冷激預處理減輕鮮切火龍果褐變的作用及機理

李冰茹，李美琪，李皎琪，王濟瀚，李曉安，李富軍，張新華

（山東理工大學農業工程與食品科學學院，山東 淄博 255049）

火龍果（Hylocereus undatus）因其外觀奇特、口感清甜、富含膳食纖維、酚類物質和甜菜苷等營養物質，且具有抗氧化、抗糖尿病、預防心腦血管疾病或癌癥等功效而廣受歡迎[1-2]。前期研究發現，切割處理可誘導鮮切火龍果中酚類物質的積累，提高其在一定貯藏期內的抗氧化能力，而鮮切處理可激活果蔬自身的防御反應，通過調節其應答機制生成酚類物質等次生代謝產物，防御和修復機械傷害[3-4]。但由于果蔬鮮切處理會引發汁液流出、呼吸增強、組織褐變、微生物生長等現象，加速品質下降。因此，開發減輕鮮切產品品質劣變的方法是一個迫切需要解決的問題。目前，鮮切果蔬的保鮮主要有化學法（保鮮劑、可食性涂膜、植物內源活性物質等）、物理法（低溫、氣調、熱處理、非熱殺菌等）及生物法（拮抗菌）等[5-6]。

冷激是指將果蔬置于不會造成冷害的低溫條件下進行短時間處理的一種物理方法，常用的有空氣冷激和冰水混合物冷激[7]。有研究表明，冷激處理可以減緩黃瓜的黃變，降低黃瓜腐爛率[8]、保持甜櫻桃的花青素含量[9]、抑制西葫蘆葉綠素含量降低和紅度（a*值）、黃度（b*值）的升高[10]。冷激處理可通過降低膜脂過氧化程度和細胞膜通透性、提高抗氧化能力提高木瓜[11]、桃[12]和茄子[13]果實的抗冷性，減輕果實在低溫貯藏期間的品質劣變。劉洪竹等[14]使用0 ℃冰水處理鮮切甘藍、洋蔥和胡蘿卜以增加它們的抗氧化酶活性，保持鮮切果蔬的品質。唐文等[15]發現用－18 ℃冷空氣處理鮮切青椒可保持其品質和抗壞血酸含量，延長鮮切青椒的貯藏期。本實驗主要從研究冷激預處理對鮮切果蔬品質影響的機理入手，旨在為鮮切火龍果的品質保持提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試白肉火龍果‘莞華白’（Hylocereus undatuscv.Guanhuabai）購自山東博發農副產品綜合批發市場，選擇大小和顏色均勻、無機械傷的果實備用。

福林-酚 上海源葉生物科技有限公司；甲醇煙臺市遠東精細化工有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀 天津市雙船化學試劑廠；1,1-二苯基苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、抗壞血酸上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Tris 生工生物工程（上海）股份有限公司；反轉錄試劑盒RR036A PrimeScriptTMRT Master Mix、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒RR420B TB Green?Premix ExTaqTM日本Takara公司。

1.2 儀器與設備

CR400色差儀 日本柯尼卡-美能達公司；DDS-307A電導率儀 上海光學儀器廠；Sorvall ST 16R高速冷凍離心機 美國賽默飛世爾科技有限公司；UV-2102PCS紫外分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；1260高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；FQD-96A實時熒光定量PCR檢測系統 杭州博日科技有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將挑選好的白肉火龍果隨機分為兩組，每組9 0 個果實，分別在相對濕度9 0%的恒溫箱中使用（－2.0±0.5）℃冷空氣（冷激組）、（20.0±0.5）℃空氣（對照組）處理3 h后，將兩組果實置于20 ℃條件下貯存3 h，再用質量分數0.02%次氯酸鈉溶液浸泡2 min，無菌水沖洗后晾干表面水分。根據Li Xiao’an等[4]的方法去除果皮，將其切成厚度為1 cm的1/4片狀，分別放置于無菌聚丙烯保鮮盒（16 cm×11 cm×5 cm）內，每盒10 片，質量約200 g，于（20±1）℃、相對濕度85%～90%條件下貯藏，并分別于0、6、12、24、36、48 h取樣測定，每次取樣6 盒，其中3 盒用于拍照、測定果肉顏色，其余樣品液氮速凍后于－80 ℃保存用于其他指標測定。每組處理取3 次數據的平均值。

