好食脈孢霉固體發酵玉米麩皮產阿魏酰低聚糖工藝優化

肖 凱，鄧永平,2, ，劉宇馳，劉曉蘭,2，王 燕,2，趙 雨,2

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾 161006）

阿魏酰低聚糖（Feruloylated oligosaccharides，FOs）由阿魏酸的羧基與低聚糖的羥基通過酯鍵連接構成，經腸道消化后可釋放阿魏酸和低聚糖，具有較游離阿魏酸更強的抗氧化、調節腸道菌群等多種生理活性[1-4]。2010 年美國食品藥品監督管理局批準可將麥麩中提取的FOs 添加到食品中（GRAS NOTICE 000343）。

我國玉米產量位居世界第二，2022 年達到2.77億噸，其中約25%用于深加工生產玉米淀粉、乙醇等。玉米麩皮是玉米濕法加工生產淀粉的副產物，資源豐富[5]。玉米麩皮含粗蛋白約10%、淀粉10%～20%、粗脂肪約6%、纖維10%～20%、半纖維素30%～40%，含阿魏酸約3%[6-7]。目前主要直接作為飼料原料使用，也有少量報道利用玉米麩皮的可發酵性研制發酵飼料，但是仍存在附加值較低的問題[8]。研究表明，玉米麩皮中含13%～18%的阿拉伯木聚糖以及3%左右的阿魏酸[9-10]，經過水熱預處理與酶水解結合法、離子液體預處理與酶水解結合法、微生物發酵法均可水解其糖苷鍵提取FOs[11-15]。與其他方法相比，采用安全微生物發酵玉米麩皮生產FOs，不僅產物安全性高、成本較低，還能提高膳食纖維等其他功效成分的含量。焦昆鵬等利用平菇發酵玉米麩皮生產FOs，培養8 d 后發酵液中FOs 含量為12.515 μmol/L[15]。但是目前以玉米麩皮為原料發酵生產FOs 的研究較少，亟需開拓發酵新工藝，以提高FOs 產量，縮短發酵時間，提高玉米麩皮附加值。

好食脈孢霉（Neurospora sitophila）是“一般認為安全”（Generally recognized as safe，GRAS）真菌，該菌在農產品加工副產物（如麩皮、豆渣等）中生長速度快、代謝旺盛，代謝產物含纖維素酶、木聚糖酶等多種水解酶，對植物纖維類底物具有較強降解能力，同時其氣生菌絲體和孢子中富含類胡蘿卜素[16-18]。前期研究發現分離自北方發酵豆制品中的好食脈孢霉菌株在玉米麩皮培養基中生長周期短，FOs 含量相對較高，具有較大開發價值，本文采用單因素和響應面法對其固體發酵玉米麩皮產FOs 的條件進行了優化，以期為提高玉米麩皮生物利用率和附加值提供基礎，為微生物發酵法生產FOs 提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

好食脈孢霉（Neurospora sitophila） 分離自我國北方發酵豆制品，保藏于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號CGMCC No.1836；所用試劑均為國產分析純 天津市凱通化學試劑有限公司。

ZHJ-C2109C 型超凈工作臺 上海智城分析儀器有限公司；SPX-150BS-Ⅱ型生化培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司；冷凍離心機（CF15RX） 日立（中國）有限公司；分光光度計（TU-1901） 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養方法 斜面培養：將4 ℃保存的好食脈孢霉菌株轉接到PDA 培養基中，在28～30 ℃培養72～120 h，PDA 培養基的配制方法見參考文獻[19]。

孢子懸液制備方法：取4 ℃斜面保存的好食脈孢霉菌株，注入無菌水，用接種環輕刮使孢子散落后回到入裝有玻璃珠和無菌水的三角瓶中，150 r/min振蕩10 min，使孢子分散，用普通光學顯微鏡計數。

固體發酵：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麩皮，加水量15 mL，在121 ℃滅菌30 min，冷卻后接種好食脈孢霉孢子懸液，接種量為1×106個孢子/瓶，在28 ℃條件下培養72 h。

1.2.2 發酵工藝優化

1.2.2.1 單因素法優化發酵工藝條件 氮源種類對FOs 含量的影響：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麩皮，分別添加玉米麩皮質量2%（w/w）的豆粕、玉米胚芽粕、玉米蛋白粉和硫酸銨作為氮源，對照組以等量玉米麩皮代替氮源，培養基加水量為15 mL，接種量為1×106個孢子/瓶，在28 ℃條件下培養72 h 后測定FOs 產量。

