乳酸菌混合發酵對不同品種紅棗濁汁品質的影響

袁靜宇，張 毅

（1.包頭輕工職業技術學院，食品生物與檢測系，內蒙古包頭 014000；2.中國農業大學動物科學技術學院，北京 100083）

紅棗又名大棗、棗子，是鼠李科棗屬植物，在我國栽培歷史悠久，相關文獻考證早在五千年前我國先民便有種植紅棗的歷史，紅棗自古就被列為“五果”之一，是我國重要的經濟果品[1]。相關研究表明早在2018 年中國紅棗產量就超過了15 萬噸，其種植面積及產量均位居世界第一[2]，在世界紅棗貿易中占據絕對地位。紅棗貯藏期較短、貯藏穩定性較差，這些缺點對紅棗的深加工利用造成阻礙[3]。目前為了解決紅棗易腐特性，棗農及紅棗加工業一般采用干制方式進行保存紅棗，并且我國目前紅棗的主要消費方式也是以干棗為主[4]。干棗富含各種活性成分如多糖、三萜酸、酚類和環核苷酸，具有廣泛的生物功能活性，如抗氧化、抗炎和抗腫瘤以及保肝功能[5]?；诩t棗重要的經濟及營養價值，世界各國將其作為保健功能食品進行加工銷售。因此，不斷探索優良的干棗加工技術，豐富產品種類，對提高紅棗的經濟效益及保健效益具有重要意義。

乳酸菌（LAB）發酵可以提高各種食物的營養價值和可消化性，相關研究表明LAB 能夠產生淀粉酶、肽酶、蛋白酶、脫氫酶、脫羧酶及β-葡萄糖苷酶等活性酶，能夠將初級底物轉化為具有生物功能的活性物質[6]。Szutowska[7]研究表明益生菌產品可以降低血清中膽固醇水平，并且改善胃腸功能，增強人體免疫系統。目前乳制品是LAB 發酵最常用和最成熟的基質，如制作酸奶和奶酪。然而隨著乳糖不耐受、高膽固醇、乳蛋白過敏以及素食消費者的日益增加，單純乳制品發酵難以滿足消費需求[8]。大量研究表明水果中富含糖、礦物質、維生素、膳食纖維、酚類物質及抗壞血酸，可以促進乳酸菌菌株的生長[9]。Kwaw 等[10]研究表明益生菌發酵果蔬汁可以豐富其風味、延長保質期，并且較發酵前產生了更多的活性成分。因此隨著消費者對功能性食品的需求增加，豐富益生菌水果產品十分必要。

混濁紅棗汁是一個復雜食物體系，含有果膠及蛋白等大分子膠體，與清汁相比，紅棗濁汁含有更豐富的膳食纖維，口感更柔和，風味更濃，營養價值更高[11]。目前針對紅棗乳酸菌發酵研究多集中于探究單一紅棗品種清汁與單一發酵菌株的發酵過程，較少文獻探究混合菌株發酵對不同品種紅棗濁汁發酵特性及品質，特別是酚類物質含量及抗氧化能力的變化。因此本研究利用混合菌株對不同品種紅棗進行乳酸發酵，探究混合菌株發酵對不同品種紅棗濁汁品質的影響，為更好的選擇優良品種，提高紅棗深加工潛力提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗樣品 本研究選取五個紅棗代表性品種的完整干紅棗：‘和田大棗’（HTZ）購自新疆和田、‘延川狗頭棗’（GTZ）購自陜西延川、‘交城駿棗’（JCZ）購自山西交城、‘贊皇大棗’（ZHZ）購自河北贊皇及‘寧陽大棗’（NYZ）購自山東寧陽。所有干棗均由2021 年全紅成熟期紅棗干制而成；MRS 培養基 北京陸橋科技有限公司；氫氧化鈉、碳酸鈉、葡萄糖、福林酚試劑、亞鐵氰化鉀、乙腈、2,2-二苯基-1-吡啶并肼基（DPPH）及磷酸均為分析純（純度＞97%） 四川西龍化學有限公司；沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、表兒茶素、蘆丁、槲皮素、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、葡萄糖、蔗糖、果糖及水溶性維生素E（Trolox）均為色譜純（純度＞99.8%） 上海源葉生物技術有限公司；植物乳桿菌CICC20765（LP-20765）、嗜酸乳桿菌CICC22162（LA-22162）及發酵乳桿菌CICC22549（LF-22549） 中國工業菌種保藏中心。

