陳年武夷巖茶對葡聚糖硫酸鈉誘導小鼠結腸炎的緩解作用及腸道菌群的影響

曾鴻哲，方雯雯，周 方，唐靜怡，岳 林，歐陽建，陳金華，王英姿，黃建安，劉仲華

（湖南農業大學 茶學教育部重點實驗室，國家植物功能成分利用工程技術研究中心，植物功能成分利用省部共建協同創新中心，農業農村部園藝作物基因資源評價利用重點實驗室，湖南 長沙 410128）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一類常見的慢性胃腸道疾病，包括克羅恩病（Crohn’s disease，CD）和潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）[1-2]，其中UC最為常見。在過去的30 年內，IBD發病率在全球呈上升趨勢，尤其在發達國家表現明顯[3-4]。葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導的結腸炎小鼠是一個被廣泛使用的模型，其主要特征是小鼠體質量減輕、腹瀉、便血、結腸長度縮短、炎癥標志物表達水平增加和腸道菌群紊亂等[5-7]。IBD復雜的發病機制和多種環境因素的干擾[8]對于設計有效的IBD治療方法是一個巨大挑戰，考慮到目前治療IBD中存在的困難，通過飲食干預等措施降低IBD發生的風險變得尤為重要。目前的研究表明，腸道菌群紊亂包括某些保護性細菌（如Akkermansia）數量的減少或致病細菌（如Escherichia）數量的增加等，從而導致腸道炎癥的發生[9-10]。近年來，有研究進一步證明IBD特征腸道菌群的出現先于IBD的發病[11]，因此，腸道菌群可作為預測IBD發生以及評價IBD治療效果的重要指標。

武夷巖茶是中國傳統名茶，因其獨特的“巖骨花香”而聞名于世，屬于半發酵的烏龍茶類。長期的民間飲用實踐表明，武夷巖茶具有調理腸胃不適、緩解腹瀉等作用[12]，但目前還鮮見武夷巖茶對DSS誘導小鼠結腸炎影響的相關研究報道。近年來，隨著我國茶葉產量不斷提高，茶產業供過于求的趨勢不斷加劇，大量茶葉因未能及時銷售而被存放，成為陳茶。在貯藏過程中[13]，茶葉中的茶多酚等功能成分的含量發生了變化。因此，本實驗選擇了2 種不同年份（2001年、2011年）的陳年武夷巖茶和1 種非陳年武夷巖茶（2020年），通過建立DSS誘導的小鼠結腸炎模型，評估陳年武夷巖茶對小鼠結腸組織病理學特征、結腸炎性細胞水平、血清炎癥因子水平和腸道菌群的影響，以期為通過健康屬性驅動陳年武夷巖茶的科學消費提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

50 只SPF級6～7 周齡雌性C57BL/6JGpt小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2018-0008。

武夷巖茶（2001年大紅袍、2011年大紅袍和2020年大紅袍）由福建武夷山市茶產業發展中心提供，為同一茶樹品種、同一級別的鮮葉原料加工精制而成，包裝后貯存于干燥、無異味、清潔、陰涼的茶葉貯存室中，環境溫度常年控制在25 ℃以內，相對濕度控制在50%以內。

白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等酶聯免疫分析試劑盒（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）購于武漢華美生物工程有限公司；DSS購于美國MP Biomedicals公司。

1.2 儀器與設備

多功能酶標分析儀 深圳市匯松科技發展有限公司；ECLIPSE Ci正置顯微鏡 日本尼康公司；聚合酶鏈式反應儀（polymerase chain reaction，PCR） 美國賽默飛公司；NovaSeq6000測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 武夷巖茶提取物的制備及灌胃劑量的選擇

武夷巖茶提取物制備：稱取25 g茶樣，加入500 mL的沸水，在100 ℃水浴中提取45 min，過濾后，重復提取茶樣30 min，將濾液合并后冷凍干燥。將制備的武夷巖茶提取物按照每天450 mg/kgmb的劑量灌胃小鼠，根據體表面積歸一化方法按式（1）推算[14-15]，灌胃劑量相當于人體每日約飲茶7.8 g，一般而言，武夷巖茶每泡茶為8 g，這相當于每人每天喝1 泡茶，在合理范圍內。

