三白草酮對STZ 糖尿病小鼠胰島β 細胞凋亡與氧化應激的保護作用

李秋月，袁銘陽，吳麗娜，王小龍，張春晶，李 林，吳朋烊，李淑艷，趙正林

（齊齊哈爾醫學院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）已成為威脅人類健康的慢性代謝性疾病，而中國是全球糖尿病患者數最多的國家，其中2 型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）是最常見的類型[1-3]。其發病機制復雜，認為胰島β細胞損傷導致其功能衰竭和胰島素抵抗是T2DM 發病的中心環節[4-5]。氧化應激是T2DM發生發展的重要因素。長期高糖環境使胰島β細胞發生氧化應激導致機體氧化系統與抗氧化系統失衡，自由基過度釋放誘導胰島β細胞凋亡減少胰島素分泌。研究表明抑制胰島β細胞氧化應激和凋亡是控制糖尿病發展的有效治療手段[6-8]。基于復雜的發病機制臨床上尚無治療效果良好的藥物，晚期會帶來嚴重的并發癥。

三白草（Saururus chinensisi（Lour.）Baill），又叫塘邊藕，是我國民間廣泛利用的藥食兩用植物，含有木脂素類、黃酮類、多糖類等成分[9-11]。三白草酮（Sauchinone，Sch）是三白草中提取的單體類化合物，具有清熱解毒、消腫利尿、抗炎等眾多的藥理活性，它能抑制ROS 的增生，清除過量自由基，通過抗氧化、抗炎機制對一些腫瘤和炎癥性疾病具有良好的治療作用[12-13]。然而目前Sch 對于降糖作用及其機制的研究限于起步階段，利用體內實驗對氧化應激與凋亡等途徑的調控及其機制的實驗尚未有深入的研究。本研究利用STZ 誘導糖尿病小鼠模型，觀察氧化應激指標和凋亡的變化，探討三白草酮對胰島β細胞的保護作用及其機制，為臨床上對糖尿病治療藥物的中藥研發提供可靠的基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小鼠 隨機選取體重在8 周齡25～28 g，SPF 級雄性BALB/C 小鼠50 只，由齊齊哈爾醫學院動物實驗中心提供；實驗動物飼養在恒溫恒濕的獨立通氣系統中，晝夜日光節律，室溫（22±1）℃，濕度45%～55%，實驗期間飲食飲水自由。實驗動物使用許可證：SYXK（黑）2016-001。本實驗已通過齊齊哈爾醫學院實驗動物倫理委員會批準，并所有操作均按照相關指南執行。小鼠普通標準飼料（蛋白25%、碳水化合物55%、脂肪5%、輔料15%），由齊齊哈爾醫學院實驗動物中心提供；三白草酮（純度＞98%） 湖州展舒科技有限公司（CAS 號：177931-17-8）；高糖高脂飼料武漢亞法生物技術公司（批號040508）；STZ 美國Sigma 公司（S0130-100）；MDA、SOD、GSHPx 試劑盒 碧云天生物技術公司；血清胰島素ELISA試劑盒 南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-6上海酶聯生物科技有限公司；Bcl-2、Caspase-3、NFκB 抗體 美國Cell Signaling Technology。

Tecan Infinite? 200 Pro 多功能酶標儀 奧地利Tecan 公司；1658001 小型垂直電泳槽、1703935電泳轉印系統 美國BIO-RAD 公司；UVP Chemstudio touch 多功能成像儀 德國Analytikjena 公司；ACCU-CHEK Active 羅氏血糖儀 德國羅氏診斷有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組、模型建立、給藥 將雄性BALB/C小鼠50 只適應環境飼養7 d，隨機取出8 只為正常對照組，給予普通標準飼料喂養；其余小鼠用高糖高脂喂養2 周后，禁食8 h，用0.1 mmol/L 檸檬酸鈉緩沖液將STZ 配成1%的溶液，按40 mg/kg 腹腔注射；正常對照組小鼠注射等量檸檬酸鈉緩沖液。72 h 后用血糖測試儀取尾靜脈血測空腹血糖，大于11.1 mmol/L作為糖尿病小鼠模型[3,14]。造模后繼續給予高糖高脂喂養2 周后，取持續維持空腹血糖大于11.1 mmol/L小鼠，隨機分為模型組、Sch 低劑量組、Sch 高劑量組、二甲雙胍陽性對照組（Metformin），每組8 只，立即進行灌胃給藥。Sch 劑量按照人-小鼠體表面積換算系數10 計算等效藥物劑量[15]，Sch 低劑量組和Sch高劑量組分別每日灌胃一次Sch 10 和30 mg/kg，二甲雙胍陽性對照組每日灌胃一次100 mg/kg/次，連續給藥4 周。正常對照組和模型組灌胃等量無菌生理鹽水。