CR-400 型色差計 日本柯尼卡美能達有限公司；UV-mini1120 型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；FE-28 型pH 計 上海梅特勒托利多科技（中國）有限公司；RA-600 型可溶性固形物測定儀上?？赡离娮庸煞萦邢薰?；LC-20A 型高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 棗汁制備及菌種接種發酵 干棗棗汁的制備參考Li 等[2]的研究方法，干棗利用純凈水洗凈后去核添加25%（w/v）的純凈水置于50 ℃條件下進行充分浸泡4 h，期間不斷攪拌使果渣中營養成分充分溶于水中，浸泡結束后利用80 目滅菌棉布進行過濾。發酵接種前，渾濁果汁在80 ℃下巴氏滅菌10 min，冷卻到室溫后接種。

菌種活化及接種參考Peng 等[12]研究方法，將置于甘油管低溫保存的LP-20765、LA-22162 及LF-22549 活化后，單獨的培養物以1:1:1 的比例接種到100 mL 棗汁中，接種量為0.5%（v/v）并在37 ℃下培養36 h。未接種的對照組果汁在相同條件下培養，所有發酵組一式三份。

1.2.2 可溶性固形物、pH、總糖、總酸、總酚、濁度及色澤測定 果汁可溶性固形物、pH、總糖、總酸、總酚及濁度測定測定參考Li 等[2]研究方法：果汁可溶性固形物含量測定使用手持型可溶性固形物測定儀進行測定；果汁pH 利用pH 計進行測定；果汁總糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸法；總酸含量利用滴定法進行測定；果汁總酚含量利用福林酚比色法進行測定；果汁濁度利用酶標儀進行測定；果汁色澤利用標準LAB 色差計進行測定。

1.2.3 有機酸及可溶性糖含量測定 利用高效液相色譜法測定果汁有機酸及可溶性糖含量，樣品制備：果汁離心（6000×g，10 min）后取上清液過0.45 μm PES 親水性濾膜注射至樣品瓶中。液相條件參考Luciano 等[13]的方法。有機酸色譜條件：利用Terra MS C18柱（250×4.6 mm，5μm）分離有機酸，進樣量為10 μL，柱溫為30 ℃，使用二極管陣列檢測器在210 nm 處測量吸光度，洗脫液流速為0.7 mL/min，流動相A 為去離子水，流動相B 為0.01 mol/L（NH4）3PO4，洗脫梯度為0～8 min，60%A；8～15 min，100%A。

可溶性糖色譜條件：利用Supelco 柱（Supelcogel TMC-610H 柱，30 cm×7.8 mm 分離可溶性糖，進樣量為10 μL，柱溫保持在80 ℃，檢測器為示差折光檢測器，采用等濃度洗脫分離可溶性糖，洗脫流速為0.6 mL/min，洗脫緩沖液為85%乙腈水溶液。糖和有機酸的標準物通過峰保留時間進行確定，并通過峰面積進行量化。利用具有良好線性關系（R2＞0.997）的校準曲線來定量糖和有機酸。

1.2.4 活菌數量測定 發酵過程中的活菌數通過用無菌生理鹽水連續稀釋至106～1010倍來確定[2]。將0.1 mL 稀釋液接種于MRS 瓊脂培養基上，后將平板在37 ℃下培養36 h 后計數。乳酸菌活菌數記錄為log CFU/mL。