式中：D為灌胃劑量（0.45 g/kgmb）；m為人體質量（60 kg）；C為換算系數（12.33）；R為浸提率（28%）。

1.3.2 動物實驗

動物實驗經湖南農業大學動物實驗委員會批準，批準號：[倫審科2021第（2138）號]，動物房溫度24～26 ℃，12 h/12 h明暗循環，小鼠自由飲水進食。

50 只雌性C57BL/6JGpt小鼠適應性喂養1 周后，以每組10 只隨機均分為5 組：正常對照組（Control）；DSS模型組；DSS+OT01組（灌胃20 年陳茶即2001年武夷巖茶提取物）；DSS+OT11組（灌胃10 年陳茶即2011年武夷巖茶提取物）；DSS+OT20組（灌胃非陳茶即2020年武夷巖茶提取物）。除對照組之外，其他組通過連續7 d采用在飲水中加入質量分數3% DSS的方法構建小鼠建立腸炎模型[7,16]，所有小鼠在處死前的最后2 d飲用蒸餾水。DSS+OT01組、DSS+OT11組和DSS+OT20組在實驗過程中接受劑量為450 mg/kgmb武夷巖茶的干預，共持續9 d。每天監測小鼠結腸炎癥狀，包括糞便特征、出血狀況和體質量情況。解剖后，收集結腸組織、盲腸內容物和血清并貯存以便后續分析。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 武夷巖茶提取物的化學成分分析

武夷巖茶提取物的成分測定：依據GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》進行茶多酚總質量分數測定，采用高效液相色譜法[17]檢測6 種兒茶素組分質量分數；根據系統分析法測定茶三素（茶黃素類（theaflavins，TFs）、茶紅素類（thearubigins，TRs）和茶褐素（theabrownine，TB））質量分數。

1.3.3.2 實驗小鼠日常指標觀測

根據文獻[18-19]描述的方法觀測實驗小鼠的日常指標，按動物體質量下降率（大于15%為4 分，10%～15%為3 分，5%～10%為2 分，1%～5%為1 分，體質量不變為0 分）、糞便黏稠度（腹瀉為4 分，糞便松散為2 分，正常為0 分）和糞便出血（顯性出血為4 分，隱性出血陽性為2 分，正常為0 分）情況進行綜合評價。以上述各項評分為相應指數，按式（2）計算疾病活動指數（disease activity index，DAI）。

1.3.3.3 實驗小鼠結腸組織病理學分析

首先取小鼠結腸組織并固定在質量分數4%多聚甲醛固定液中，包埋之后做切片，使用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染色。根據文獻[7,20]描述的方法進行組織病理學分析及結腸炎癥相關組織學評分（表1）。

表1 結腸炎癥相關組織學評分標準Table 1 Criteria for evaluation of inflammation-associated cecal histological changes

1.3.3.4 實驗小鼠血清和結腸炎癥因子檢測

小鼠眼珠取血后，室溫靜止2 h后，4 ℃離心1 次（3 500 r/min、15 min），收集血清，置于－80 ℃冰箱保存。取50 mg結腸組織，用1×磷酸鹽緩沖液洗去血污。剪成小塊放入組織研磨器（勻漿管）中，加入0.5 mL 1×磷酸鹽緩沖液，制成勻漿，然后置于－20 ℃過夜。經過反復凍融2 次處理破壞細胞膜后，將組織勻漿于2～8 ℃、5 000×g條件下離心5 min并取上清液。嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測各組小鼠血清和結腸炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的水平。

1.3.3.5 小鼠盲腸內容物菌群分析

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法對樣本的基因組DNA進行提取，之后通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析，取適量樣品用無菌水稀釋至1 ng/μL，選擇V3～V4高變區作為目標測序區，正向引物為341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’），反向引物為806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）。構建好的文庫經過Qubit定量和文庫檢測，合格后使用NovaSeq6000測序儀進行測序，序列分析通過QIIME2軟件包進行[21]。

