乳酸菌作為生物活性物質體內遞送載體的研究進展

陳韞慧，夏永軍，宋 馨，艾連中，王光強

（上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093）

生物活性物質可以調節人體生命活動，維持人體健康，包括蛋白質、多肽、多酚、黃酮等多種化合物，1982年美國食品和藥品監管總局批準了重組人胰島素的使用，促進了生物活性分子在疾病治療中的應用[1]。蛋白質和多肽等生物活性分子經口服傳遞時要經受胃介質的酸性和胃腸道環境中分泌的各種降解酶等的破壞，使其功效的發揮具有極大難度[2-3]，因此，生物活性物質的遞送成為熱門研究領域。為通過口服途徑有效傳遞蛋白質和多肽等活性物質，許多策略被用于提高其口服生物利用度，如化學改性、使用pH敏感性腸溶衣包埋、添加蛋白酶抑制劑等[4]。然而，這些方法都存在局限性：由于胃腸道環境中pH值變化范圍廣、降解酶種類多樣，腸溶衣和蛋白酶抑制劑的可靠性和效率不能確定，而化學改性方法存在降低目標蛋白生物活性的可能性[5]。為克服上述問題，細菌常被用作體內遞送載體以防止活性物質在消化道運輸過程中的快速降解[6]。本文將重點討論乳酸菌作為生物活性物質體內遞送載體的研究進展。

乳酸菌在自然界中廣泛存在，常定植于植物和哺乳動物腸黏膜，在生長過程中釋放共軛亞油酸、多胺、細菌素和酚類化合物衍生物等生物活性化合物，具有調節腸道微生態平衡、促進健康的作用[7-9]。由于存在長期的安全食用歷史，乳酸菌通常被認為是一種安全的食品級載體。同時，易于獲得的參考基因組和高通量多組學分析手段提供了乳酸菌功能基因和調控元件的關鍵信息；由此開發的一系列遺傳工具使乳酸菌作為細菌載體的可操作性和兼容性極大增強[10-11]。在乳酸菌載體中，乳酸乳球菌與乳酸桿菌中的一些屬（植物乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌等）應用最為廣泛。乳酸乳球菌作為一種在胃腸道中短暫定植的模式微生物，具有成熟的質粒載體與表達系統，是生物活性物質生產的理想宿主。而乳酸桿菌在胃腸道內定植時間更長，并且可以引起強烈的局部和全身免疫反應，是一種很有潛力的黏膜遞送載體[3]。本文聚焦于蛋白質和多肽這類易被破壞的生物活性物質，首先介紹乳酸菌遞送載體中影響基因表達的重要因素，包括啟動子、復制子等，然后詳細論述生物活性物質不同的表達形式，最后介紹乳酸菌遞送系統在各類疾病中的應用情況。

1 乳酸菌表達系統

乳酸菌表達系統中的重要元件包括：具有相關核糖體結合位點的啟動子、用于篩選陽性重組菌株的選擇性標記以及用于維持乳酸菌宿主系統中重組質粒的復制子。這些元件的功能與效率將直接影響乳酸菌載體的穩定性和承載能力。

1.1 啟動子

啟動子控制基因表達起始時間和表達程度，是表達載體的關鍵元件，可以分為組成型啟動子和誘導型啟動子兩種。P23、P32、P44等都是乳酸菌中常見的組成型啟動子[12]。組成型啟動子的調控不受外界條件影響且基因的表達具有持續性，因此當需要在體內進行原位生產或需要穩態基因表達時一般使用組成型啟動子[13]。Hazebrouck等[14]將牛β-乳球蛋白基因插入到干酪乳桿菌染色體中內源性的組成型啟動子下游并成功表達，在第1天與第6天灌胃重組菌株后連續收集小鼠的新鮮糞便并進行分析，結果顯示該重組菌株可有效定植腸道，且在小鼠體內β-乳球蛋白可持續分泌10 周以上，有效治療了小鼠的過敏癥狀。

