紅蕓豆多糖聯合運動改善飲食誘導的肥胖小鼠糖脂代謝紊亂

袁 彬，楊永紅，周海洋

（漯河醫學高等專科學校，河南漯河 462002）

高脂飲食（High fat diet，HFD）引起的代謝紊亂可導致多種疾病，包括動脈粥樣硬化、炎癥、高脂血癥和肝脂質過氧化，還可增加心血管疾病和2 型糖尿病的風險。由于不健康的飲食習慣和缺乏運動，人類正面臨著肥胖及其并發癥的巨大挑戰[1]。越來越多的研究表明，過多的脂質刺激導致細胞因子的異常，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、瘦素，并引發脂肪沉積，誘導肥胖相關代謝疾病的發生[2]。此外，代謝障礙已被證明與系統氧化應激密切相關，肥胖受試者體內氧化應激較高。動物研究還發現，喂食HFD 的小鼠可導致肝臟中活性氧（ROS）水平升高，降低線粒體代謝功能[3]。

目前，飲食調整和體育鍛煉干預仍被認為是調節代謝的有效方案[4]，許多天然提取物已被證明對代謝紊亂具有一定的療效。前瞻性研究表明，膳食多糖作為低熱量生物活性物質，具有保護肝臟、抗糖尿病、抗炎、抗腫瘤和抗氧化作用，對糖脂代謝和腸道菌群有顯著影響[5]。紅蕓豆中含有豐富的多糖（Polysaccharides from red kidney bean，PRK），能有效的改善小鼠糖脂代謝[6]。有證據表明，體育鍛煉對能量穩態有積極影響，并對各種肥胖所致疾病起到預防作用，激活線粒體、組織更好得能量供應鏈，改善能量平衡并更好地調節人體代謝[7]。體育運動已被證明可以增加骨骼肌細胞中線粒體的容量，提高線粒體氧化酶的活性，并調節線粒體中脂質的含量，從而改善線粒體功能以充分促進糖脂氧化[8]。然而，PRK 聯合運動（Exercise，E）是否能更好地調節肥胖引起的代謝紊亂尚未在體內進行研究。與此同時，這種聯合干預如何發揮其保護作用，在很大程度上仍未得到研究。在此，闡明其調控機制具有重要意義。因此，本研究采用高脂飲食誘導肥胖小鼠糖脂代謝紊亂，采用PRK 灌胃結合運動進行處理，考察其通過Nrf2/NQO1/HO-1 信號通路發揮降糖、降脂以及抗氧化作用，并分析及其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性C57BL/6 小鼠（SPF 級，18～22g，4 周齡）購自中國科學院上海動物實驗中心，動物合格證號SCXK（滬）2017-0005。將小鼠置于（24±0.5）℃，相對濕度60%的條件下，光照/黑暗循環12 h，在研究期間可自由進食和飲水；所有動物實驗均經校動物倫理委員會批準（批準號：2021-0107）；紅蕓豆 購自于河南省漯河市許慎市場；耐高溫α-淀粉酶 廣州華鈺生物科技有限公司；無水乙醇 山東蓄福源化工有限公司；木瓜蛋白酶 北京奧博星生物技術責任有限公司；氯仿、正丁醇 阿爾塔科技有限公司；AB-8 大孔樹脂 天津浩聚樹脂科技有限公司；試劑盒TC、TG、LDL-C、HDL、SOD、MDA、GSH-Px、胰島素、TNF-α、IL-6、IL-1β南京建成生物工程研究所；10%多聚甲醛、兔抗人PPARα、FASN、Nrf2、NQO1、HO-1、β-actin、HRP 標記的羊抗兔IgG 二抗 碧云天生物技術有限公司。

