過量SO2 導致葡萄落粒機制研究進展

張瑞家，吳培文，熊佳欣，朱本忠

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京海淀 100083）

我國是世界最大的葡萄生產國和消費國，2020 年產量達到1431 萬噸[1]，其中鮮食葡萄占我國葡萄總產量的80%左右[2]。但是，由于鮮食葡萄含水量高、易染真菌[3]，在貯藏過程中容易發生腐爛、干梗和褐變等問題[4]。SO2處理是一種典型的葡萄化學保鮮方式，在葡萄貯藏過程中對致病真菌的生長繁殖具有強烈的抑制作用，能夠減少葡萄采后灰霉菌、交鏈孢霉菌和鐮刀菌等引起的腐爛和軟化[5]，并且可以降低葡萄自身呼吸強度來減少營養物質的損耗[6]。但SO2在使用過程中的釋放速度和釋放量不易控制[7]，并且不同品種葡萄對SO2耐受程度有非常大差異，使得SO2在采后貯藏使用中容易發生過量問題而導致果粒脫落[8]，從而影響到鮮食葡萄的商品銷售，造成較大的經濟損失。本文綜述了SO2對葡萄氣孔開度、離區組織結構、細胞壁降解酶活性、激素含量和活性氧水平等方面的影響，總結了目前關于過量SO2影響葡萄果實脫落的潛在機制，為精準使用和改進SO2保鮮方式提供理論支撐。

1 SO2 保鮮方式的應用和局限

目前在物理方法、化學方法、生物方法以及多法聯用等方面都出現了一些新型葡萄貯藏保鮮方法[9]，但是SO2處理仍然是最經濟、高效的保鮮方式[10]。SO2保鮮方式一般分為熏蒸法和緩釋法。熏蒸法主要是在密閉空間內直接燃燒硫磺產生SO2氣體，對罩上塑料薄膜成垛的葡萄熏蒸20～30 min，隨后進行通風排出SO2氣體，在之后貯藏過程中每間隔7～10 d 再熏蒸30 min[11]；緩釋法主要使用亞硫酸鹽結合粘結劑、助流劑、崩解劑、潤滑劑和功能助劑[7]，采用不同包裝工藝制成片劑、粉劑和釋放紙[12]。緩釋法中SO2釋放分為兩個階段：第一階段在葡萄包裝1～2 d 內釋放較高濃度SO2進行表面殺菌；第二個階段為緩慢釋放，能在長時間運輸和貯藏過程中抑制致病菌生長繁殖[13]。熏蒸法和緩釋法都存在釋放不穩定的情況，容易造成短時或局部SO2過量，引起葡萄落粒[7]。針對適量SO2能夠維持良好的果實品質和過量SO2會造成嚴重生理傷害的問題，確保貯藏過程中保持合適的SO2濃度一直是研究的重點。現階段SO2保鮮方式的研究主要集中在調整不同的保鮮劑量、改善復合膜材料以及結合其他保鮮方式，去實現SO2長效、穩定、適量的釋放，最終達到減少葡萄落粒。

目前美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）規定鮮水果中SO2殘留量不大于10 mg/kg，我國GB 2760-2014《食品安全國家標準 食品添加使用標準》規定鮮水果SO2殘留量標準是不大于50 mg/kg[14]。許多研究表明，不同品種、不同成熟度的葡萄對SO2敏感度不同[15-17]，容易產生不同程度的過量問題。葡萄中過量的SO2殘留不僅會導致落粒、漂白[18]等品質問題，還會對人體健康造成危害。SO2保鮮劑產品對不同品種葡萄的適用性可能會產生差異，針對不同品種、產地的葡萄通常需要調整SO2保鮮劑的釋放效果來滿足實際生產中的貯藏保鮮需求，例如在0 ℃下‘陽光玫瑰’葡萄使用SO2緩釋劑（CT 系列）的落粒率始終低于對照組[19]，而在25 ℃和RH 60%下使用CT 化學保鮮劑處理‘巨峰’葡萄模擬短途運輸和短期貯藏，從第3 d 開始SO2組落粒率卻顯著高于對照組[15]。另外，處于過量SO2氣體貯藏環境中的‘巨峰’葡萄出現落粒率增加的情況，而1.5%殼聚糖涂膜處理能抑制SO2引起的葡萄采后落粒[8]。因此，不同條件下SO2保鮮中存在的落粒問題成為葡萄保鮮研究中關注的重點。