1.2.5 單體酚類物質含量測定 利用高效液相色譜法測定果汁中單體酚類物質含量，果汁上樣前處理方式與可溶性糖及有機酸方法一致。色譜條件：流動相A 為1%（v/v）甲酸溶液，流動相B 為乙腈。洗脫步驟：0～5 min，5%B；5～25 min，12% B；25～40 min，30%B；40～50 min，45%B；50～60 min，5%B。洗脫溫度為30 ℃，流動相速率為1 mL/min，洗脫柱型號為C18柱（4.6 mm×250 mm），酚酸類物質檢測波長為260 nm，黃酮物質檢測波長為320 nm，果汁樣品通過峰保留時間并使用外標法對結果進行定量分析。

1.2.6 抗氧化能力測定 以果汁DPPH 自由基清除率及鐵離子還原能力（Ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）來衡量果汁抗氧化能力，具體測定步驟參考Li 等[2]DPPH 自由基清除率結果表示為DPPH自由基抑制的百分比（%），具體測定步驟為：1 mL 樣品加入2 mL DPPH 甲醇溶液（45 mg/L）中。將混合物在黑暗中孵育30 min 后，用紫外分光光度計在517 nm 處測量吸光度。結果以DPPH 自由基抑制百分比表示，見公式（1）。

下面在分析EM斷路器傳熱過程的基礎上，建立在不同負荷電流下的基于等效熱通道的穩態熱點計算模型，并通過案例與有限元法進行比對，驗證所提方法的有效性。

式中：Ai為樣品+DPPH 溶液吸光度；Aj為樣品+甲醇溶液吸光度；Ac為甲醇+DPPH 溶液吸光度。

FRAP 鐵離子還原力具體測定步驟為：將1 L 乙酸鹽緩沖溶液（0.3 mol/L，pH3.6）、100 mL 2,3,5-氯化三苯基四氮唑和100 mL 三氯化鐵（0.02 mol/L）混合，并在37 ℃放置30 min 以獲得反應試劑，隨后將0.2 mL 樣品和6 mL 反應試劑混合，在37 ℃下反應30 min。利用紫外分光光度計在593 nm 處讀取吸光度，結果以Trolox 當量表示（mmoL Trolox/L）。

1.2.7 感官評定 發酵果汁感官評定參考Peng 等[12]的研究方法，感官評價小組由20 名受過訓練的從事果蔬加工科研人員組成（10 名女性及10 名男性）。將20 mL 樣品倒入玻璃杯中，隨機品嘗。在測試過程中，提供淡鹽水進行漱口。消費者接受度測試打分使用9 分量表：1、強烈不喜歡；2、非常不喜歡；3、適度不喜歡；4、稍微不喜歡；5、既不喜歡也不反感；6、略喜歡；7、適度喜歡；8、很喜歡；9、強烈的喜歡，對發酵果汁酸度、口感、香味、顏色、質地及總體接受度進行打分。

1.3 數據處理

數據結果以三個獨立實驗的平均值±標準差表示。使用SPSS20.0 進行數據分析。利用鄧肯氏檢驗分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。所得數據之間的相關性采用標準皮爾遜相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同品種紅棗汁理化指標分析

不同品種紅棗汁理化性質如表1 所示，品種對紅棗汁pH、可溶性固形物、總糖、總酸、總酚、濁度、L*值、a*值及b*值具有明顯影響。不同品種紅棗汁pH 處于4.53～5.66 之間，和田大棗棗汁的pH 最高，交城駿棗棗汁pH 最低。研究表明發酵初期果汁pH 影響其發酵特性，低pH 發酵果汁會抑制乳酸菌生長[14]，因此合適的pH 對果汁發酵至關重要。五個品種可溶性固形物含量范圍為11.1～15.57 °Brix之間，這也與Kou 等[15]的研究結果一致，可溶性固形物主要由糖、酸、維生素、礦物質等組成，可為乳酸菌生長提供良好的碳源。五個品種紅棗汁總酸含量范圍為0.45～0.66 g/100 mL 之間，贊皇大棗棗汁的總酸含量最高，和田大棗棗汁總酸含量最低。