CKX41-C31B 倒置熒光顯微鏡 奧林巴斯（中國）有限公司；ELx800 全自動酶標儀 美國BioTek公司；BIO-RAD 伯樂電泳成像系統 美國BIO-RAD公司；電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；GF02100 g 多功能粉碎機 上海霸輝工具有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器責任有限公司；冷凍干燥機 Thermo Savant 公司；V-800 型真空旋轉蒸發儀 BUCH 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅蕓豆多糖的提取 500 g 紅蕓豆，電熱鼓風干燥箱50 ℃烘干，GF02100 g 多功能粉碎機粉碎過60 目篩制成豆莢粉，加入5000 mL 蒸餾水在磁力攪拌器中充分混合。95 ℃下加入10 mL 耐高溫α-淀粉酶（40000 U/g），持續攪拌30 min，冷卻至60 ℃。然后在混合物中加入12 mg 木瓜蛋白酶溶液（2000U/mg），在60 °C 水浴中孵育30 min，持續攪拌，以3500 r/min 離心15 min，取上清、濃縮，用四倍體積的無水乙醇在4 ℃下沉淀12 h，得到粗多糖。粗多糖用蒸餾水重新溶解，與1/3 體積的Sevag 試劑（氯仿/正丁醇（4:1，v/v））混合。充分攪拌30 min 后，以3500 r/min 離心10 min，重復脫蛋白3 次。所得溶液，濃縮至1/4 體積，AB-8 大孔樹脂純化，蒸餾水洗脫，收集濾液，旋轉蒸發儀濃縮、冷凍干燥機冷凍干燥得到紅蕓豆多糖[9]，經苯酚-濃硫酸法檢測多糖含量為91.2%。

1.2.2 動物分組 小鼠隨機分為5 組（每組n=8），即對照組，正常飲食；模型組，高脂飲食；PRK 組，高脂飲食+400 mg/kg/d PRK；E 組，高脂飲食+運動；PRK+E 組，高脂飲食+400 mg/kg/天PRK+運動。

1.2.2.1 飲食喂養及給藥 小鼠正常飲食，含量為碳水化合物（72.1%）、蛋白質（22.1%）和脂類（5.7%），總熱值約為3100 kcal/kg，或由碳水化合物（27.5%）、蛋白質（14.5%）和脂類（58.8%）組成的高脂肪飲食，包括正常飼料585.4 g/kg，黃油310.9 g/kg，酪蛋白73.2 g/kg，礦物質混合物24.6 g/kg，維生素混合物4.1 g/kg，DL-蛋氨酸1.8 g/kg。所有小鼠均給予正常自來水。同時PRK 組和PRK+E 組小鼠按照400 mg/kg劑量灌胃[9]，其余組給予等量的蒸餾水灌胃，每天1 次，連續12 周。在整個實驗期間，每周監測體重。

1.2.2.2 運動實驗 PRK+E 組、E 組的所有小鼠每周連續進行5 次運動訓練，連續12 周。從1 到4周，采用溫和的強度進行，在跑步機上運行的速度首先5 m/min 運動5 min，其次10 m/min 的速度運動30 min，然后以5 m/min 的速度運動5 min。從5 到12 周，小鼠首先5 m/min 運動5min，其次13 m/min速度運動30 min，然后5 m/min 運動5 min[10]。

1.2.3 口服葡萄糖耐量試驗（OGTT） 在干預第12 周進行OGTT 實驗。在小鼠禁食過夜后，給小鼠注射葡萄糖（1 g/kg 體重）。每30 min 從尾靜脈抽血，持續2 h 以上，采用血糖儀測試空腹血糖（FBG）水平。

1.2.4 樣本采集 干預12 周后禁食過夜，異氟醚麻醉后摘除眼球處死。采集血樣，3500 r/min 離心15 min，得到血清。收集肝臟清洗并稱重，將肝組織分為兩部分，一部分用10%福爾馬林保存，另一部分在磷酸鹽緩沖液中均質，3500 r/min 離心15min，得上清，備用。