1.2.2 各組小鼠體重的測定 實驗期間每天觀察小鼠的進食、排尿、生長、活動等一般情況。Sch 給藥開始后每周測定一次各組小鼠的體重。

1.2.3 各組小鼠空腹血糖（Fasting blood glucose，FBG）、血清胰島素（Fasting insulin，FINS）、炎癥因子TNF-α、IL-6 濃度的測定 末次給藥后禁食12 h，利用血糖測試儀取尾靜脈血測定FBG。用5%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后從眼眶靜脈叢采血，3000 r/min 離心15 min 收集血清。按照試劑盒說明用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測FINS、TNF-α和IL-6濃度。胰島素抵抗指數（Homeostasis model assessment insulin resistance，HOMA-IR）按以下公式計算。

1.2.4 胰腺組織中氧化應激指標的檢測 取胰腺組織充分研磨后，用RIPA 蛋白裂解液提取總蛋白，3000 r/min 離心15 min 取上清液，用試劑盒檢測胰腺組織中的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）含量。

1.2.5 Western Blot 檢測胰腺組織Bcl-2、Caspase-3 和NF-κB 蛋白表達 將胰腺組織充分研磨后，利用RIPA 蛋白裂解液（含有蛋白酶抑制劑）進行勻漿離心，然后利用上清液按照蛋白濃度檢測試劑盒的說明進行蛋白質定量。每孔上樣30 μg 蛋白質，并按照常規操作方法進行電泳、轉膜、封閉后加入Bcl-2、Caspase-3 和NF-κB 一抗4 ℃孵育24 h，再加入二抗孵育1 h 后，用ECL 顯色。利用圖像分析系統掃描，GAPDH 作為內參對照。

1.3 數據處理

采用GraphPad Prism 6.02 統計軟件進行數據分析，數據均采用均數±標準差（Mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用Newman–Keuls 法進行檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 三白草酮對糖尿病小鼠體重的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠出現多飲、多食、多尿現象，各組小鼠的體重變化如表1 所示，STZ 注射造模后各組小鼠體重與正常對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），Sch 給藥過程中正常對照組小鼠體重逐漸增加而模型組小鼠體重減少，且在給藥第2 周開始，模型組小鼠體重顯著減少（P＜0.05），第3 周、第4 周極顯著減少（P＜0.01）。與模型組比較，Sch 低劑量組、Sch 高劑量組、Metformin 組小鼠“三多一少”癥狀顯著緩解，體重的增加速度比較緩慢，Sch 高劑量組在第3 周和第4 周體重增加的速度快于其他組，但Sch 低劑量、高劑量組對體重的變化無顯著劑量依賴性（P＞0.05）。此結果說明高糖高脂聯合STZ誘導糖尿病模型成功，同時Sch 對體重的增加有促進作用。

表1 Sch 對糖尿病小鼠體重的影響（n=8）Table 1 Effect of sauchinone on body weight in diabetic mice (n=8)

2.2 三白草酮對糖尿病小鼠空腹血糖（FBG）、血清胰島素（FINS）、胰島素抵抗的影響

各組小鼠FBG、FINS、HOMA-IR 的變化如表2所示，與正常對照組比較，模型組小鼠FBG 顯著增高（P＜0.05），FINS 水平明顯降低而胰島素抵抗指數極顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，Sch 低劑量組小鼠FBG 顯著下降、FINS 水平升高且胰島素抵抗顯著減弱（P＜0.05），Sch 高劑量組、Metformin 組小鼠FBG 極顯著下降，FINS 水平極顯著升高而胰島素抵抗指數呈極顯著下降趨勢（P＜0.01）；Sch 低劑量組和Sch 高劑量組FBG（P＜0.01）和FINS（P＜0.05）水平均有劑量依賴性。以上結果可知，STZ 對誘導糖尿病造模后，小鼠胰島β細胞損傷使胰島素分泌減少，誘導胰島素抵抗性導致顯著的血糖升高。利用Sch 低劑量、高劑量干預后血糖顯著控制而且胰島素水平有顯著升高趨勢，表明Sch 具有一定的降糖作用與二甲雙胍陽性對照組效果接近，而且有劑量依賴性，可推測Sch 可以改善胰島β細胞功能降低糖尿病小鼠胰島素抵抗性，提高胰島素敏感性，增加胰島β細胞的胰島素分泌功能。