誘導型啟動子可識別特定轉錄因子激活基因表達，在短時間內達到生物活性分子的高水平表達[15]。Peirotén等[16]介紹了乳酸菌中用于基因表達的誘導型啟動子，常見的有細菌素誘導型啟動子、應激誘導型啟動子、碳水化合物誘導型啟動子以及鋅誘導型啟動子等。其中，基于雙組分系統開發的細菌素誘導型啟動子通過添加相應的肽信息素誘導基因表達，應激誘導型啟動子通過pH值、溫度、膽汁鹽或NaCl等環境脅迫條件誘導基因表達，而碳水化合物誘導型啟動子通常來源于碳水化合物相關代謝途徑的操縱子，比如乳糖誘導型啟動子。盡管使用誘導型啟動子控制生產的生物活性物質可以在體內發揮作用，但在使用這些重組菌株之前需事先添加誘導劑以誘導蛋白質的生產，不能實時控制菌株中基因的表達。因此，應激誘導型這類不需要外部添加誘導劑、可以響應體內環境信號并進行原位生產活性分子的啟動子具有極高的應用潛力。Zhao Chenming等[17]構建了通過酸誘導型啟動子P170表達草酸鹽脫羧酶的重組乳酸菌并灌胃大鼠，結果表明酸誘導啟動子P170顯著緩解了高草酸尿癥的癥狀。Chien等[18]在大腸桿菌中將環境響應型啟動子如厭氧誘導啟動子、乳酸鹽誘導型啟動子及pH誘導型啟動子與細菌生長相結合，通過邏輯門電路構建多路復用的生物防護回路。未來相似的設計可以應用于乳酸菌，通過邏輯門設計實現未來特定生理區域的精確定位，控制生物活性分子的有效表達，提高療效并避免脫靶毒性。

1.2 選擇性標記

大多數質粒依靠抗生素標記物，如紅霉素和氯霉素抗性基因，進行轉化子選擇和質粒維持。然而，抗生素基因的存在會增加抗生素耐藥性轉移到菌株外部環境的風險。出于生物防護的需要，近些年研究人員開發了多種基于非抗生素顯性選擇標記或互補選擇標記替代常規抗生素標記物的方法。非抗生素顯性選擇標記主要通過細菌素耐藥性或重金屬耐受性基因進行選擇，如乳酸鏈球菌素抗性基因以及一些耐鎘離子、銅離子的抗性基因[19]。值得注意的是，重金屬抗性標記的使用會在菌體培養階段引入有毒害作用的重金屬離子，且在胃腸道中很難找到相關環境維持質粒的穩定性，因此，這種標記并不適用于生物活性物質的體內遞送。

互補標記通常需要在宿主染色體基因中敲除特定代謝途徑中重要的或賦予其某種表型特性的關鍵基因，同時在質粒載體上攜帶相應的互補基因[20]。因此，這種標記只能在對特定菌株進行基因組編輯之后才能使用。特別的是，糖類互補標記不需要對基因組進行編輯，而是通過將乳酸菌自身不能發酵的糖作為單一碳源并表達其互補基因以維持菌株的生長和質粒的穩定性[21]。在各類互補標記中，丙氨酸消旋酶使用最為廣泛，該基因可以催化L-丙氨酸與D-丙氨酸的相互轉化，而D-丙氨酸是細菌肽聚糖合成和脂質酸代謝中的關鍵底物[22]。II型豬圓環病毒的衣殼蛋白[23]、殼聚糖酶[24]、治療蛋白P8[25]以及草酸鹽脫羧酶[22]等重組蛋白都已在含丙氨酸消旋酶互補標記的乳酸菌中成功表達。除此之外，Yin Sheng等[26]將植物乳桿菌的膽鹽水解酶作為互補標記，將脫氧膽酸鈉作為選擇脅迫來源添加到培養基中以篩選轉化子，結果顯示重組菌株在生長50 代后質粒丟失率僅為0.1%。由于胃腸道環境中存在多種膽鹽，該互補標記可以作為乳酸菌遞送載體構建中的一種選擇，但需要考慮膽鹽水解酶的過量表達是否存在潛在的健康威脅。