表1 不同品種紅棗汁理化性質Table 1 Physicochemical properties of red jujube juice of different varieties

相關研究表明紅棗品種對其總酚含量具有顯著影響[16]，不同品種紅棗汁總酚含量范圍為1.75～2.67 g/L，和田大棗棗汁總酚含量最高，狗頭棗棗汁總酚含量最低。相關研究表明酚類化合物參與果汁發酵，為發酵果汁提供香氣來源，能夠防止微生物腐敗，并且控制發酵速率[17]。此外，它們還通過與蛋白質的相互作用進而控制膠體的穩定性。因此，適宜的酚類物質含量對果汁發酵過程感官品質的形成至關重要。濁度及色澤是發酵果汁的基本質量標準，不同紅棗品種的濁度、L*值、a*值及b*值差異顯著。其中和田大棗棗汁的濁度最高達到了3.87，交城駿棗棗汁的濁度最低為2.55。Tian 等[18]研究表明濁度是果汁的穩定性指標，濁度越大果汁穩定性越好，因此和田大棗棗汁可能具有最高的果汁穩定性。

不同品種棗汁亮度值L*變化范圍為41.88～55.67，紅色值a*值變化范圍為13.68～19.85，黃色值b*值變化范圍為38.18～51.67。和田大棗棗汁具有較低的L*值及較高的b*值，這也通常表明其褐變程度較高。紅棗果汁美拉德反應的進行通常伴隨著濃郁棗風味的產生，因此和田大棗棗汁可能具有更為濃郁的棗香味。此外Ye 等[17]研究表明果汁總酚含量與其褐變程度呈正相關關系，本研究在和田大棗棗汁中也得到了類似結論。綜上品種對紅棗汁理化性質具有明顯影響，研究結果可為發酵產業篩選良好品種提供理論支持。

2.2 棗汁發酵前后可溶性糖含量分析

表2 不同品種紅棗汁發酵前后可溶性糖含量變化（mg/mL）Table 2 Changes of soluble sugar content in different red jujube juice before and after fermentation (mg/mL)

2.3 棗汁發酵前后有機酸含量分析

有機酸影響著果汁的口感、風味、色澤、穩定性及耐儲性。不同品種紅棗汁發酵前后有機酸含量變化如表3 所示，共檢測了紅棗中的四種有機酸，其中蘋果酸及酒石酸是紅棗汁中最主要的有機酸，這與Li 等[2]的研究結果一致。不同品種紅棗汁中酒石酸含量范圍為2.64～3.88 mg/mL，蘋果酸含量范圍為1.38～1.66 mg/mL，其中和田大棗棗汁酒石酸含量最高，贊皇大棗蘋果酸含量最高。不同品種棗汁經混合乳酸菌發酵后其酒石酸、蘋果酸及檸檬酸含量均有所下降，其中蘋果酸含量下降最為明顯（下降了27.7%～53.3%）。這與Chen 等[22]的研究結果一致，即經乳酸菌發酵后果汁的蘋果酸濃度顯著降低，蘋果酸是乳酸菌代謝的主要碳源。此外不同品種棗汁經發酵后其乳酸含量顯著提高，主要原因為乳酸菌代謝促進了乳酸形成。和田大棗棗汁經發酵后其乳酸含量升高最為明顯（升高了1.7 mg/mL），這也表明和田大棗棗汁能夠更好的促進混合益生菌進行蘋果酸-乳酸轉化，能夠減弱棗汁的酸度，使其更加柔和。此外發酵后棗汁酒石酸含量顯著降低，這是由于乳酸菌代謝產生的酒石酸脫水酶，該酶可以將酒石酸轉化為乳酸[2]。紅棗汁經發酵后檸檬酸的含量也產生了明顯的下降趨勢，主要原因為檸檬酸被乳酸菌分解產生如雙乙酰、乳酸等物質[23]。