1.2.5 生化指標檢測 生化分析儀測定血清或肝臟生化指標，包括血糖、胰島素、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）。肝臟上清采用試劑盒進行TC、TG、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）分析。采用酶聯免疫試劑盒（南京建成）檢測血液中胰島素、肝臟上清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、IL-1β含量。

1.2.6 組織病理學分析 取肝組織，用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.2～7.4）沖洗，然后固定于10%多聚甲醛溶液中。處理后的組織用石蠟包埋，切片（厚度4～5 μm），用蘇木精和伊紅染色（H&E），顯微鏡觀察。

1.2.7 Western Blot 實驗 將相同重量的組織放入加冰預冷的玻璃均質器中，加入裂解液和蛋白酶抑制劑（比例為100:1）。冰浴環境中進行研磨，靜置后，置于4 ℃，12000 r/min 離心15 min。吸取上清，用BCA 法測定其蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，并電泳轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。然后加入5%脫脂奶粉封閉1 h，加入以下一抗，4 ℃過夜:兔抗PPARα（1:1000）、FASN（1:1000）、Nrf2（1:1000）、NQO1（1:1000）、HO-1（1:1000）。TBST 洗滌三次，相應的二抗（1:1000）在室溫下孵育1 h，用TBST 清洗三次。β-肌動蛋白作為內參，增強化學發光溶液（ECL）處理條帶，Image J 軟件分析蛋白條帶。

1.3 數據處理

所有數值均以均數±標準差表示。采用Graph Pad Prism（5.0 版）進行統計分析，采用單因素方差分析和Newman-Keuls 多重比較檢驗。P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 紅蕓豆多糖聯合運動對機體重量和肝臟重量的影響

由圖1 可知，與對照組比較，模型組小鼠的體重和肝質量極顯著增加（P＜0.01），提示高脂飲食會影響小鼠的正常代謝，導致小鼠的體重和脂肪增加，堆積過多的能量超過了身體在脂肪組織中儲存脂肪的能力，各種來源甘油三酯溢出到非脂肪組織，增加脂肪組織的肥大和增生，最終導致代謝紊亂[11-12]。本研究中，與PRK 組和E 組相比，PRK+E 組體重和肝質量極顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），說明PRK 和E 對高脂飲食所致糖脂代謝紊亂具有一定的調節作用，這與Li 等[13]的研究基本一致，這說明營養與運動干預相結合可能是一種比單純飲食更有效的改善代謝綜合征進展的策略[14]。

圖1 紅蕓豆多糖聯合運動對機體質量和肝臟重量的影響Fig.1 Effects of polysaccharide from red kidney bean combined with exercise on body weight and liver weight

2.2 紅蕓豆多糖聯合運動對機體血糖的影響

本研究評價了從紅蕓豆中分離出的多糖對高脂喂養小鼠代謝障礙的影響，由圖2 可知，與對照組比較，模型組血糖、胰島素水平極顯著增加（P＜0.01），提示模型組存在潛在的胰島素拮抗。胰島素抵抗是肥胖的主要特征之一，過量攝入高脂食物會產生胰島素拮抗，嚴重時出現2 型糖尿病、肥胖、血脂異常等代謝并發癥[15]。研究顯示，與模型組比較，PRK 組、E 組和PRK+E 組血糖、胰島素水平極顯著降低（P＜0.01），表明多糖或（和）運動均可以緩解高脂肪和高能量攝入引起的代謝障礙[16]。而且，與PRK 組、E 組比較，PRK+E 組血糖、胰島素水平極顯著降低（P＜0.01），表明說明PRK 和E 聯合干預能更有效改善胰島素拮抗。而且已有文獻[17]報道多糖可以緩解高脂肪和高能量攝入引起的肥胖和代謝障礙，并調控血糖水平和代謝性疾病[18]。

圖2 紅蕓豆多糖聯合運動對機體血糖的影響Fig.2 Effects of polysaccharide from red kidney bean combined with exercise on blood glucose