1.4 數據統計與分析

所有數據使用SPSS Statistics 20.0軟件進行分析，實驗結果采用平均值±標準差表示。各組比較應用方差分析法，運用Tukey檢驗兩兩比較，當P＜0.05時具有統計學顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 陳年武夷巖茶水提物主要成分含量分析結果

陳年武夷巖茶水提物的主要成分含量如表2所示。茶多酚、兒茶素總量、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表兒茶素（epicatechin，EC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）和兒茶素（catechin，DL-C）質量分數隨著貯存時間延長整體呈下降趨勢；TB質量分數呈現整體上升趨勢；此外，TFs和TRs質量分數呈現出先上升再下降的趨勢。

表2 陳年武夷巖茶提取物主要成分質量分數Table 2 Contents of phenolic components in infusion of aged Wuyi rock tea

2.2 小鼠的體質量、腹瀉評分和DAI變化

小鼠的體質量變化情況如圖1A所示，實驗前期，小鼠的體質量變化較為穩定。從第5天開始，經過DSS處理的4 組小鼠體質量開始下降，其中DSS組體質量下降最為明顯；經過9 d的武夷巖茶干預后，DSS+OT11組和DSS+OT20組小鼠體質量均與DSS組出現顯著性差異（P＜0.05）。實驗結束時（第9天）各組小鼠的腹瀉程度如圖1B所示，Control組小鼠均未出現腹瀉情況，與經過DSS處理的4 組小鼠有顯著差異（P＜0.05）；DSS組小鼠均出現嚴重腹瀉情況，與經過陳年武夷巖茶干預的2 組小鼠有顯著差異（P＜0.05）。小鼠的疾病嚴重程度變化如圖1C所示，由于DSS引發的腸道炎癥反應，小鼠糞便從第3天開始呈松散狀；到第4天，糞便開始隱性出血，并隨著DSS處理時間的延長；到第6天糞便已無具體形態，并且部分小鼠有明顯糞便帶血和輕微的脫肛現象；小鼠經過DSS處理和陳年武夷巖茶干預后，腹瀉情況和便血情況得到顯著緩解（P＜0.05）。雖然陳年武夷巖茶干預能夠一定程度緩解DSS帶來的不良反應，但是綜合來看，緩解效果DSS+OT11組≈DSS+OT20組＞DSS+OT01組。

圖1 陳年武夷巖茶對DSS誘導結腸炎小鼠體質量、腹瀉評分及DAI的影響Fig.1 Effect of aged Wuyi rock tea on body mass,diarrhea score and DAI of mice with DSS-induced colitis

2.3 陳年武夷巖茶對DSS誘導小鼠結腸的影響

如圖2A和圖2B所示，DSS組小鼠結腸長度較Control組顯著縮短（P＜0.05）；陳年武夷巖茶干預的2 組小鼠結腸長度有所恢復，并與模型組相比差異顯著（P＜0.05），但DSS+OT20組結腸長度恢復情況最好，與Control組相比基本恢復正常。圖2C的H&E染色結果表明，陳年武夷巖茶干預能夠緩解DSS引起的腸道黏膜、隱窩損壞和炎性細胞浸潤；基于H&E染色的結腸炎癥組織學評分進一步顯示，陳年武夷巖茶干預的效果有所不同，其中DSS+OT20組與DSS+OT11組效果接近，且優于DSS+OT01組（圖2D）。

圖2 陳年武夷巖茶對DSS誘導結腸炎小鼠結腸長度、結腸組織學和炎癥相關組織學評分的影響Fig.2 Effect of aged Wuyi rock tea on colon length,colon histology and inflammation-associated histological score of mice with DSS-induced colitis