表3 不同品種紅棗汁發酵前后有機酸含量變化（mg/mL）Table 3 Changes of organic acid content in different red jujube juice before and after fermentation (mg/mL)

2.4 棗汁發酵后微生物數量分析

益生菌的生長對發酵至關重要，其生存能力與有機產品的質量及穩定性相關。不同品種紅棗汁發酵結束后的活菌數如圖1 所示，并且各個品種發酵汁活菌數量具有顯著性差異（P＜0.05）。所有紅棗品種的發酵汁中活菌數均高于1×106CFU/mL，這表明紅棗汁促進了益生菌的生長和代謝。其中和田大棗及贊皇大棗棗汁的活菌數量較高，活菌數量分別達到了11.2 及10.4 lg CFU/mL），可能的原因為其可溶性糖類物質能夠被很好的利用，此外也表明這兩個品種有利于乳酸菌的生長。Li 等[2]針對紅棗的乳酸發酵微生物生長的研究也得到了類似的結果，即紅棗汁是乳酸菌良好的生長基質。

圖1 不同品種紅棗汁發酵后活菌數Fig.1 Viable counts in different varieties of red jujube juice after fermentation

2.5 棗汁發酵前后酚類物質含量分析

果汁中豐富的酚類物質不僅能夠給予果汁良好的貯性，并且能夠為人體提供良好的功能活性物質。不同品種棗汁發酵后酚類物質變化如表4 所示，共檢測了八種酚類物質，其中五種酚酸類物質（沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸及阿魏酸）、三種黃酮類物質（表兒茶素、蘆丁及槲皮素）。不同品種棗汁酚類物質含量差距較大，其中沒食子酸、原兒茶酸及綠原酸是紅棗汁中最主要的酚酸，蘆丁是棗汁中最主要的類黃酮，這也與Li 等[2]的研究結果一致。其中和田大棗及贊皇大棗棗汁中含有最高含量的沒食子酸，分別達到了26.67 及23.81 mg/L；和田大棗及寧陽大棗棗汁中含有最高含量的原兒茶酸，其含量分別達到了8.65 及8.28 mg/L；贊皇大棗及狗頭棗棗汁中含有最高含量的綠原酸，其含量分別達到了4.96 及4.82 mg/L；贊皇大棗及和田大棗棗汁中含有最高含量的蘆丁，其含量分別達到了2.29 及2.19 mg/L。

表4 不同品種紅棗汁發酵前后酚類物質含量變化（mg/L）Table 4 Changes of phenolics content in different red jujube juice before and after fermentation (mg/L)

乳酸發酵對不同品種紅棗汁主要酚類物質含量具有明顯影響，不同品種棗汁經發酵后其沒食子酸及綠原酸含量呈現下降趨勢，其原兒茶酸、咖啡酸及蘆丁含量呈現升高趨勢。Li 等[2]研究結果表明，添加干酪乳桿菌的紅棗汁發酵后蘆丁含量明顯提升；添加瑞士乳桿菌的紅棗汁發酵后咖啡酸含量顯著提升。本研究結果也表明了復合乳酸菌發酵紅棗汁能夠集合單一菌種發酵的優勢。此外Filannino 等[24]研究結果表明乳酸菌代謝產生的肉桂酰酯酶能夠將綠原酸轉化為咖啡酸，這可能是發酵過程綠原酸含量下降，咖啡酸含量升高的主要原因。相關研究表明乳酸菌菌株多樣性能夠使它們在不同環境下產生特定的代謝途徑[25]，這種途徑造成了酚類物質的代謝及生成，這也是復合菌株發酵具有優勢的主要原因[26]。此外和田大棗發酵后具有最高的沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸及蘆丁含量，這表明其可能具有更高的抗氧化能力，具有更高的生物活性功能。綜上，復合乳酸菌促進了棗汁中酚類物質的轉化，這可能增強了其特定的某種活性功效。