表2 Sch 對糖尿病小鼠FBG、FINS、胰島素抵抗的影響（n=8）Table 2 Effect of sauchinone on fasting blood glucose, fasting insulin and insulin resistance in diabetic mice (n=8)

2.3 三白草酮對糖尿病小鼠血清炎癥因子表達的影響

糖尿病的發生過程中存在明顯的炎癥反應，TNFα和IL-6 是體內主要的炎癥因子，會誘導胰島素抵抗的同時降低胰島β細胞對葡萄糖的敏感性，促進胰島β細胞的損傷導致細胞凋亡的發生最終影響胰島素分泌[16]。ELISA 檢測各組小鼠血清中TNF-α和IL-6 變化如表3 所示，與正常對照組比較，模型組小鼠血清TNF-α和IL-6 極顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，Sch 低劑量組TNF-α和IL-6 水平顯著降低（P＜0.05），Sch 高劑量組小鼠血清中TNF-α和IL-6水平極顯著降低（P＜0.01）；Sch 低劑量組和Sch 高劑量組血清中TNF-α和IL-6 的變化無劑量依賴趨勢（P＞0.05）。此結果說明，在糖尿病的發病過程中炎癥因子TNF-α和IL-6 的表達增高會促進機體炎癥的發生，引起胰腺組織的炎癥損傷影響胰島β細胞的胰島素分泌功能，可推斷炎癥反應在糖尿病發病機制中的重要作用。Sch 的干預可以抑制體內炎癥反應減輕胰島β細胞的損傷，抑制胰島β細胞的凋亡而保護胰島β細胞。

表3 Sch 對糖尿病小鼠血清TNF-α 和IL-6水平的影響（n=8）Table 3 Effect of sauchinone on the serum concentrations of TNF-α and IL-6 in diabetic mice (n=8)

2.4 三白草酮對糖尿病小鼠胰腺組織氧化應激指標的影響

長期的高糖環境能誘發體內氧化應激狀態。MDA是評價體內氧化應激反應的主要指標，具有強烈的細胞毒性，可以反映氧化應激的強度以及細胞損傷的程度。SOD 是一種抗氧化酶，能清除體內產生的自由基，具有抗氧化作用。GSH-Px 是一種抗氧化物分解酶，以GSH 為底物與SOD 協同清除體內的各種氧自由基，使細胞免受氧化損傷而保護細胞的作用[17-18]。各組小鼠胰腺組織中氧化應激指標的變化如表4 所示，與正常對照組比較，模型組小鼠胰腺組織MDA水平極顯著升高，而SOD 和GSH-Px 活性極顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，Sch 低劑量組小鼠胰腺組織中MDA 水平顯著降低，而SOD 和GSH-Px 活性顯著升高（P＜0.05），Sch 高劑組MDA 水平極顯著降低，而SOD 和GSH-Px 活性極顯著升高（P＜0.01）；Sch 低劑量組和Sch 高劑量組小鼠胰腺組織中MDA、SOD 和GSH-Px 活性的變化均有劑量依賴性，具有極顯著差異（P＜0.01）。因此可以認為，體內在氧化應激狀態下，會失去機體中氧化與抗氧化系統的動態平衡，誘導胰島β細胞的應激損傷，破壞胰島細胞功能，減少胰島素分泌，能進一步說明糖尿病發病機制中氧化應激的重要作用。Sch 干預后體內MDA、SOD、GSHPx 等氧化與抗氧化指標明顯得到改善，因此能夠緩解體內氧化應激狀態，提高抗氧化能力，減輕胰島β細胞的損傷。

表4 Sch 對糖尿病小鼠胰腺組織MDA、SOD 和GSH-Px活性的影響（n=8）Table 4 Effect of sauchinone on pancreatic MDA, SOD and GSH-Px in diabetic mice (n=8)