氮源添加量對FOs 產量的影響：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麩皮，調節培養基中豆粕濃度分別為玉米麩皮質量的1%、2%、3%、4%、6%、8%和10%（w/w），加水量為15 mL，接種量為1×106個孢子/瓶，28 ℃培養72 h 后測定FOs 產量。

接種量對FOs 產量的影響：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麩皮、玉米麩皮質量2%（w/w）的豆粕，加水量為15 mL，接種量分別1×104、1×105、1×106、1×107個孢子/瓶，在28 ℃培養72 h 后測定FOs 產量。

發酵溫度對FOs 產量的影響：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麩皮、玉米麩皮質量2%（w/w）的豆粕，加水量為15 mL，接種量為1×105個孢子/瓶，分別在25、28、31、34 ℃培養72 h 后測定FOs 產量。

發酵時間對FOs 產量的影響：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麩皮、玉米麩皮質量2%（w/w）的豆粕，加水量為15 mL，接種量為1×105個孢子/瓶，在28 ℃分別培養48、72、96、120、144 h 后測定FOs 產量。

加水量對FOs 產量的影響：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麩皮、玉米麩皮質量2%（w/w）的豆粕，加水量分別為5、10、15、20、25 mL，接種量為1×105個孢子/瓶，在28 ℃培養72 h 后測定FOs 產量。

1.2.2.2 響應面優化試驗 在單因素實驗基礎上，利用Design-Expert version 13 軟件設計4 因素3 水平的響應面優化試驗，以FOs 產量為響應值進行試驗，試驗因素水平設計見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.3 玉米麩皮FOs 提取和含量測定 發酵結束后，取固體發酵樣品置于烘箱中于45 ℃烘干48 h，將烘干樣品進行粉碎，取干燥發酵產物以料水比為1:100（g/mL）混合，在水浴鍋中80 ℃浸提30 min，冷卻離心（5000 r/min，10 min），取上清備用。采用雙波長法測定上清液中FOs 濃度[20]，計算方法如下：

式中：A345表示波長345 nm 處的OD 值；A375表示波長375 nm 處的OD 值；b 表示比色皿的厚度，1 cm；C1表示阿魏酸的濃度，mol/L；C2表示阿魏酸低聚糖的濃度，mol/L。

1.3 數據處理

用Microsoft excel 2016 和SPSS 26.0 進行單因素ANOVA 檢驗，采用多項式對比、方差齊性檢驗和Duncan 氏法進行多重比較。P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。利用Design-Expert version 13 軟件進行響應面試驗設計與分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 氮源種類對FOs 產量的影響 玉米麩皮含豐富的碳源，為滿足好食脈孢霉生長代謝產FOs，需要適量補充氮源。以未添加氮源為對照，分別研究添加豆粕、玉米胚芽粕、玉米蛋白粉、硫酸銨對好食脈孢霉發酵產FOs 的影響，結果見圖1。

圖1 不同氮源對FOs 含量的影響Fig.1 Effects of different nitrogen sources on FOs content

如圖1 所示，以豆粕為氮源時發酵產物中FOs產量顯著高于其他氮源和對照（P＜0.05），以玉米胚芽粕和玉米蛋白粉為氮源時FOs 產量較低，以硫酸銨為氮源時FOs 產量最低。玉米蛋白粉含粗蛋白約60%，顯著高于豆粕（約40%），但是主要由醇溶蛋白和谷蛋白構成，水溶性較差，另外，氨基酸組成不平衡，賴氨酸不足[21]，使好食脈孢霉生長代謝不旺盛，導致FOs 產量相對較低，這與植物乳桿菌發酵產細菌素、魚醬發酵受賴氨酸影響相似[22-23]；硫酸銨雖是速效氮源，能為菌株生長提供氮素，但是相比對照組（玉米麩皮等量代替硫酸銨）和其他氮源來說，其營養成分較單一，使菌株生長狀態不佳，FOs 產量也最低，這與好食脈孢霉發酵醋糟產類胡蘿卜素的研究結果相似[24]。綜上，確定發酵培養基氮源為豆粕。