2.3 紅蕓豆多糖聯合運動對血脂的影響

血脂包括甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）。由圖3 可知，與對照組比較，模型組小鼠TG、TC、LDL含量極顯著升高，HDL 極顯著降低（P＜0.01），說明肥胖和食用高脂食品與血清和肝臟脂類（包括甘油三酯、總膽固醇、游離脂肪酸和低密度脂蛋白膽固醇）的積累密切相關[19]。研究顯示，與模型組比較，PRK組、E 組和PRK+E 組TG、TC、LDL 含量極顯著降低（P＜0.01），HDL 極顯著增加（P＜0.01），證實PRK和（或）運動均可以減輕高脂飲食引起脂類代謝紊亂[20]。與PRK 組、E 組比較，PRK+E 組TG、TC、LDL 含量極顯著降低（P＜0.01），HDL 極顯著增加（P＜0.01），說明紅蕓豆多糖結合運動干預能有效緩解高脂飲食所引起的脂代謝紊亂。

圖3 紅蕓豆多糖聯合運動對機體血脂的影響Fig.3 Effects of polysaccharide from red kidney bean combined with exercise on body blood lipid

2.4 紅蕓豆多糖聯合運動對機體肝臟炎癥因子的影響

肥胖中常見的氧化應激和ROS 生成可激活核因子κB（NF-κB）通路，進而促進促炎細胞因子包括TNF-α、IL-6 和IL-1β的增加。由圖4 可知，與對照組比較，模型組的TNF-α、IL-6 和IL-1β極顯著增加（P＜0.01），提示模型組小鼠可能存在炎癥反應。而且已有研究表明，高脂飲食和氧化應激可導致炎癥因子分泌過多，引起慢性炎癥，慢性炎癥通過脂肪組織分泌促炎細胞因子在肥胖的發病機制中起著重要作用[21]。研究顯示，與模型組比較，PRK 組、E 組和PRK+E 組TNF-α、IL-6 和IL-1β含量極顯著降低（P＜0.01），表明PRK 和（或）運動均可以減輕高脂飲食喂養所致高濃度的TNF-α、IL-6 和IL-1β。與PRK 組、E 組比較，PRK+E 組TNF-α、IL-6 和IL-1β水平顯著降低（P＜0.05），表明PRK 聯合運動均可顯著降低肝臟中TNF-α、IL-6 和IL-1β的濃度，緩解炎癥反應，從而減輕肝臟損傷。

圖4 紅蕓豆多糖聯合運動對機體肝臟炎癥因子的影響Fig.4 Effects of polysaccharide from red kidney bean combined with exercise on liver inflammatory factors

2.5 紅蕓豆多糖聯合運動對機體肝臟TG、TC 的影響

TG、TC 均為脂類成分之一。研究報道，長期高熱量進食可加速TG 的合成，導致TG 在血液和肝臟中大量積累。如圖5 所示，與對照組比較，模型組小鼠肝臟TG、TC 極顯著上調（P＜0.01），說明長期喂食高脂會出現小鼠肝臟異常，導致脂肪的積累。經PRK聯合運動干預12 周后，與PRK 組、E 組比較，PRK+E組肝臟中TG、TC 含量均極顯著降低（P＜0.01）。圖6肝臟組織學染色進一步證實了這一點，與對照組比較，模型組肝細胞內出現大量脂滴，這說明動物模型已經成功建立。與模型組比較，PRK、E 或PRK+E 組肝臟脂質沉積物明顯減少，中央靜脈和小葉結構清晰。參與脂肪酸合成的基因FASN 是脂質生物合成的主要貢獻因子，脂肪酸氧化基因PPARα可抑制脂肪酸合成[22]。本研究中，與對照組比較，模型組肥胖小鼠中FASN 的表達量極顯著增加（P＜0.01），PPARα的表達量極顯著減低（P＜0.01），這與上述完全一致。而經過PRK、E 或PRK+E 處理后，與模型組比較，PRK、E 或PRK+E 組FASN的表達量極顯著降低（P＜0.01），PPARα的表達量極顯著增加（P＜0.01），說明處理組均能有效抑制脂類異常變化，有助于降低肝臟脂質積累，并首次證明了PRK 聯合E 通過下調脂肪酸通路表現出較好的協同效應，從而改善肥胖所導致的異常。