2.5 三白草酮對糖尿病小鼠胰腺組織中Bcl-2、Caspase-3、NF-κB 蛋白表達的影響

氧化應激與炎癥會導致胰島β細胞的損傷與凋亡。Caspase 和Bcl-2 蛋白家族是細胞凋亡過程中最關鍵的調控因子。Caspase-3 是細胞凋亡的關鍵因子，是細胞凋亡發生的不可逆標志，Bcl-2 蛋白在凋亡的發生過程中發揮抑制凋亡的作用，NF-κB 是與細胞的生長、分化、凋亡、炎癥等相關的重要調控因子，被激活后可以促進各種炎癥因子的表達和氧化應激的產生，導致細胞的凋亡[19-21]。Western blot 檢測各組小鼠胰腺組織中相關蛋白表達結果如圖1 所示，與正常對照組比較，模型組Bcl-2 表達極顯著減少，而Caspase-3、NF-κB 蛋白表達極顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比較，Sch 低劑量組胰腺組織中Bcl-2 蛋白表達極顯著增高（P＜0.01），Caspase-3、NFκB 蛋白表達顯著減少（P＜0.05），而Sch 高劑量組Bcl-2蛋白表達極顯著增高，Caspase-3、NF-κB蛋白表達極顯著減少（P＜0.01）；Sch 低劑量組和Sch 高劑量組比較， Caspase-3 蛋白表達有劑量依賴性，有顯著差異（P＜0.05）而Bcl-2、NF-κB 蛋白表達劑量依賴性具有極顯著差異（P＜0.01）。由此可以說明，高糖環境容易導致炎癥和氧化應激使胰島細胞損傷產生胰島素抵抗，影響胰島細胞的功能逐漸誘導β細胞凋亡，凋亡相關蛋白的表達與糖尿病發病機制密切相關。

圖1 各組小鼠胰腺組織中Bcl-2、Caspase-3、NF-κB蛋白表達（n=3）Fig.1 Protein expressions of Bcl-2, Caspase-3, and NF-κB in pancreatic tissues of diabetic mice (n=3)

3 討論與結論

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是由于遺傳以及體內外各種因素而導致的復雜的內分泌代謝性疾病，是全球范圍內危害人類健康的三大疾病之一，而且發病率逐年增高，給社會和家庭帶來嚴重的負擔。其中90%以上為T2DM[1]。因此，目前對T2DM 發病機制及其治療的研究是眾多學者關注的熱點問題。首先，本研究利用STZ 誘導T2DM 小鼠模型后，檢測小鼠的體重等一般狀況，FBG、FINS 和胰島素抵抗指數等生化指標，成功得出穩定的糖尿病動物模型，并且用Sch 干預后發現Sch 對糖尿病小鼠胰島β細胞具有明顯的保護作用。

很多研究認為二甲雙胍是臨床上常用的糖尿病治療藥物，雖然降糖效果良好，但是長期服用具有明顯的胃腸道刺激作用。因此，降糖作用顯著同時沒有副作用的糖尿病治療藥物的研發具有非常重要的臨床意義[22]。本研究發現，Sch 低劑量和高劑量干預顯著降低糖尿病小鼠FBG，分別降低31.8%和52.03%，增加胰島素分泌同時改善胰島素抵抗作用。因此Sch 有顯著的降血糖作用且對胰島β細胞具有保護作用，但是目前對其機制沒有詳細而系統的解釋。糖尿病的發病機制非常復雜，與多種因素有關。其中氧化應激與凋亡導致胰島β細胞功能降低是重要發病機制[7]。長期的高血糖誘導氧化應激狀態，體內產生過多的ROS，使機體對抗氧化功能的負荷過重，最終導致體內氧化與抗氧化調節失衡，從而造成蛋白質、脂類、核酸等分子的過度氧化影響胰島β細胞的正常功能，導致胰島β細胞損傷和胰島素抵抗。因此目前認為氧化應激是糖尿病及其并發癥發生發展的關鍵機制之一[23-24]。本研究發現，糖尿病小鼠胰腺組織中MDA 明顯增多，而抗氧化酶SOD 和GSH-Px 活性明顯降低，說明高糖導致體內氧自由基的聚集使脂質發生過氧化，同時體內抗氧化酶的活性降低促進氧自由基的堆積，加快細胞的損傷，符合氧化與抗氧化失去平衡導致細胞自我保護機制破壞造成組織損傷的理論[8,18]。本研究發現Sch 干預后可以有效改善胰島細胞的氧化應激狀態。近年研究表明，三白草的不同成分對糖尿病動物模型中有明顯降血糖的作用，通過對氧化與抗氧化指標的作用，改善胰島β細胞的功能[25-26]。