2.4 陳年武夷巖茶對DSS誘導小鼠炎癥因子的影響

由圖3可知，與Control組相比，DSS組血清和結腸中的IL-6、TNF-α和IL-1β水平都顯著提高（P＜0.05）；與DSS組相比，經過武夷巖茶干預的3 組小鼠血清和結腸中的IL-6、TNF-α和IL-1β水平都呈不同程度地顯著下降（P＜0.05），其中DSS+OT01組血清中的TNF-α水平，DSS+OT11組血清中的TNF-α、IL-1β水平，DSS+OT20組血清中的TNF-α、IL-1β水平，DSS+OTs結腸中的IL-6、TNF-α水平均恢復正常。綜合來看，對炎癥因子影響效果DSS+OT11組≈DSS+OT20組＞DSS+OT01組。

2.5 陳年武夷巖茶對DSS誘導小鼠腸道菌群的影響

2.5.1 陳年武夷巖茶對DSS誘導小鼠腸道菌群結構的影響

微生物對于結腸炎的發展至關重要，通過調節腸道菌群改善結腸炎是目前的研究熱點[22]。因此，本研究利用實驗結束時收集的盲腸內容物進行了16S rDNA的V3～V4區PCR擴增后測序，以檢測腸道微生物的變化。由圖4A和圖4B可知，與DSS組相比，陳年武夷巖茶干預組的Shannon指數以及Simpson指數均無統計學差異。如圖4C所示，主坐標分析結果顯示不同組間微生物群落結構有明顯差異，陳年武夷巖茶干預使DSS誘導小鼠腸道菌群結構向Control組變化。

圖4 陳年武夷巖茶對DSS誘導結腸炎小鼠腸道微生物區系組成的影響Fig.4 Effect of aged Wuyi rock tea on gut microbiota composition of mice with DSS-induced colitis

圖5A～C反映了腸道微生物在門、科、屬3 個層面的相對豐度，以區分微生物類群。如圖5A所示，小鼠腸道微生物主要由5 個門組成，包括Firmicutes、Bacteroidetes、Verrucomicrobia、Proteobacteria和Deferribacteres。與Control組相比，DSS組的Proteobacteria和Deferribacteres的相對豐度增加，而Firmicutes、Bacteroidetes和Verrucomicrobia的相對豐度降低。在科水平上，與Control組相比，DSS組的Enterobacteriaceae、Rikenellaceae和Deferribacteraceae的相對豐度增加，而Verrucomicrobiaceae、Odoribacteraceae和Coriobacteriaceae的相對豐度降低（圖5B）。在屬水平上，與Control組相比，DSS組的Unspecified_Enterobacteriaceae、Oscillospira、Unspecified_Rikenellaceae、Unspecified_Bacteroidales、Mucispirillum、Unspecified_Desulfovibrionaceae、Escherichia、Parabacteroides、Enterococcus和Alistipes的相對豐度增加，而Akkermansia、Odoribacter、Desulfovibrio和Adlercreutzia的相對豐度降低（圖5C），陳年武夷巖茶干預明顯影響了腸道菌群的構成，特別是逆轉了DSS導致的Verrucomicrobia、Proteobacteria、Enterobacteriaceae、Verrucomicrobiaceae、Odoribacteraceae、Unspecified_Enterobacteriaceae、Oscillospira、Unspecified_Bacteroidales、Escherichia、Enterococcus、Akkermansia和Odoribacter相對豐度變化。新型的元基因組學分析方法線性判別分析效應大小（linear discriminate analysis size effect，LefSe）分析（圖5D）和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）（圖5E）顯示了各組中的優勢菌群，Firmicutes、Lachnospiraceae、Desulfovibrionaceae、Ruminococcus、Coprococcus、Desulfovibrio和Roseburia是Control組的優勢菌群；Deferribacteres、Proteobacteria、Ruminococcaceae、Deferribacteraceae、Lactobacillaceae、Enterobacteriaceae、Escherichia、Oscillospira、Mucispirillum、Lactobacillus和Enterococcus是DSS組的優勢菌群；Bacteroidetes、Odoribacteraceae和Odoribacter是DSS+OT01組的優勢菌群；Turicibacteraceae、Turicibacter和AF12是DSS+OT11組的優勢菌群；Verrucomicrobia、Verrucomicrobiaceae和Akkermansia是DSS+OT20組的優勢菌群。