1.3 復制機制

獨立的復制系統是在生產過程中維持基于質粒編碼蛋白表達系統的基本要求之一。乳酸菌中存在兩種常見的質粒復制機制，分別為滾動循環復制（rollingcircle replication，RCR）和θ復制。RCR需要復制起始蛋白（replication initiation protein，Rep）、雙鏈起源（double-strand origin，DSO）和單鏈起源（single-strand origin，SSO）這3 種遺傳元件，而θ復制需要Rep、復制起源和宿主編碼的聚合酶[27]。RCR型質粒通常體積較小并具有多個拷貝，其復制通過質粒編碼的Rep與DSO的特異性結合而啟動并產生單鏈DNA復制中間體，然后啟動SSO滯后鏈合成，轉化為雙鏈DNA[28]。θ復制型質粒的復制子種類多樣，質粒的DNA合成可以是單向或雙向，并且可以從多個位點開始，與RCR質粒相比，由于其不存在中間復制體，θ復制型質粒的結構和分離穩定性都較高，適合作為大型DNA片段的載體[29]。近年來，乳酸菌載體中使用較多的幾種復制子分別是RCR型的pWV01、pSH71以及θ復制型的pCI305、pMB1和pAMβ1[27]。例如，基于高拷貝數pSH71重復子開發的pNZ系列載體和誘導表達型的pSIP系列載體已廣泛用于乳酸菌中[30]。目前，對于乳酸菌質粒復制子和穿梭載體的開發仍在進行中。Eom等[31]對明串珠菌CB2567的θ復制型質粒pCB42進行表征并構建大腸桿菌和乳酸菌的穿梭載體，在植物乳桿菌中成功表達報告蛋白β-半乳糖苷酶，可以作為乳酸菌蛋白表達和遞送的工具。

2 生物活性物質的表達形式

生物活性物質在乳酸菌中的表達形式主要有3 種：在細胞質中表達、分泌表達以及通過表面展示技術錨定在乳酸菌的細胞膜或者細胞壁上。不同的表達形式會影響功能蛋白或肽段的作用效果，但目前哪種表達形式效果最佳仍沒有定論，需要在具體的研究中綜合考慮。

2.1 胞內表達

在傳統的細胞內表達策略中，重組蛋白在細胞質中積累并需要通過外部機械作用或化學方法將其釋放，這些程序可能導致蛋白質失活并使下游純化過程復雜化。一些研究表明，乳酸菌遞送載體在腸道中經各類消化酶、抗菌肽、噬菌體處理或與其他細菌競爭后可被裂解并釋放細胞內生產的異源蛋白[32]。例如，羅伊氏乳桿菌VPL1014的前噬菌體在胃腸道運輸過程中被激活，促使細菌裂解并釋放胞內積累的瘦素蛋白[33]。Grangette等[34]使用具有細胞壁生物合成缺陷（丙氨酸消旋酶基因突變）的重組乳酸菌遞送胞內抗原后發現，其免疫原性較野生菌株更強，這也證明了細胞裂解遞送策略的可行性。但這種方法需要考慮胞內蛋白的生產濃度以及可溶性，并且很多異源蛋白對宿主具有毒性，無法在胞內大量積累[35]。