2 SO2 引起葡萄落粒的機制

落粒是指葡萄果粒與果穗分離而產生的一種脫落現象[20]，是一個發生在果梗離區（Abscissionzone，AZ）且高度調控的生理過程，與組織代謝失調[21]和細胞衰老[22]的進程密切相關，受到環境和自身內部因素的影響[23]。在實際生產應用中由于SO2釋放量和釋放速度不易控制，容易發生SO2過量問題導致出現落粒。下面將從圖1 五個方面闡述過量SO2引起葡萄落粒產生的機制。

圖1 過量SO2 影響葡萄落粒的機制Fig.1 Mechanism of excessive sulfur dioxide affecting berry abscission

2.1 影響氣孔開度

SO2是通過氣孔進入葡萄離區從而產生落粒等傷害見圖2。葡萄漿果表面含有少量的氣孔，并且具有一層蠟質層，但果梗上存在大量的氣孔和皮孔，是葡萄與外界進行氣體交換的主要通道。對‘紅地球’、‘無核白’、‘木納格’和‘巨峰’四個葡萄品種的果梗結構和SO2積累量的差異研究表明，果梗的含水量和氣孔面積與SO2積累量呈現顯著正相關關系，并且果梗和穗梗是SO2積累量最多的兩個部位[24]。Wu等[25]研究也發現SO2主要通過葡萄果梗和果蒂進入葡萄離區，而葡萄離區的亞硫酸鹽殘留量與葡萄落粒率呈現正相關關系。

圖2 SO2 進入葡萄的途徑Fig.2 Pathway of SO2 into grapes

氣孔是植物抗逆反應的第一道防線，適當逆境條件會造成氣孔關閉，但當亞硫酸根離子積累到一定濃度便會影響氣孔的正常開啟和關閉[26]。用不同濃度（0～5 mmol/L）Na2SO3/NaHSO3溶液處理甘薯的表皮，可迅速提高內源性H2S 和NO 的水平，以劑量依賴的方式誘導氣孔關閉[27]。在蠶豆中低濃度（0.0001～0.1 μmol/L）亞硫酸通過降低內源性脫落酸（Abscisic acid，ABA）的水平拮抗其作用，促進氣孔開放；反之，高濃度（10 μmol/L）的亞硫酸通過增加內源性ABA 的水平，抑制氣孔開放[28]。在黃花菜中不同濃度（0～5 mmol/L）Na2SO3/NaHSO3溶液以劑量依賴的方式降低保衛細胞活力，誘導保衛細胞程序性死亡導致氣孔不可逆轉的關閉[29]。Li 等[30]同樣發現SO2熏蒸處理導致擬南芥葉片產生過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2），使得葉片發生氣孔關閉和細胞凋亡。當環境SO2濃度低時，與耐受有關的生化特征成為植物脅迫反應的主體；當SO2濃度較高時，避免SO2大量進入植物組織占據主要地位。