圖5 紅蕓豆多糖聯合運動對機體肝臟TG、TC 的影響Fig.5 Effects of polysaccharide from red kidney bean combined with exercise on liver TG and TC

圖6 肝切片H&E 染色（200×）Fig.6 H&E staining of liver sections (200×)

2.6 紅蕓豆多糖聯合運動對機體氧化應激的影響

由圖7 可知，與對照組比較，模型組MDA 水平極顯著升高（P＜0.01），GSH-Px 和SOD 活性極顯著降低（P＜0.01），說明高脂飲食喂養小鼠會導致肝臟組織中氧化應激發生，而且氧化應激被認為是胰島素抵抗、肥胖的主要執行因子之一，氧化應激的升高被認為先于高脂飲食引起的胰島素抵抗和肥胖的發生和發展[23]。本研究中，與模型組比較，PRK、E 或PRK+E 聯合干預后，GSH-Px 和SOD 極顯著增加（P＜0.01），MDA 含量極顯著降低（P＜0.01），說明PRK、E 或PRK+E 均能顯著改善飲食誘導的氧化應激（P＜0.05），其中PRK+E 干預效果更加明顯，這些結果清楚地表明，聯合干預能顯著保護肝臟免受肥胖誘導的氧化損傷，表現出比PRK 或E 組更充分的作用。另外，與PRK 和（或）E 處理比較，PRK 和E 聯合使用能極顯著增加Nrf2、NQO1 和HO-1 表達水平（P＜0.01），說明PRK 和E 聯合使用能顯著增強Nrf2 介導的II 相酶系統，特別是其下游基因NQO1 和HO-1，其可調節氧化應激發揮保護作用，減少炎癥激活，降低炎癥的發生與發展[24]。

圖7 紅蕓豆多糖聯合運動對機體氧化應激的影響Fig.7 Effects of polysaccharide from red kidney bean combined with exercise on oxidative stress

3 結論

目前的研究表明，PRK、E 和PRK+E 可以改善高脂飲食引起小鼠的體重和脂肪堆積，降低高脂飲食引起的肝臟炎癥，說明 PRK 和E 對高脂飲食所致糖脂代謝紊亂具有一定的調節作用。此外，本研究表明，與單獨使用PRK 或E 干預的小鼠相比，PRK+E干預對血脂、血糖和肝臟炎癥具有額外的益處。更重要的是，PRK+E 組的體重下降幅度大于PRK 或 E組，表明PRK 和 E 的組合對體重產生更有效的影響。本研究中，與對照組相比，PRK 和 E 可提高GSH-Px和SOD 的抗氧化酶活性，降低MDA 含量，同時激活Nrf2 信號通路。此外，TNF-α、IL-6 和IL-1β在 PRK+E 組中極顯著降低（P＜0.01），說明PRK+E 對Nrf2 信號通路具有一定的影響，PRK 聯合E 干預可以通過上調Nrf2、NQO1 和HO-1 有效減輕肥胖誘導的炎癥和氧化應激來保護肝臟，以應對肥胖誘導的代謝障礙，保護機體能量代謝，改善肝臟炎癥。與PRK 或E干預相比，該組合通過減少脂質積累、抑制炎癥和氧化應激，并表現出更大的有效協同效益，紅蕓豆多糖和運動的結合可能是一種可行的非藥物干預，以改善肥胖引起的代謝障礙。其調控作用與降低FASN 的表達，增加PPARα水平有關，并通過上調Nrf2、NQO1和HO-1 水平，降低氧化應激，減輕肝臟炎癥。因此PRK+E 的組合可能是干預高脂飲食所致的糖脂代謝紊亂的一種有前途的方法。