2.2 分泌表達

乳酸菌具有一個高效的分泌表達系統，分泌蛋白可與機體細胞相互作用并發揮治療效果。分泌表達策略需要在目標蛋白N端起始位置加入信號肽（signal peptide，SP）序列，其可以將相應的蛋白質或多肽引導至細胞質膜并分泌到外部環境。SP通常具有保守的三區結構，分別是帶正電荷的氨基末端N區、中央的疏水核心H區和包含信號肽酶識別位點的極性羧基末端結構域C區[36]。基于深度遞歸神經網絡和隱馬爾科夫模型開發的網站SignalP常用于預測SP的切割位點和跨膜螺旋[37]。由于不同SP在膜轉運過程中的輸送效率不同，其與靶蛋白組合后mRNA轉錄本的結構穩定性也不同，因此篩選靶蛋白的最佳SP序列是提高分泌效率的關鍵步驟[38-39]。

目前，來自乳酸乳球菌分泌蛋白Usp45的SP是乳酸菌中利用最廣泛的SP之一，其他較為常見的還有來自化膿性鏈球菌M6蛋白和短乳桿菌S層蛋白的SP[40]。研究發現天然SP與異源SP相似或具有更高的分泌效率[41]。Mathiesen等[42]基于植物乳桿菌的全基因組序列測試了76 種假定的內源SP功能特性，發現82%的SP具有分泌信號的作用。Chen等[43]選擇來自植物乳桿菌的155 種預測SP和來自乳酸片球菌的110 種預測SP，通過雙重復子策略和DNA組裝技術構建穿梭載體并建立高通量細胞文庫，成功鑒定了12 種植物乳桿菌SP和8 種乳酸片球菌SP。這些SP豐富了構建乳酸菌分泌表達載體的工具箱。表1中所示為來源于不同宿主的SP在分泌異源蛋白質中的應用情況。

表1 使用不同來源的SP分泌表達功能蛋白Table 1 Secretory expression of functional proteins using signal peptides from different sources

2.3 表面展示

活性分子分泌后完全暴露于體內惡劣的胃腸道環境與各種蛋白水解酶中，而乳酸菌的單細胞膜和相對較厚的細胞壁為靶蛋白錨定在細胞表面從而降低暴露程度提供了機會。許多研究均表明乳酸菌的表面展示技術可以提高異源蛋白質的產量和作用效果，特別是在遞送抗原時能夠更好地誘導特定的系統性免疫反應和黏膜毒性細胞免疫反應[51]。當靶蛋白從細胞內易位到胞外后可以通過多種方式錨定在細胞表面，如可以使用脂蛋白錨或使用分選酶通過LPXTG基序共價結合到細胞表面，也可以通過結合結構域進行非共價連接[52]。使用不同的錨定元件會使靶蛋白的亞細胞定位發生變化。由于嵌入細胞表面的程度可能會影響蛋白的作用效果，研究人員需要根據靶蛋白預期暴露程度選擇不同的錨定元件[53-54]。

脂蛋白錨的N端SP末尾存在脂質盒基序，脂蛋白易位后SP被脂盒特異性信號肽酶SPase II切割，脂蛋白將共價結合到細胞膜的磷脂雙分子層[52]。Zadravec等[55]評價了來自乳酸乳球菌的堿性膜蛋白A（basic membrane protein A，BmpA）作為脂蛋白錨的能力。作為顯示IgG結構域的錨點，BmpA蛋白在其C末端被截斷并由小到大產生了9 個變體，其在截斷44 個殘基后信號最強，隨著蛋白分子的逐步縮短，表面展示能力逐步降低，這表明融合蛋白中脂蛋白錨本身的長度在易位和結合過程中十分重要。LPXTG基序的蛋白含有C端細胞壁分選信號，其序列為亮氨酸（L）、脯氨酸（P）、X（任何氨基酸）、蘇氨酸（T）和甘氨酸（G），當N端SP通過分泌途徑轉運到細胞外時，其帶電尾部的疏水區域仍固定在細胞膜上，分選酶在甘氨酸和蘇氨酸殘基之間切割使蛋白解離并共價結合至細胞壁[56-57]。已有研究對比了脂蛋白錨和LPXTG錨對靶蛋白的作用效果。Kuczkowska等[58]利用來自植物乳桿菌的脂蛋白錨Lp_1261和LPXTG錨Lp_2578成功展示了結核分枝桿菌的AgE6抗原，并證明了其在黏膜免疫疫苗中的應用潛力；此外，Kuczkowska等通過比較兩種錨點的亞細胞定位與免疫原性的關系，發現使用脂蛋白錨的融合蛋白嵌入了細胞壁內部，并在鼻內和口服黏膜遞送中均引起更強的特異性免疫應答，而使用LPXTG錨點后熒光顯示在細胞壁表面[58]。