2.1.2 豆粕添加量對FOs 產量的影響 豆粕添加量對好食脈孢霉發酵產FOs 的影響見圖2。

圖2 不同豆粕添加量對FOs 含量的影響Fig.2 Effect of different soybean meal content in medium on FOs content

如圖2 所示，隨著豆粕添加量的提高FOs 產量呈先增加后減小的趨勢。微生物的生長代謝需要適宜的營養物質比例，發酵培養基中氮源濃度較低，導致菌體生長速度緩慢；氮源濃度過高，培養環境營養物質比例失衡，會導致菌體代謝不平衡，生長緩慢[25]。當培養基中豆粕添加量為玉米麩皮質量的2%（w/w）時，發酵產物種FOs 含量顯著高于其他豆粕濃度（P＜0.05）。所以，確定培養基中豆粕濃度為玉米麩皮質量的2%（w/w）。

2.1.3 發酵條件對FOs 產量的影響

2.1.3.1 接種量對FOs 產量的影響 接種量是影響發酵的主要因素，接種量不足會使底物轉化為產物的速度緩慢，生產周期延長，接種量過大則會使底物快速消耗，培養環境改變，從而影響菌株生長代謝[26]。接種量對好食脈孢霉發酵產FOs 的影響見圖3。

圖3 不同接種量對FOs 含量的影響Fig.3 Effects of different inoculation sizes on FOs content

如圖3 所示，接種量1×104個孢子/瓶時，FOs 生成量低；接種量較高時，菌體濃度高，營養物質消耗速率快，代謝產物的積累使環境條件發生改變，影響菌體的生長代謝，導致FOs 的產量低。當接種量為1×105個孢子/瓶時，玉米麩皮FOs 產量顯著高于其他接種量（P＜0.05）。因此，確定接種量為1×105個孢子/瓶。

2.1.3.2 發酵溫度對FOs 產量的影響 發酵溫度對好食脈孢霉發酵產FOs 的影響如圖4 所示，隨著玉米麩皮發酵溫度的提高，玉米麩皮FOs 產量的趨勢是先上升后下降。可能是由于溫度較低時，菌種生命速度緩慢，而當溫度超過菌株最適生長溫度時，菌株的生長繁殖受抑制，進而影響到FOs 的產量。當溫度為28 ℃時，玉米麩皮FOs 產量有最大值，顯著高于其他溫度（P＜0.05）。所以，確定發酵溫度為28 ℃。

圖4 不同發酵溫度對FOs 含量的影響Fig.4 Effect of different fermentation temperatures on FOs content

2.1.3.3 發酵時間對FOs 產量的影響 發酵時間對好食脈孢霉發酵產FOs 的影響如圖5 所示，隨著時間的延長玉米麩皮FOs 產量呈現先上升后下降的趨勢，培養初期，培養基中營養物質豐富，微生物代謝旺盛，FOs 產量顯著上升；當發酵3 d 時，玉米麩皮FOs產量（1.42 μmol/g）有最大值，顯著高于其他發酵時間（P＜0.05）；發酵3 d 后，隨著培養時間的延長，由于營養物質的消耗和代謝物的積累，培養環境可能不適宜菌體的生長代謝，釋放的FOs 被進一步降解。因此，確定培養時間為3 d。與平菇液體發酵玉米麩皮產FOs（發酵8 d，FOs 產量為12.515 μmol/L）[15]和出芽短梗霉發酵小麥麩皮產FOs（發酵84 h，FOs 產量為1.123 μmol/L）[27]相比，好食脈孢霉固體發酵產FOs 的發酵時間較短。

圖5 不同發酵時間對玉米麩皮FOs 含量的影響Fig.5 Effect of different fermentation time on FOs content

2.1.3.4 加水量對FOs 產量的影響 加水量對好食脈孢霉發酵產FOs 的影響如圖6 所示，在實驗范圍內隨培養基加水量的增加FOs 的產量呈先增加后減少的趨勢，當培養基加水量為15 mL 時FOs 產量最高（P＜0.05）。固態發酵培養基含水量會對培養基的孔隙率產生影響，進而影響培養基的溶氧量、散熱性、粘稠度以及培養基與氧氣的接觸面積，從而對菌體生長產生影響[28-29]。本研究中較高的加水量使培養基變得粘稠，氧氣與菌體接觸面積下降，影響了菌體代謝。因此，確定培養基加水量為15 mL。