1.3.2 果肉顏色測定

鮮切火龍果的果肉顏色使用色差儀進行測定，記錄亮度（L*）、紅綠度（a*）、黃藍度（b*）值，參照Coklar等[16]的方法，按式（1）、（2）計算褐變指數（browning index，BI）。

1.3.3 電導率及丙二醛含量測定

電導率（electrical conductivity，EC）的測定參照Luo Zisheng等[17]的方法。使用打孔器從火龍果切片上獲取圓片（厚度1 mm、直徑10 mm）10 片，置于25 mL蒸餾水中浸泡60 min，使用電導率儀測定初始EC并記為C1/（S/cm），沸水浴5 min并冷卻至室溫后，再次測定EC并記為C2/（S/cm）。相對電導率結果表示為C1/C2×100%。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定參照Min Dedong等[18]的方法。稱取2 g凍樣用5 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液研磨后離心。取相同體積的上清液與0.6 g/100 mL硫代巴比妥酸溶液混勻，沸水浴15 min后立即置于冰上冷卻。用紫外分光光度計測定反應體系在600、532 nm和450 nm波長處吸光度。MDA含量單位為mmol/kg。

1.3.4 總酚及總黃酮含量的測定

稱取2 g凍樣充分研磨后用5 mL甲醇在4 ℃下避光抽提24 h，離心后取上清液用于測定總酚和總黃酮含量。總酚含量的測定參照Swain等[19]的方法，記錄765 nm波長處吸光度的變化，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，根據標準曲線方程計算總酚含量，單位為g/kg。總黃酮含量的測定參照Chang等[20]的方法，測定430 nm波長處吸光度的變化，以蘆丁為標準品繪制標準曲線，根據標準曲線方程計算總黃酮含量，單位為g/kg。

1.3.5 抗氧化能力的測定

通過DPPH自由基和羥自由基（·OH）清除能力反映抗氧化能力。DPPH自由基清除能力的測定參照Brand-Williams等[21]的方法，樣品的提取方法與總酚相同。上清液（0.15 mL）與120 μmol/L DPPH溶液（1.85 mL）混勻后于25 ℃避光反應15 min，以甲醇代替上清液的反應體系作為對照，記錄515 nm波長處吸光度的變化，按式（3）計算DPPH自由基清除能力。

式中：A1為0.15 mL上清液與1.85 mL DPPH反應后吸光度；A2為0.15 mL上清液與1.85 mL甲醇反應后吸光度；A3為0.15 mL甲醇與1.85 mL DPPH溶液反應后吸光度。

·OH清除能力的測定參照Richmond等[22]的方法，稱取2 g凍樣加入5 mL體積分數70%乙醇溶液研磨，離心后取1.0 mL上清液與2.0 mL 18 mmol/L硫酸亞鐵溶液、0.2 mL 0.3% H2O2、1.3 mL 18 mmol/L水楊酸溶液混合均勻后，于37 ℃反應25 min，測定510 nm波長處吸光度的變化，以70%乙醇溶液代替上清液的反應體系作為對照。按式（4）計算·OH清除能力。

式中：A1為對照組吸光度；A2為實驗組吸光度。

1.3.6 主要酚類化合物含量的測定

參照Surjadinata等[23]的方法。稱取5 g凍樣，使用20 mL甲醇研磨，離心后取上清液利用旋轉蒸發儀在35 ℃條件下濃縮至5 mL，利用活化的Waters C18Sep-pak萃取小柱將濃縮后的上清液進行固相萃取。萃取純化后的樣品經過0.45 μm濾膜過濾后使用高效液相色譜儀進行分析。色譜柱為反向C18柱（6 mm×150 mm），柱溫38 ℃；流動相A為鹽酸（pH 2.3），流動相B為乙腈；梯度洗脫程序：0 min 10% B，25 min 15% B，40 min 20% B，45 min 25% B，50 min 85% B，55 min 10% B；流速0.6 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長280 nm。根據各標準品的保留時間和標準曲線方程進行定性和定量分析，酚類化合物含量單位為mg/kg。