非共價錨定策略不僅可以選擇乳酸菌作為重組蛋白表達的宿主，含有非共價錨定結構域的融合蛋白還可以在大腸桿菌等表達菌株中生產并純化，然后反式錨定到野生型乳酸菌菌株中，其過程如圖1所示[59]。非共價的表面顯示系統需要為靶蛋白選擇合適的細胞壁錨定基序。Pfam數據庫中已描述了幾種可以與細菌肽聚糖結合的細胞壁結構域。這些結構域的長度在20～200 個氨基酸殘基之間，可含有多個重復序列，并且可以位于融合蛋白的中心、N端或C端[60]。LysM賴氨酸基序的氨基酸殘基數為42～65，多以重復序列的方式出現，可特異性非共價結合到肽聚糖的N-乙酰葡萄糖殘基上，是最為常見的一種細胞壁結合域[61]。來自發酵乳桿菌溫帶噬菌體φPYB5的內溶素Lyb5蛋白C末端的3 個假定LysM重復基序與靶蛋白融合后可與嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、乳酸乳球菌等多種乳酸菌表面結合，具有作為新型錨點的潛力[62]。另外，SH3結構域多發現于厚壁菌門的細菌中，有多個亞型且不同亞型的結構域與細胞壁結合的靶點有所不同，如SH3_5可結合肽聚糖的五聚糖肽橋，而SH3_6與肽聚糖的交聯莖肽發生相互作用[63]。其他推定的結構域如ChW結構域、WXL結構域、CPL-7結合域等在乳酸菌表面展示中的報道較少。Plavec等[64]篩選了來自乳酸菌與其噬菌體的LysM、CW_1、Cpl-7、WxL、SH3和ChW等15 個結構域的結合效率，其中ChW結合域顯示出良好的錨定適用性。更多潛在的細胞壁結構域還有待研究者開發。

圖1 常見乳酸菌表面工程（A）與反式乳酸菌表面工程（B）的區別Fig.1 Difference between common lactic acid bacterial surface engineering (A) and trans lactic acid bacteria surface engineering (B)

3 乳酸菌呈遞系統在各類疾病中的應用

3.1 黏膜感染

由于黏膜表面不斷暴露于病原體和抗原，許多感染因子或抗原可以通過黏膜穿透身體并感染呼吸道和胃腸道，從而導致高發病率和疾病風險[65]。口服或鼻內接種基于乳酸菌的疫苗是控制黏膜感染的一種有前途的方法，乳酸菌可以在免疫原性和反應原性之間取得理想的平衡，通過在血液和黏膜部位誘導強烈的體液和細胞免疫反應以有效地實現免疫激活[66]。乳酸菌的黏膜疫苗可以避免抗原降解并促進其在胃腸道的攝取，刺激適應性免疫反應，而口服抗原在許多研究中只能觀察到耐受性免疫反應[67]。但這些重組乳酸菌疫苗的有益效果根據產生的抗原、使用的載體菌株和所針對的不同傳染病而存在較大差異。表2羅列了近年來基于乳酸菌載體開發的針對不同病原體的黏膜免疫疫苗。