圖5 陳年武夷巖茶對DSS誘導結腸炎小鼠腸道微生物相對豐度及LEfSe分析的影響Fig.5 Effect of aged Wuyi rock tea on the relative abundance of gut microbiota and LEfSe analysis of mice with DSS-induced colitis

2.5.2 特定類群微生物變化與結腸長度相關性分析結果

在DSS誘導的結腸炎模型中，結腸炎小鼠結腸長度往往明顯縮短，結腸長度與腹瀉、炎癥因子過表達和腸道菌群失調密切相關，而通過特定的菌株灌胃干預可以有效地增加結腸長度，緩解體質量減輕，降低炎癥水平[23-25]。為了進一步分析武夷巖茶和DSS對不同菌的影響，本實驗評估了武夷巖茶干預后小鼠腸道菌群的變化。通過斯皮爾曼相關性分析進一步研究了特定細菌群相對豐度與結腸長度之間的相關性。如圖6所示，結腸長度與Actinobacteria（r＝0.523 5；P＝0.003 6）（圖6C）、S24_7（r＝0.571 7；P＝0.001 0）（圖6E）、Coriobacteriaceae（r＝0.603 0；P＝0.000 5）（圖6G）、Desulfovibrio（r＝0.496 4；P＝0.005 3）（圖6J）和Adlercreutzia（r＝0.613 8；P＝0.000 4）（圖6K）的相對豐度呈顯著正相關；結腸長度與Proteobacteria（r＝－0.535 6；P＝0.002 3）（圖6A）、Deferribacteres（r＝－0.475 1；P＝0.008 0）（圖6B）、Enterobacteriaceae（r＝－0.530 8；P＝0.002 5）（圖6D）、Deferribacteraceae（r＝－0.475 1；P＝0.008 0）（圖6F）、Mucispirillum（r＝－0.475 1；P＝0.008 0）（圖6H）和Escherichia（r＝－0.566 5；P＝0.001 1）（圖6I）的相對豐度呈顯著負相關。

圖6 特定菌群與結腸長度的相關性分析Fig.6 Correlation analysis between specific gut microbiota and colon length

2.6 陳年武夷巖茶多酚類物質含量與結腸炎小鼠炎癥水平的相關性分析

如圖7所示，茶多酚質量分數、兒茶素總質量分數及6 種兒茶素組分（EGCG、EGC、ECG、EC、GCG、DL-C）質量分數均與結腸中IL-6含量呈現顯著負相關（P＜0.05），與血清中TNF-α、IL-1β質量濃度以及結腸中IL-1β含量呈現極顯著負相關（P＜0.01）；TFs質量分數與血清中IL-6質量濃度、結腸中IL-1β含量呈現顯著負相關（P＜0.05），與結腸中IL-6、TNF-α含量以及血清中IL-1β質量濃度呈現極顯著負相關（P＜0.01）；TRs質量分數與血清中IL-6質量濃度呈現顯著負相關（P＜0.05），與結腸中IL-6含量、血清TNF-α質量濃度、血清IL-1β質量濃度、結腸IL-1β含量呈現極顯著負相關（P＜0.01）；TB質量分數與結腸中IL-6、TNF-α含量呈現極顯著負相關（P＜0.01）。綜上，TRs是與結腸炎小鼠炎癥水平相關性最明顯的功能成分。

圖7 陳年武夷巖茶多酚類物質含量與結腸炎小鼠炎癥水平的相關性分析Fig.7 Correlation analysis between polyphenol contents of aged Wuyi rock tea and serum and colonic inflammation in mice with DSS-induced colitis

3 討論

UC因其在世界范圍內的高流行率而廣為人知。本研究采用DSS誘導小鼠結腸炎模型模擬臨床UC，在3% DSS造模7 d后，DSS組小鼠糞便呈水樣并便血，表明造模成功[7]。本實驗結果發現雖然陳年武夷巖茶（2001年、2011年）干預無法直接阻止結腸炎的發生，但是能夠不同程度減輕相關損傷，表明武夷巖茶可以作為一種有效的飲食策略緩解結腸炎。