圖6 不同加水量對FOs 含量的影響Fig.6 Effects of different water additions on FOs content

2.2 響應面優化試驗

利用單因素實驗獲得的培養條件最優結果作為設計各因素水平區間的依據，以FOs 的產量為響應值，對顯著影響好食脈孢霉固體發酵制備FOs 的培養條件，包括加水量（A）、接種量（B）、發酵溫度（C）、發酵時間（D）進行了優化，實驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計和結果Table 2 Design and result of response surface experiment

利用Design Expert 13 軟件對表2 中的結果進行回歸擬合，得到FOs 含量（Y）對A（加水量）、B（接種量）、C（發酵溫度）、D（發酵時間）的多項回歸方程：

由表3 可知，回歸方程模型P＜0.0001，表明模型具有極顯著性；回歸方程失擬項P＞0.05，不顯著，表明回歸模型是可靠的；擬合度R2=0.9322，說明擬合值與實際值顯著相關，模型精確度滿足要求；校正系數R2adj=0.8644，說明該模型能解釋86.44%響應值的變化。由方差分析得到4 個因素對玉米麩皮FOs 產量的影響為：接種量（B）＞發酵時間（D）＞加水量（A）＞發酵溫度（C）。一次項B 和二次項A2、B2、C2、D2對FOs 含量影響極顯著（P＜0.01），一次項D對FOs 含量影響顯著（P＜0.05）。

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Results of variance analysis of response sueface quadratic model

根據加水量、接種量、發酵溫度和發酵時間四個因素交互作用與響應值的關系得出三維響應面圖，結果見圖7。

圖7 兩因素交互作用對FOs 含量影響Fig.7 Effect of the interaction between two factors on the water content of FOs content

響應面曲面坡度越陡峭，等高線圖越偏橢圓形，因素之間的交互作用則越顯著，反之則表示兩因素間的交互作用不顯著。由圖7 可知，圖7（e）的曲面坡度陡峭程度高于其它各組，等高線也相對密集，表明接種量（B）和發酵時間（D）的交互作用對FOs 產量的影響高于其它組合對Fos 的影響，與方差分析結果一致。

回歸方程求解后得知四個因素的最優值分別為：加水量15.15 mL、接種量1.17×105個孢子/瓶、發酵溫度27.91 ℃、發酵時間75.09 h。結合實際，將上述優化后發酵條件調整為：加水量15.2 mL、接種量1.17×105個孢子/瓶、發酵溫度28 ℃、發酵時間75 h。用優化后的條件制備FOs，進行9 組平行試驗，產量為（1.52±0.02）μmol/g，與模型預測的理論值（1.56 μmol/g）接近，表明該模型可以較好地指導好食脈孢霉固體發酵玉米麩皮生產FOs。

響應面法是優化發酵工藝的有效方法之一，卜雯麗等通過響應面法優化了出芽短梗霉固態發酵啤酒糟制備阿魏酰低聚糖的工藝，優化后阿魏酰低聚糖含量提高至37.67 μmol/L[30]；陳秋燕等利用響應面試驗優化了枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母混合發酵麥麩產阿魏酰低聚糖的工藝，優化后其產量（1273.18 nmol/g）較優化前提高了94%[31]。在本研究中采用響應面法優化阿魏酰低聚糖生產工藝是可行的，阿魏酰低聚糖產量較優化前提高了60.83%。

3 結論

本文對GRAS 菌株好食脈孢霉固體發酵玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖的培養基組成和培養條件進行了優化，結果表明：發酵培養基由玉米麩皮5 g 以及玉米麩皮質量2%（w/w）的豆粕組成，加水量為15.2 mL，接種量為1.17×105個/瓶，發酵溫度為28 ℃，發酵時間為75 h。在優化后的條件下FOs 產量為（1.52±0.02） μmol/g，較優化前產量（0.94±0.03）μmol/g 提高60.83%。本文采用的固體發酵方法是對農產品的工業加工副產物資源化、高值化利用的有效途徑，采用該方法生產FOs 對于提升玉米麩皮附加值、延長玉米產業鏈、增加玉米加工企業經濟效益具有較大的意義，同時為FOs 的發酵生產提供新方法。后續需要針對玉米麩皮生產的FOs 的表征及在食品或飼料領域的進一步應用開展研究。