表2 乳酸菌黏膜免疫疫苗Table 2 Mucosal immunization vaccines based on lactic acid bacteria

隨著乳酸菌疫苗平臺的持續開發，增強疫苗的保護性免疫原性已成為一個關鍵挑戰。黏膜免疫誘導位點組成黏膜相關淋巴網狀組織網絡并向黏膜效應器部位提供連續的記憶B細胞和T細胞，需要各種策略提高乳酸菌載體將抗原遞送到免疫誘導位點的效率[78]。樹突狀細胞是研究最為廣泛的抗原遞送靶標，其在細胞表面和內部具有專門的模式識別受體，在捕獲、處理和呈遞抗原方面起核心作用[79]。樹突狀細胞能夠與B細胞和T細胞相互作用，調節先天性和適應性免疫反應，介導B細胞的IgA類切換，sIgA、Th1和細胞毒性淋巴細胞誘導增加并誘導整合素α4β7的分泌[80]。乳酸菌疫苗的靶向性主要通過特異性樹突狀細胞結合肽與抗原的融合表達實現，而樹突狀細胞結合肽的篩選則是通過噬菌體表面顯示技術在體外進行[81]。多項研究證明乳酸菌疫苗中樹突狀細胞結合肽的存在可以增加體內sIgA和血清IgG并引起潛在的免疫增強作用，但其效率會受到樹突狀細胞肽自身靶向性、抗原刺激水平及乳酸菌呈遞抗原的方式影響[82-83]。微折疊細胞（M細胞）是黏膜相關淋巴組織特化的上皮細胞，它們缺乏黏液分泌，具有稀疏的糖萼、高內吞活性且其基底外側區室與局部單核吞噬細胞和淋巴細胞相鄰[84]。腸道相關淋巴組織是M細胞富集區域，可采樣和攝取抗原并將其輸送到潛在的免疫系統，因而也成為靶標的主要區域[85]。與上述方法相似的策略是開發基于M細胞的靶向配體，如具有環狀構象的靶向肽CKS9，其不僅能夠與抗原融合表達，也可與細胞因子如IL-6融合表達充當免疫佐劑以增強黏膜免疫反應[32,86]。Zhang Fudong等[87]將M細胞靶向配體Co1耦合到口蹄疫病毒的多抗原表位TB1上構建重組乳酸乳球菌疫苗，可調節特異性T淋巴細胞增殖反應，而TB1-Co1的組合相比TB1可誘導更強的黏膜和體液免疫反應，其中體液免疫占主導地位。呼腸孤病毒蛋白σ1與M細胞表面糖蛋白2的特異性分子FIMH蛋白等配體在其他細菌載體中也有涉及[88]，后續可研究其在乳酸菌疫苗中的應用。

3.2 炎癥性腸病

由于乳酸菌已被證明能夠調控腸道的微生態平衡，開發表達治療分子的重組乳酸菌并遞送到腸道已成為作為針對炎癥性腸病的替代療法[89]。炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）主要包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎，克羅恩病會引起透壁炎癥，且伴隨有膿腫、瘺管等并發癥，而潰瘍性結腸炎的特征是結腸的黏膜炎癥[90]。潰瘍性結腸炎和克羅恩病共同的炎癥和組織損傷癥狀使抗炎細胞因子如IL-10、IL-27和IL-35等成為目標治療蛋白，其中最早投入研究的是IL-10[91-92]。事實上，分泌IL-10的重組乳酸菌已用于開展治療克羅恩病的臨床試驗，但由于分泌于胃腸道內的IL-10濃度較低，臨床試驗結果并不理想[2]。因此，一些研究將目標轉移到其他抗炎細胞因子，以期其發揮免疫抑制作用并誘導機體自身生產IL-10。Hanson等[93]使用乳酸乳球菌遞送免疫抑制細胞因子IL-27治療結腸炎，小腸結腸炎的T細胞轉移模型中IL-27二聚體減輕了結腸和小腸的病理變化并降低了結腸中促炎細胞因子基因的表達，其治療效果依賴于T細胞分泌的IL-10。在此基礎上，McLean等[94]發現分泌表達IL-27的重組乳酸乳球菌LL-IL-27在急性結腸炎中改善了黏膜潰瘍，顯著降低了促炎細胞因子蛋白表達水平并使結腸黏膜中性粒細胞浸潤減少。Wang Jianyong等[95]使用乳酸乳球菌遞送小鼠IL-35預防硫酸葡聚糖誘導的小鼠結腸炎，小鼠結腸組織病理學變化得到顯著緩解，固有層中Th17與Treg細胞比例降低，結腸組織和血清中細胞因子IL-10水平增加。此外，Aubry等[96]構建產生胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）的乳酸乳球菌菌株LL-TSLP，該物質是一種多效的細胞生長因子，LL-TSLP的治療通過在結腸炎早期階段誘導Treg增殖延緩了疾病活動指數的增加。