近年來，關于茶葉中的多酚物質在消炎、抗氧化等方面已有大量文獻報道[26]。有研究表明，茶葉中的活性成分EGCG對DSS誘導小鼠結腸炎有明顯改善作用，而臨床試驗進一步驗證了EGCG可以緩解結腸炎患者的癥狀[27-28]，因此，EGCG被認為是茶葉緩解DSS誘導小鼠結腸炎的主要功能成分。本實驗結果表明，隨著存儲時間的延長，兒茶素總質量分數及6 種兒茶素組分（EGCG、EGC、ECG、EC、GCG、DL-C）質量分數均明顯降低，TB質量分數明顯增加。傳統觀點將茶葉的抗氧化消炎等作用主要歸因于以EGCG為代表的多酚類物質[29]，而茶葉隨著貯存時間的延長，EGCG等多酚物質含量及多酚總量會發生明顯下降，從理論上分析，其抗氧化消炎活性也會發生明顯下降。但從本研究各個指標結果綜合來看，陳年武夷巖茶（2011年）和非陳年武夷巖茶（2020年）對DSS誘導的小鼠結腸炎的緩解作用無明顯差別，即經過10 年的貯存，其抗氧化消炎能力無明顯變化，出現這種矛盾的原因可能是EGCG等兒茶素的適當氧化聚合產物也具有很好的消炎抗氧化功能。Wu Ximing等[30]也得到了與本實驗相似的結果，其發現在緩解胰島素敏感性方面，EGCG部分氧化聚合產物的效果甚至優于EGCG。這也提示，由EGCG等兒茶素適當氧化聚合而成的多酚物質可能在陳茶抗氧化消炎功能中發揮著關鍵作用。與此同時，本實驗還發現陳年武夷巖茶（2001年）在緩解DSS誘導的小鼠結腸炎的體質量減輕、腹瀉、結腸損傷以及炎癥因子水平增加方面，與陳年武夷巖茶（2001年）和非陳年武夷巖茶（2020年）有一些差距。這可能是因為EGCG等兒茶素的適當氧化聚合產物雖然具有很好的消炎抗氧化功能，但隨著其進一步的氧化聚合，其抗氧化性會逐步減弱乃至消失，因而無法彌補由EGCG等功能成分含量減少導致的消炎抗氧化活性減弱。研究表明，EGCG等小分子質量多酚會發生氧化聚合先轉變為TFs，而TFs再進一步氧化得到TRs乃至TB[31]。本實驗中陳年武夷巖茶（2011年）組的TFs含量和TRs含量均高于另外一種年份的陳年武夷巖茶（2001年）和非陳年武夷巖茶（2020年）。陳年武夷巖茶多酚類物質含量與結腸炎小鼠炎癥水平的相關性分析表明，TRs是與結腸炎小鼠炎癥水平相關性最明顯的功能成分，因而推測這種潛在功能成分可能屬于TRs。下一步將分離純化武夷巖茶中的TRs，并將其按分子質量分成不同組分，在同一標準下進行EGCG、中等分子質量TRs及高分子質量TRs的抗氧化消炎活性研究。

腹瀉情況、疾病活動指數以及結腸病理切片是評估DSS誘導小鼠結腸炎的典型指標，能客觀準確地反映疾病的發展情況[7]。本實驗結果表明，陳年武夷巖茶干預可以顯著緩解腹瀉、便血以及疾病活動情況（圖1），這表明陳年武夷巖茶有助于維護腸道的正常功能。結腸病理學切片及組織學評分表明DSS會導致結腸的正常結構受到破壞，而陳年武夷巖茶干預能夠明顯緩解結腸腸道黏膜損壞、隱窩損壞以及炎性細胞浸潤，維持正常結腸形態（圖2）。Huang Yina等[32]采用3% DSS誘導小鼠結腸炎，并利用茶葉提取物進行干預，結果發現茶葉提取物顯著降低了結腸炎小鼠的疾病活動指數，抑制了結腸黏膜結構損傷和炎癥細胞浸潤，本實驗發現陳年武夷巖茶也具有相同的效果。在正常的機體中，血清中的促炎因子和抗炎因子處于平衡狀態，而DSS處理小鼠的血清中促炎因子往往過表達，破壞了正常機體的平衡[33]。因此，降低血清中促炎因子水平是緩解結腸炎的重要途徑。最近的研究表明，降低IL-1β、IL-6和TNF-α的表達可以明顯緩解DSS誘導的小鼠結腸炎癥狀[34]。在本研究中，DSS造模后小鼠結腸的炎性細胞浸潤增加（圖2B），血清中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平增加（圖3），而陳年武夷巖茶干預顯著改善了這一現象。