1.3.7 苯丙烷代謝關鍵酶活力測定及基因表達水平分析

參考Li Xiao’an等[24]的方法測定苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate coenzyme A ligase，4CL）活力。稱取2 g凍樣分別用5 mL不同緩沖液進行研磨提取。PAL活力測定所用提取液為含2 mmol/L乙二胺四乙酸、5 mmol/Lβ-巰基乙醇、40 g/L聚乙烯吡咯烷酮的硼酸緩沖液（0.1 mol/L、pH 8.7）。C4H所用提取液為含15 mmol/Lβ-巰基乙醇、5 mmol/L抗壞血酸、4 mmol/L MgCl2、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、10 μmol/L亮異酶肽的Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L、pH 8.9）。4CL所用提取液為含5 mmol/L MgCl2、5 mmol/L ATP、0.6 mmol/Lp-香豆酸、0.4 mmol/L輔酶A的Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L、pH 8.0）。可溶性蛋白質含量的測定參照Bradford等[25]的方法，以牛血清白蛋白為標準品，根據標準曲線方程計算結果。PAL、C4H、4CL活力均以蛋白質量計，單位為U/mg。

根據前期研究[26]，選取火龍果中傷脅迫反應較強的3 個苯丙烷代謝關鍵基因HuPAL（HU06G02082.1）、HuC4H（HU02G01415.1）、Hu4CL（HU04G01601.1）進行qPCR分析。根據火龍果基因組數據庫（http://www.pitayagenomic.com./）中的基因序列設計引物（表1）。參考Chang Shujun等[27]的方法提取鮮切火龍果總RNA，使用反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix合成cDNA。使用qPCR試劑盒TB Green?Premix ExTaqTM并按照其說明書操作，利用qPCR儀進行檢測，以HuUBQ（HU04G01722.1）為內參基因，按照2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR analysis

1.3.8 超氧陰離子自由基產生速率及H2O2含量的測定

稱取2 g凍樣加入5 mL 0.1 mol/L pH 7.8磷酸緩沖液研磨，離心后取上清液，參照Elstner等[28]的方法測定超氧陰離子自由基產生速率，記錄530 nm波長處吸光度的變化，以亞硝酸鉀為標準品，根據標準曲線方程計算·產生速率，單位為μmol/（kg·s）。

稱取凍樣2 g加入5 mL冷丙酮研磨，離心后取上清液，參照Patterson等[29]的方法測定H2O2含量。單位為mmol/kg。

1.3.9 抗氧化酶活力的測定

稱取2 g凍樣加入5 mL 50 mmol/L pH 7.0磷酸緩沖液研磨，離心后取上清液，參照Zeng Kaifang等[30]的方法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力。SOD以抑制50%的氮藍四唑光還原反應時所需的酶量作為一個酶活力單位。CAT以每分鐘還原1 μmol H2O2所需的酶量作為一個酶活力單位。APX以每分鐘氧化1 μmol抗壞血酸所需的酶量作為一個酶活力單位。結果均以蛋白質量計，單位為U/mg。

1.4 數據處理與分析

實驗采用完全隨機設計，每個處理重復3 次，結果表示為平均值±標準差。使用SPSS 19.0軟件采用鄧肯多重檢驗的單因素方差分析檢驗結果的差異顯著性，P＜0.05時認為有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 冷激預處理對鮮切火龍果表面顏色、褐變程度、電導率及丙二醛含量的影響

圖1A為鮮切火龍果在20 ℃貯藏48 h期間表面顏色外觀圖像，對照組鮮切火龍果的褐變程度隨著貯藏時間的延長而增加，冷激預處理顯著抑制了褐變程度的增加，貯藏48 h時這種抑制效果更為顯著。如圖1B所示，對照組和冷激預處理組的鮮切火龍果BI均逐漸上升，冷激預處理組BI在貯藏過程中均顯著低于對照組，說明冷激預處理能夠有效抑制鮮切火龍果的褐變。EC與果蔬細胞膜通透性的變化密切相關，反映了細胞膜損傷的程度。MDA是膜脂過氧化作用的主要產物之一，其含量反映了細胞膜脂過氧化的程度。由圖1C、D可知，對照組鮮切火龍果的相對電導率和MDA含量在貯藏期間均呈現逐漸增長趨勢，冷激預處理顯著抑制了傷脅迫誘導的相對電導率和MDA含量的增加。貯藏48 h后，冷激預處理組鮮切火龍果的相對電導率比對照組低16.45%，MDA含量比對照組低20.11%。表明冷激預處理能夠抑制細胞膜脂過氧化作用，減輕鮮切火龍果細胞膜的損傷程度。

