場強度對牛胸最長肌進行PEF處理，發現pH值無顯著改變，與本實驗中1 kV/cm PEF處理豬肉的結果一致。經2 kV/cm和4 kV/cm PEF處理后，豬肉塊的pH值與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。PEF處理肉糜后，1 kV/cm以上電場強度組的pH值與對照組相比均有顯著差異（P＜0.05）。豬肉pH值的改變可能是由于PEF處理引起肉塊和肉糜中蛋白質水解導致肽的釋放[28]。

圖5 PEF處理對豬肉塊和肉糜pH值的影響Fig.5 Effect of PEF treatment on pH of meat pieces and minced meat

2.4 PEF對豬肉色澤的影響

由圖6可知，隨著電場強度增加，豬肉塊的L*值呈上升趨勢，在2 kV/cm以上的電場強度組的L*值與對照組相比均有顯著差異（P＜0.05）。1 kV/cm PEF處理后豬肉塊的a*值與對照組相比差異顯著（P＜0.05），其他電場強度組與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），但隨著電場強度增加呈上升趨勢。與對照組相比，PEF處理后豬肉塊的b*值均無顯著性差異（P＞0.05）。3 kV/cm PEF處理后豬肉糜的L*值與對照組相比顯著增加（P＜0.05）。豬肉糜a*值僅在1 kV/cm和2 kV/cm PEF處理后與對照組相比顯著升高（P＜0.05）。在3 kV/cmPEF處理后豬肉糜的b*值較對照組顯著降低（P＜0.05）。

圖6 PEF處理對豬肉塊和肉糜L*（A）、a*（B）和b*（C）值的影響Fig.6 Effect of PEF treatment on the L* (A),a* (B) and b* (C) values of meat pieces and minced meat

肉色是決定肉類感官品質的主要因素，PEF技術對肉色的影響主要取決于處理過程中溫度升高的幅度，低脈沖電場（2.5 kV、200 Hz）處理后雞肉的平均溫度升高3.1 ℃，高脈沖電場（10 kV、200 Hz）處理后雞肉的平均溫度升高17.1 ℃，肉中的電阻和電導率越高、處理時間越長，升溫越高，產生歐姆加熱效應越強，導致色澤改變[29-30]。研究證明低電場強度（0.66、1.38、2.00 kV/cm）的PEF處理對鮮肉的L*、a*和b*值沒有顯著影響[31-32]。本研究用低于2 kV/cm的電場強度處理豬肉，對豬肉L*和b*值無顯著影響。

2.5 PEF對豬肉質構特性的影響

由圖7可知，在0～4 kV/cm電場強度范圍內，豬肉塊的硬度、咀嚼性、彈性和黏聚性均呈先下降再上升的趨勢。PEF處理后豬肉塊的硬度較對照組低，并在2 kV/cm時顯著低于對照組（P＜0.05）。豬肉塊的咀嚼性、彈性和黏聚性在1～3 kV/cm PEF處理后均顯著低于對照組（P＜0.05）。隨著電場強度增加，豬肉糜的硬度和咀嚼性呈下降趨勢，分別在4 kV/cm和3 kV/cm PEF處理后顯著低于對照組（P＜0.05）。不同電場強度PEF處理后肉糜的彈性無顯著變化（P＞0.05）。僅在1 kV/cm PEF處理后豬肉糜的黏聚性顯著高于對照組（P＜0.05）。Jeong等[33]用PEF處理新鮮牛肉，發現牛肉的嫩化與電場強度的增加成正比，表明PEF能夠改善肉的質構，提高肉品質。

圖7 PEF處理對肉塊和肉糜硬度（A）、咀嚼性（B）、彈性（C）和黏聚性（D）的影響Fig.7 Effect of PEF treatment on the hardness (A),chewiness (B),elasticity (C) and cohesiveness (D) of meat pieces and minced meat

PEF改善豬肉品質可能是因為在處理過程中，豬肉細胞中的鈣離子被釋放并激活鈣蛋白酶，促進了鈣蛋白酶活性，導致豬肉的肌纖維和結締組織破壞和蛋白質降解[34-36]。然而，其他因素如溶酶體釋放的組織蛋白酶、鈣釋放引起的糖酵解加速和肌肉的物理損害均有可能影響嫩度[1]。Bhat等[31]研究發現，PEF處理后牛肉中鈣蛋白酶2活性增加，結蛋白和肌鈣蛋白-T的蛋白水解增加。Chian等[27]研究PEF對牛肉肌肉超微結構的影響，發現PEF處理后牛肉的Z盤和I帶減弱，導致其肌節比對照長25%～38%，這表明PEF處理導致肌肉纖維的物理破壞。總之，PEF能夠提高肉的嫩度，改善肉的品質。

3 結論

本實驗研究PEF技術對豬肉中Neu5Gc和對豬肉pH值、色澤和質構特性的影響。豬肉中Neu5Gc分為結合態和游離態，其在肉中主要以結合態形式存在，且結合態Neu5Gc會危害人體健康，因此主要觀察結合態Neu5Gc的含量變化規律。用PEF技術處理富含結合態Neu5Gc的PSM溶液和游離態Neu5Gc標準品溶液的結果表明，處理后PSM中結合態Neu5Gc質量濃度顯著下降，從對照組的46.30 μg/mL下降到4 kV/cm的1.19 μg/mL，兩者游離態Neu5Gc質量濃度都呈下降趨勢。在PEF處理豬肉后，結合態Neu5Gc的降低程度沒有PSM的明顯。豬肉塊中結合態Neu5Gc含量僅在4 kV/cm PEF處理后顯著降低，PEF處理后豬肉糜中結合態Neu5Gc含量均顯著比對照組低，且隨電場強度增加呈下降趨勢。肉類結構復雜，結合態Neu5Gc在PEF作用下的變化機制還需進一步研究，這有助于更有效地降低肉中結合態Neu5Gc，降低紅肉生物危害性。此外，雖然在一定電場強度下PEF技術對豬肉的pH值和色澤有影響，但其能顯著降低豬肉塊的咀嚼性和彈性，在肉類加工中具有較大的應用潛力。