氧化應激狀態下產生的過多的ROS 還可以激活細胞凋亡信號，發生胰島β細胞凋亡，減少胰島素分泌，產生胰島素抵抗。細胞凋亡是由多種基因調控的細胞程序性死亡過程，與細胞內胞質、線粒體以及內質網的多種信號通路相關。其中Caspase 家族和Bcl-2 家族是最常見的調控因子。Caspases 在體內維持內穩態中發揮關鍵作用，控制細胞凋亡和炎癥等重要過程。目前認為Caspase 家族是細胞凋亡過程中發揮主要作用的蛋白質，其中Caspase-3 起關鍵作用[27-28]。當細胞受到凋亡刺激后立即激活并活化相關信號通路誘導細胞進入凋亡階段。Bcl-2 家族蛋白激活內源性凋亡途徑，誘導細胞的凋亡。Bcl-2 蛋白定位于細胞內膜、內質網和線粒體，一些家族成員在細胞死亡的刺激下從細胞質移位到線粒體。Bcl-2的家族中有促進凋亡蛋白和抑凋亡蛋白組成，其中Bcl-2 是目前認為最普遍的抑制凋亡的蛋白，其表達降低與細胞凋亡的加快有密切相關[29]。一些文獻報道顯示，糖尿病大鼠胰腺組織中Bax/Bcl-2 及Caspase-3 水平升高，如果上調抗凋亡基因Bcl-2 的表達水平，能有效抑制Caspase-3 的表達水平，可以降低細胞凋亡[14,30]。

NF-κB 是一種核轉錄因子，參與各種細胞的增殖分化以及免疫應答相關的信號通路，在細胞凋亡的過程中起重要的調節作用。在DM 的發病過程中，高血糖導致細胞內ROS 的含量增多，激活細胞內的NF-κB，會破壞NF-κB 與其他各種核轉錄因子的相對穩定和動態平衡，激活IκB 激酶（IKK），使之發生磷酸化導致與NF-κB 解離，游離的NF-κB 進入細胞核內啟動炎癥因子TNF-α和IL-6 等的表達[21,31]。TNFα和IL-6 是炎癥反應中最重要的炎性介質，也是外源性激活細胞內凋亡的細胞因子，能加快胰島β細胞凋亡的同時促進胰腺組織的炎癥損傷，誘導胰島素抵抗[32-33]。本研究結果發現，模型組小鼠胰腺組織中Bcl-2 蛋白表達明顯減少而Caspase-3、NF-κB 蛋白表達明顯升高，同時血清中炎癥因子的表達也明顯增高，此結果說明凋亡可以誘導胰島β細胞損傷紊亂體內糖脂代謝使胰島素分泌減少FBG 升高，產生明顯的胰島素抵抗。

糖尿病是病因復雜的代謝性疾病，長期的高血糖導致糖代謝的紊亂會影響脂類和蛋白質等營養物質的代謝，沒有及時調整健康的膳食環境或治療不當容易誘發嚴重的并發癥。因此在日常生活中，利用食品或保健品的多途徑、多靶點和多系統的作用特點，開發有效的調節糖代謝的食品資源來治療DM 及其并發癥是關鍵問題。三白草酮（sauchinone，Sch）是從傳統三白草中提取的主要單體類化合物之一，具有清熱解毒、消腫利尿、抗炎之功效，通過抗炎、抗病毒、抗氧化等機制對腫瘤、肝炎、神經退行性病變、急性肺損傷、氣道變應性疾病、細菌感染等具有良好的治療作用，尤其通過降血糖、抗氧化作用及其對細胞的保護作用備受關注[12,34]。本研究發現，利用Sch 低劑量、高劑量給藥過程中，糖尿病小鼠的“三多一少”癥狀明顯改善，降血糖作用顯著。為進一步分析其機制，檢測胰腺組織中氧化應激指標，Sch 干預后與模型組比較MDA 水平降低，SOD、GSHPx 活性明顯升高，說明有效清除高糖所引起的氧自由基的堆積，改善機體內氧化應激狀態，緩解胰島β細胞的損傷。還發現Sch 能增加胰腺組織的抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，抑制Caspase-3 和NF-κB 蛋白的表達，從而明顯抑制炎癥因子TNF-α和IL-6 的水平。

綜上所述，Sch 減輕胰島β細胞的損傷，增加胰島素分泌，抑制胰島素抵抗，主要通過DM 發病機制中的氧化應激和凋亡為靶點，能抑制高糖所致的氧化應激，維持內環境穩態，減少細胞的凋亡而發揮保護胰島β細胞的作用。今后進一步深入研究Sch 的作用靶點和探討調控相關信號通路的作用機制，為糖尿病治療藥物的研發提供更加可靠的基礎實驗依據。