圖1 冷激預處理對鮮切火龍果20 ℃貯藏48 h期間表面顏色（A）、BI（B）、EC（C）、MDA含量（D）的影響Fig.1 Effect of cold shock pretreatment on surface color (A),BI (B),EC (C) and MDA content (D) of fresh-cut pitaya fruit stored at 20 ℃ for up to 48 h

2.2 冷激預處理對鮮切火龍果總酚、總黃酮含量及抗氧化能力的影響

酚類物質作為果蔬中重要的次生代謝產物，在防御和修復機械傷害、清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）、增強抗氧化能力方面發揮重要作用，酚類物質的合成是果蔬傷脅迫應答反應的普遍現象[4]。如圖2A、B所示，鮮切火龍果中總酚和總黃酮含量均呈先上升后下降的趨勢，冷激預處理顯著提高了總酚和總黃酮含量。貯藏48 h時冷激預處理組的總酚含量比對照組高9.04%，總黃酮含量比對照組高10.02%。DPPH自由基清除能力和·OH清除能力是表征果蔬抗氧化能力的重要指標。如圖2C、D所示，對照組鮮切火龍果DPPH自由基和·OH清除能力先隨貯藏時間的延長而逐漸升高，在24 h達到峰值后緩慢下降。冷激預處理顯著提高了DPPH自由基和·OH清除能力，在48 h時冷激預處理組的DPPH自由基清除能力比對照組高11.05%，·OH清除能力比對照組高14.48%。綜上，冷激預處理有效促進了鮮切火龍果酚類物質的積累，增強了鮮切火龍果的抗氧化能力。

圖2 冷激預處理對鮮切火龍果20℃貯藏48 h期間總酚含量（A）、總黃酮含量（B）、DPPH自由基清除能力（C）、·OH清除能力（D）的影響Fig.2 Effect of cold shock pretreatment on the contents of total phenolics(A) and total flavonoids (B),and DPPH (C) and hydroxyl (D) radical scavenging capacity in fresh-cut pitaya fruit stored at 20℃ for up to 48 h

2.3 冷激預處理對鮮切火龍果主要酚類化合物的影響

酚類物質是含有苯酚基本結構的一類化合物，含有多個酚羥基，其中酚酸類、黃酮類及花色苷類等是果蔬中常見的酚類物質，與果蔬的營養價值、抗氧化活性等密切相關。如圖3所示，鮮切火龍果中共檢測到4 種酚酸（沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、綠原酸）和4 種黃酮類化合物（根皮苷、蘆丁、山柰酚、表兒茶素）。火龍果中主要酚類物質種類和含量會因品種、生長環境等的不同而存在差異，本研究中測得的主要酚類化合物種類與前人的研究結果[31-32]類似，而含量略有不同。對照組中原兒茶酸、咖啡酸含量在貯藏前期逐漸上升，在不同貯藏時間達到最大值后呈下降趨勢，沒食子酸、綠原酸含量隨貯藏時間的延長呈波動增長的趨勢。冷激預處理促進了沒食子酸、原兒茶酸和咖啡酸含量的積累，提高了其在貯藏期間的水平，延緩了綠原酸含量的增加。對照組中根皮苷和山柰酚含量整體呈上升趨勢，蘆丁和表兒茶素含量隨貯藏時間的延長先增加后下降。冷激預處理促進了根皮苷、山柰酚、蘆丁含量在貯藏期間的積累，延緩了表兒茶素含量的增加。

圖3 冷激預處理對鮮切火龍果20℃貯藏48 h期間主要酚類化合物含量的影響Fig.3 Effect of cold shock pretreatment on phenolic compound contents in fresh-cut pitaya fruit stored at 20℃ for up to 48 h