除表達抗炎蛋白外，其他治療策略還包括遞送中和促炎因子的抗體、干擾炎癥信號通路傳導等[97]。例如，絲氨酸蛋白酶抑制劑Elafin和分泌性白細胞蛋白酶抑制劑，在通過重組乳球菌給藥時均表現出較IL-10和轉化生長因子β兩種抗炎細胞因子更好的保護作用[98]。Plavec等[99]在乳酸乳球菌表面成功展示了IL-23受體拮抗劑REX蛋白，其可以與IL-23R-IgG嵌合體相互作用并抑制促炎級聯反應中細胞因子IL-17A的分泌，具有作為IBD治療分子的潛力。

3.3 糖尿病

1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）和2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是臨床上最常見的兩種糖尿病分型，重組乳酸菌已被認為是糖尿病現有療法的潛在替代方案。T1DM是一種內分泌疾病，通常是由于自身免疫性遭到破壞且胰腺β細胞停止產生胰島素[100]。Mao Ruifeng等[101]通過抗原特異性療法設計表達的單鏈胰島素SCI-59類似物具有在3T3-L1脂肪細胞表面結合和激活胰島素受體的能力，通過乳酸菌載體口服遞送后可以增強非肥胖糖尿病（non-obese diabetes，NOD）小鼠的葡萄糖耐量，顯著減輕胰島炎癥并恢復小鼠的胰島素分泌能力。Cook等[102]將胰島素原和IL-10在乳酸乳球菌中共表達并口服遞送，結合低劑量抗CD3治療成功恢復了NOD小鼠的葡萄糖穩態。特別的是，Lang Junchao等[103]將中性粒細胞胞外陷阱作為T1DM胰腺早期病理性損傷的靶標，使用重組乳球菌分泌葡萄球菌核酸酶靶向干預，有效調節NOD小鼠的血糖水平并延緩T1DM的發展。T2DM表現的高血糖水平癥狀主要由慢性炎癥引起的胰腺β細胞損傷后胰島素分泌不足引起[104]。同樣，目前已開發了多種針對T2DM的重組乳酸菌。例如，口服分泌胰高血糖素樣肽-1（glucagon like peptide-1，GLP-1）的重組植物乳桿菌7 周后，自發型T2DM模型猴的空腹血糖濃度可以降至正常水平[105]。Exendin-4作為一種GLP-1的受體激動劑，也被認為是T2DM的良好治療藥物[106]。Zeng Zhu等[107]開發了基于乳酸菌NICE系統的Exendin-4肽原位口服遞送系統，該遞送系統顯著增強了INS-1細胞的胰島素分泌并激活了PI3K/AKT信號通路，具有良好的應用潛力。

3.4 癌癥

癌癥是一種以異常細胞不受控制增殖為特征的疾病，這些異常細胞具有侵襲性并且能夠從原發部位擴散到機體健康組織[108]。腫瘤微環境的一個重要特征是缺氧。乳酸菌作為一種兼性厭氧細菌，具有靶向缺氧區域的能力，同時其益生特性規避了其他減毒菌株逆轉或突變的風險[109]。