據研究，人類腸道中的微生物數量大約為1014個，是人體內細胞數量的10 倍左右，包括共生菌、益生菌和病原菌，它們發揮著營養吸收、宿主防御和免疫發育等功能[35-36]。腸道菌群的平衡可以被生物體內的侵入性抗原、免疫系統的激活和炎癥因子的產生破壞[37]。在門水平上，陳年武夷巖茶干預逆轉了DSS誘導的Proteobacteria、Verrucomicrobia相對豐度的變化（圖5A）。大多數Proteobacteria被認為是有害細菌，在結腸炎患者體內富集[38]。到目前為止，Akkermansia是已知存在于人類腸道中唯一的Verrucommicrobia細菌屬，約占人體主要微生物群落總數的3%～5%[39-40]。雖然Akkermansia的發現只有短短十多年，但它已成為學術界的“明星菌”，在IBD、癌癥、糖尿病等多種疾病的發展中扮演著重要角色[41]。在本研究中，陳年武夷巖茶干預逆轉了DSS誘導的結腸炎小鼠中Akkermansia相對豐度的降低（圖5C），因此，Akkermansia可能是陳年武夷巖茶緩解DSS誘導小鼠結腸炎的關鍵。

結腸屬于大腸，其主要功能是吸收水分、貯存和輔助排便[42]。有文獻報道當結腸過短時，易引起腸道功能紊亂、菌群失調及免疫失調，影響腸道正常吸收以及產生炎癥因子，從而引發腹瀉、腹脹及產生炎癥反應[43]。據統計，經手術切除部分結腸的患者中約有25%～50%的人群會出現不同程度的腹瀉。因此，結腸長度與腹瀉、炎癥因子過表達和腸道菌群失調密切相關[44]。本實驗利用了斯皮爾曼相關性分析進一步研究了特定細菌群相對豐度與結腸長度之間的相關性，研究表明結腸長度與Proteobacteria（r＝－0.535 6；P＝0.002 3）、Enterobacteriaceae（r＝－0.530 8；P＝0.002 5）和Escherichia（r＝－0.566 5；P＝0.001 1）的相對豐度呈顯著負相關。Escherichia是變形菌門（Proteobacteria）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）中的典型菌屬，它能夠通過產生脂多糖從而在炎癥的發生、發展中起重要作用[45]。在科、屬水平上，DSS誘導的結腸炎小鼠中的Enterobacteriaceae、Escherichia的相對豐度較Control組明顯增加，而陳年武夷巖茶干預組小鼠中的相對豐度明顯低于Control組（圖5B、C）。因此，陳年武夷巖茶對DSS誘導結腸炎的緩解作用可能是通過降低Escherichia的相對豐度來實現的。

綜上所述，陳年武夷巖茶均具有緩解DSS誘導小鼠結腸炎的作用，其中陳年武夷巖茶（2011年）干預效果優于陳年武夷巖茶（2001年），這可能是因為EGCG等兒茶素適當氧化產生了消炎抗氧化性更好的TRs。此外，陳年武夷巖茶能夠通過調節腸道中Escherichia和Akkermansia等微生物的相對豐度，維護腸道穩態，對DSS誘導的結腸炎小鼠的體質量減輕、腹瀉、結腸長度縮短、黏膜損壞及隱窩損壞、炎性細胞浸潤和血清炎癥因子過表達等狀況起到緩解作用。