2.2 破壞組織結構

在鮮食葡萄中SO2處理產生的殘留主要在果梗和穗梗的離區細胞中[24]，并且一般以亞硫酸、亞硫酸氫根、亞硫酸離子形式存在。這些物質具有很強的反應活性，可以穿透細胞膜破壞蛋白質和酶結構中的二硫鍵使其變性或者酶活性改變[31-32]。通過對‘無核白’葡萄的組織解剖結構進行觀察，其SO2傷害主要始于細胞膜系統的破壞[33]。SO2處理使得葡萄內部脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）活性升高、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量及組織相對電導率增加，丙二醛和膜蛋白交聯聚合促使膜相結構轉化為凝膠狀態[34]。這些變化說明SO2使葡萄細胞膜發生過氧化，細胞膜受到損傷進而透性增加[26]。在SO2與殼聚糖復合處理進行葡萄保鮮時，發現單獨使用SO2使得‘巨峰’葡萄離區結構變化大于復合處理，當貯藏4 d后其離區細胞已明顯呈絮狀化狀態存在[25]。另外，SO2溶于水造成的酸性環境也可能直接對植物細胞壁結構造成破壞。SO2-乙醇-水（SEW）預處理竹渣中發現SO2生成的亞硫酸能夠通過磺化作用使半纖維素和木質素的溶解性增強，導致細胞壁結構遭到破壞[35]。因此，SO2造成葡萄離區組織結構的破壞主要是由于形成了亞硫酸鹽，并且使離區細胞的細胞膜發生了變性，形成顆粒狀或絮狀物質，最終發生質壁分離導致離區細胞結構松散，葡萄果粒易發生脫落。

2.3 改變細胞壁降解酶活性

細胞壁主要由纖維素、半纖維素、木質素和果膠構成，并伴有結構蛋白、酚類、脂肪酸及金屬離子的存在[36]。植物細胞壁分為胞間層、初生壁和次生壁三部分。葡萄脫落過程中主要涉及到離層細胞中膠層的水解和薄壁細胞纖維素壁分解[37]。例如，‘無核白’葡萄落粒增加的同時，其離區的多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）和果膠酯酶（Pectinesterase，PE）活性逐漸增加，并且二者間呈顯著正相關[38]。同樣，SO2使‘巨峰’葡萄離區中的細胞壁降解酶——PG 和纖維素酶（Cellulase，Cx）活性明顯升高[25]。另外，對SO2處理后的‘克瑞森’葡萄進行轉錄組學分析發現，木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶（Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase，XTH）和膨脹素（Expansin，EXP）基因表達被強烈上調，其中XTH 能夠水解細胞壁中的半纖維素，EXP 能夠打破纖維素、半纖維素和果膠之間的非共價鍵以及誘導微纖維移位；同時，果膠甲酯酶（Pectin methylesterases，PME）、果膠乙酰酯酶（Pectin acetylesterases，PAE）、PG 和脫水應答蛋白基因表達被上調，這些結果表明果膠作為中膠層的主要成分被降解[39]。在擬南芥的研究中也發現其細胞壁降解酶受到SO2處理的影響，PME、PAE、XTH 和EXP 基因表達出現上調[40]。因此，SO2能夠影響細胞壁修飾酶和水解酶基因的表達和酶活性的改變，從而參與到葡萄落粒過程中。