使用重組乳酸菌預防或治療癌癥有許多種策略，通過免疫調節防治腫瘤最為常見。16型人乳頭瘤病毒多見于宮頸癌的早期病變組織，其抗原靶標E6、E7已由乳酸菌成功表達并于近期投入臨床試驗[110]。細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4是一種免疫檢查點分子，在T細胞上表達并抑制腫瘤微環境中的抗腫瘤免疫，其單鏈可變抗體已在乳酸乳球菌載體中表達并證明具有生物活性，有望作為一種癌癥治療方案[111]。另外一種常見策略是通過細胞毒性蛋白攻擊腫瘤細胞以產生抗腫瘤作用。P8蛋白是一種由鼠李糖乳桿菌分泌的治療性蛋白，在先前的研究中，研究人員證明P8可以特異性易位于腫瘤細胞的細胞質基質，通過p53-p21信號通路介導腫瘤細胞G2期阻滯，發揮抗增殖活性[112]。Chung等[25]使用戊糖片球菌作為載體分泌治療蛋白P8治療結直腸癌，當口服工程細菌后，小鼠的結腸癌細胞異種移植模型與化學誘導模型中的腫瘤生長均被顯著抑制。其他相關的重組蛋白，如腫瘤壞死因子相關的細胞凋亡誘導配體[113]、腫瘤轉移抑制肽Kiss-1[114]等，均已通過乳酸菌載體成功表達并在體外細胞實驗中證明具有特異性腫瘤殺傷性，還需進一步研究它們在體內實驗中的作用效果。

3.5 其他

除以上幾種常見疾病外，重組乳酸菌可以利用口服耐受機制，預防或治療多種自身免疫性疾病以及過敏癥狀。口服耐受性通常指通過口服途徑預先給予抗原，通過特異性抑制抗原的細胞和體液免疫反應以防止超敏反應[115]。研究表明，通過重組乳酸菌持續遞送熱休克蛋白65——一種可誘導T細胞的高免疫原性抗原，可以防止或減輕小鼠類風濕性關節炎、腦脊髓炎等多種自身免疫疾病的發生或發展[116-118]。在上述實驗中均觀察到IL-10水平的升高與干擾素γ的降低。Kasare??o等[119]通過重組乳酸乳球菌遞送髓鞘蛋白的腦源性抗原片段，減少了實驗性腦脊髓炎大鼠的組織病理學變化，可以作為口服耐受多發性硬化癥的一種替代策略。同樣，在過敏性疾病的治療中，經重組乳酸菌遞送的樺樹花粉、雪松花粉、塵螨、牛奶等過敏原均可抑制小鼠特異性IgE反應，有效減輕過敏癥狀[120]。

4 結語

近年來，隨著對乳酸菌益生特性機制研究的不斷深入以及遺傳工具箱的擴展，乳酸菌成為活體細菌療法的理想底盤。但相較于模式菌株乳酸乳球菌，片球菌、鏈球菌、乳桿菌等菌株的基因組與表型具有高度的多樣性，仍需要投入大量精力開發其遺傳操作工具與基因表達系統。并且，由于乳酸菌影響宿主免疫系統的機制具有菌株特異性，受宿主與微生物之間的復雜相互作用影響，不同菌株的效應分子與宿主機體的免疫反應機理仍需闡明，這將決定該宿主菌株的適用性。

乳酸菌作為活性分子的遞送載體在動物模型中顯示出高功效。然而，在這些乳酸菌載體進入臨床轉化之前需要確保其符合各種健康監管機構制定的指導方針，如抗生素耐藥基因不能出現在工程菌株中以防止基因轉移帶來的健康問題[121]。基于CRISPR的基因組編輯技術為包括乳酸菌在內的下一代細胞工廠開辟了道路。正如之前有關大腸桿菌的報道[122]一樣，未來利用乳酸菌也可構建復雜的遺傳邏輯電路，通過感知和響應環境信號提高生物治療分子的作用效果。