2.4 冷激預處理對鮮切火龍果苯丙烷代謝關鍵酶活性及其基因相對表達量的影響

苯丙烷代謝途徑是酚類物質合成的重要途徑，PAL、C4H、4CL作為苯丙烷代謝途徑的關鍵酶直接參與酚類物質的合成，在果蔬逆境脅迫防御反應中發揮重要作用。在L-苯丙氨酸進入苯丙烷代謝后，經PAL催化轉化為反式肉桂酸，C4H催化反式肉桂酸對位點發生位置特異性的羥基化反應，生成p-香豆酸，4CL將p-香豆酸轉化為p-香豆酰輔酶A，進而轉化為其他下游酚類物質[33]。如圖4A～C所示，隨貯藏時間的延長，各組鮮切火龍果中的PAL、C4H、4CL活力均先上升后下降。冷激預處理顯著提高了這3 種酶活力，48 h時冷激預處理組的PAL、C4H、4CL活力分別比對照組高9.16%、12.34%和10.63%。基因表達結果顯示，兩組鮮切火龍果HuPAL表達量均被傷脅迫顯著誘導，并于6 h時達到峰值，之后隨著貯藏時間的延長逐漸降低。冷激預處理進一步提高了HuPAL的表達量，并在整個貯藏過程中保持較高水平（圖4D）。兩組鮮切火龍果HuC4H表達量均隨貯藏時間的延長呈先增加后下降的趨勢，對照組HuC4H表達量在12 h時達到最大值，冷激組HuC4H表達量在36 h時達到最大值，且冷激預處理顯著促進了HuC4H表達量的上升并抑制其下降，極大提高了HuC4H的表達水平（圖4E）。兩組鮮切火龍果的Hu4CL表達量在貯藏期間也呈先上升后下降的趨勢，對照組在24 h時達到峰值，冷激組在36 h時達到峰值，與對照組相比，冷激預處理顯著提高了鮮切火龍果前36 hHu4CL的表達量，然后其表達量迅速下降，在48 h時與對照組無顯著差異（圖4F）。綜上，冷激預處理可以誘導提高苯丙烷代謝途徑關鍵酶的活力和關鍵基因表達，從而促進鮮切火龍果中酚類物質的合成。

圖4 冷激預處理對鮮切火龍果20℃貯藏48 h期間苯丙烷代謝途徑關鍵酶活力及其基因相對表達量的影響Fig.4 Effect of cold shock pretreatment on the activities and relative gene expression of key enzymes in the phenylpropanoid pathway in freshcut pitaya fruit stored 20℃ for up to 48 h

圖5 冷激預處理對鮮切火龍果20℃貯藏48 h期間·產生速率（A）、H2O2含量（B）的影響Fig.5 Effect of cold shock pretreatment on superoxide anion production rate (A) and H2O2 content (B) in fresh-cut pitaya fruit stored 20℃ for up to 48 h

2.5 冷激預處理對鮮切火龍果·產生速率及H2O2含量的影響

2.6 冷激預處理對鮮切火龍果抗氧化酶活力的影響

SOD、CAT、APX是果蔬體內ROS清除酶促防御系統中的重要酶，SOD能通過歧化反應將·轉化為H2O2和O2，從而清除·，H2O2可被CAT催化分解為H2O和O2，降低H2O2對果蔬造成的氧化損傷。H2O2還可通過APX的催化被抗壞血酸還原清除[13]。如圖6所示，鮮切處理提高了兩組鮮切火龍果SOD、CAT、APX活力，冷激預處理組3 種酶活力在貯藏期間始終高于對照組。在48 h時冷激預處理組SOD、CAT、APX活力分別比對照組高14.87%、11.85%和14.88%。這些結果表明冷激預處理能夠通過提高鮮切火龍果SOD、CAT、APX活力促進·和H2O2的清除，減輕ROS對鮮切火龍果造成的氧化損傷和組織褐變。

圖6 冷激預處理對鮮切火龍果20℃貯藏48 h期間SOD（A）、CAT（B）、APX（C）活力的影響Fig.6 Effect of cold shock pretreatment on the activities of SOD (A),CAT (B) and APX (C) in fresh-cut pitaya fruit stored 20℃ for up to 48 h

3 結論

冷激（－2 ℃冷空氣、3 h）預處理通過上調苯丙烷代謝關鍵酶PAL、C4H、4CL活力及其相關基因的表達，促進鮮切火龍果酚類物質的合成積累并抑制貯藏后期酚類物質含量的下降，增強其抗氧化能力；此外，冷激預處理可以誘導提高SOD、CAT、APX抗氧化酶活力，有效清除過多的ROS。綜上，冷激預處理通過調控苯丙烷途徑和ROS代謝，提高抗氧化能力，緩解鮮切火龍果氧化過程，從而有效抑制其果肉褐變。冷激預處理安全高效、操作簡單，在鮮切火龍果品質保持方面具有較好的應用前景。