2.4 影響激素含量

葡萄受到發育和外界環境刺激產生的漿果脫落，通常都是由激素介導的[41]。果穗采收后斷絕了來自莖尖、葉片和根中促進生長的激素供給，同時葡萄果粒離區的分化受到乙烯和生長素（auxin，IAA）的影響[42]。當激素平衡狀態被打破，細胞內產生脫落信號并傳遞給離區，細胞壁降解機制被激活，脫落開始進行[43]。另外植物激素對于器官脫落的調節通常是協同發揮作用的[44]。已經有研究表明高等植物通過植物激素信號轉導網絡對于SO2脅迫產生響應。Giraud等[39]通過轉錄組分析揭示SO2引起葡萄內參與生長素、乙烯和茉莉酸信號的組分mRNA 被顯著上調。在SO2引起的‘巨峰’葡萄落粒中，通過轉錄組研究發現SO2誘導激素信號轉導、糖代謝、能量代謝和細胞壁代謝途徑相關基因的表達[45]。另外，Li 等[30]研究證明擬南芥對SO2脅迫響應通過miRNAs 完成，這些miRNAs 基因的啟動子序列中包含多種植物激素反應元件，例如脫落酸響應元件（ABREs）、赤霉素響應元件（TATC-box，P-box 和GARE-motif）、水楊酸響應元件（TCA-element）、乙烯響應元件（ERE）和茉莉酸甲酯響應元件（CGTCA-motif）[30]。另有研究發現不同劑量SO2處理對葡萄的激素水平會產生不同的影響。當使用一張‘農大牌’葡萄保鮮紙處理5 kg‘無核白’葡萄時，葡萄果梗、穗梗及果粒中IAA 和GA 均有明顯增加，ABA 略有降低，乙烯釋放量明顯較少；而當保鮮紙增加到三張時，ABA 含量明顯增加，乙烯釋放呈現顯著增加的趨勢，并且加速葡萄果粒的脫落[46]。葡萄體內應激反應是由激素的平衡狀態被破壞所產生的，不同劑量的SO2能夠通過影響激素水平產生抑制脫落或促進脫落的信號。另外，由于不同葡萄品種對SO2的耐受性有所不同，SO2劑量和葡萄品種這兩個因素可能都對內部激素含量的變化情況產生復雜多樣的影響，這需要進一步的深入探究。

2.5 影響活性氧水平

葡萄在過量SO2的逆境環境下還會導致過多的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）積累[47]，包括單線態氧（1O2）、超氧陰離子（O2-·）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（·OH）等[48]。例如‘巨峰’葡萄和‘紅地球’葡萄受到SO2傷害時，其活性氧清除體系中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）兩種酶活性降低，同時活性氧水平、谷胱甘肽（GSH）含量升高[49]。在其它植物中也發現SO2影響活性氧清除體系組分的改變。例如擬南芥暴露于SO2環境中72 h，谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）、過氧化物酶（Peroxisome，POD）、SOD 活性上升；但當時間延長到120 h時，SOD、GPX 活性下降，ROS、MDA 含量升高膜脂發生過氧化[50]。在過氧化物酶體中亞硫酸氧化酶（Sulfite oxidase，SO）也能夠通過降解亞硫酸鹽產生硫酸鹽和H2O2[15,51]。葡萄細胞內的ROS 處于一種動態平衡的狀態，細胞中的抗氧化酶系統在SO2脅迫響應時對ROS 水平變化發揮著重要的作用[49]。適量濃度SO2刺激細胞產生較低水平的ROS，而ROS作為信號分子能夠刺激抗氧化酶基因的表達，增強細胞的抗氧化防御能力[52]；但在高濃度或長時間的SO2環境下，細胞抗氧化系統難以應對，對ROS 清除能力有限，導致細胞發生氧化損傷，細胞物化結構發生改變，從而最終導致葡萄果實與果梗分離[53-54]。

3 展望

近年來，隨著消費者對果蔬品質的要求不斷提高，SO2處理作為葡萄主要保鮮方式，貯藏期間的落粒問題成為葡萄貯藏保鮮的研究重點。本文綜合分析目前國內外學者關于過量SO2對葡萄落粒影響的研究，其機制主要表現在SO2可通過調節果梗上氣孔開度、破壞離區組織結構、改變細胞壁降解酶活性、影響激素含量、影響活性氧水平等多種途徑，最終導致葡萄果實脫落的現象發生。未來對SO2引起葡萄果實脫落的研究應從單一的關鍵酶、激素含量、細胞結構等水平的影響向代謝組學、信號通路等系統研究方向發展。另外，還應著力于探究SO2劑量與落粒相關的細胞壁降解酶、激素合成及信號轉導途徑、ROS 清除途徑的基因表達差異等方面，明確不同SO2劑量影響葡萄落粒相關基因表達的機制；激素等外源處理方式能顯著影響細胞壁代謝關鍵基因的表達[55-56]，也為降低SO2引起葡萄果實脫落提供更多的方法選擇，相信不久的將來SO2在葡萄貯藏過程中產生的弊端將會得到解決。