2.6 棗汁發酵前后抗氧化能力及相關性分析

不同品種紅棗汁發酵前后抗氧化能力的變化如圖2 所示，未發酵前和田大棗及贊皇大棗棗汁具有最高的DPPH 自由基清除能力（分別為62.3%及60.2%）及最高的FRAP 鐵離子還原力（分別為4.3及4.15 mmol Trolox/L）。不同品種棗汁經發酵后其DPPH 自由基清除能力及FRAP 鐵離子還原力顯著增強（DPPH 自由基清除能力增強了38.2%～45.2%；FRAP 鐵力還原力增強了20.3%～60.6%）。不同品種抗氧化能力提高程度具有明顯差異，這與微生物代謝產生的抗氧化物質密切相關，即不同基質下微生物代謝各異[27]。相關研究表明乳酸菌發酵產物抗氧化能力的變化與發酵物酚類物質變化密切相關[28]。棗汁發酵后顯示出高抗氧化活性可能由其酚類物質變化有關，酚類物質可以為高活性自由基提供氫原子，從而阻止自由基反應[29]。

圖2 不同品種棗汁發酵前后抗氧化能力變化Fig.2 Changes of antioxidant capacity of different varieties of red jujube juice before and after fermentation

棗汁酚類物質及抗氧化能力相關性分析如表5所示，DPPH 自由基清除能力及鐵離子還原力與咖啡酸及蘆丁含量呈現極顯著正相關（P＜0.01）；與綠原酸含量呈現顯著負相關（P＜0.05）。此外蘆丁及咖啡酸含量與綠原酸含量呈現顯著負相關（P＜0.05）。這也證明了乳酸菌促進了棗汁中酚類物質的轉化，提高了其抗氧化能力。

表5 酚類物質及抗氧化能力相關性分析Table 5 Correlation coefficients of phenolic profiles and antioxidant activities

2.7 發酵后棗汁感官評定

發酵后不同品種紅棗汁的酸度、口感、香氣、顏色、質地及綜合接受度評分結果如圖3 所示，五個品種紅棗發酵汁的綜合接受度評分均大于6 分，這表明混合乳酸發酵紅棗汁感官品質較好，此外和田大棗發酵汁的酸度及口感得分最高，主要原因可能為其含有更高含量的可溶性糖及乳酸，其糖酸比更適宜。此外和田大棗還具有較高的香氣及顏色評分，產生這一現象的主要原因可能為和田大棗含有更高含量的還原糖，更易發生美拉德反應，產生了濃郁的棗香味[30]，基于此和田大棗棗汁最高的綜合接受度評分。此外贊皇大棗發酵汁由于其香氣、色澤、口感及酸度較為平衡，其綜合接受度得分僅次于和田大棗發酵汁。綜上，和田大棗及贊皇大棗發酵汁感官品質較好，綜合接受度較高，是適宜乳酸發酵的良好品種。

圖3 不同品種棗汁發酵后感官評價Fig.3 Sensory evaluation of fermented red jujube juice of different varieties

3 結論

本研究以混合菌株發酵五個品種紅棗汁，探究了其理化性質、活菌數及感官品質，研究結果表明：五個品種棗汁都是混合菌株發酵的良好基質，發酵結束其活菌數都超過了6 lg CFU/mL，并且感官評定綜合接受度評分皆大于6 分。此外發酵過程中葡萄糖、果糖及蘋果酸是混合菌株生長的主要碳源。乳酸發酵促進了酚類物質的轉化，其咖啡酸、原兒茶酸及蘆丁含量較發酵前顯著升高。此外乳酸發酵增強了紅棗汁的抗氧化能力。和田大棗及贊皇大棗棗汁經發酵后具有最高的活菌數量，分別達到了11.2 及10.4 lg CFU/mL，并且其沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸及蘆丁含量較高，具有較強的抗氧化能力，其DPPH自由基清除能力分別達到了62.3%及60.2%；FRAP鐵離子還原力分別達到了4.3 及4.15 mmol Trolox/L。此外這兩種發酵棗汁還具有較高的綜合接受度評分，其感官品質較優。因此和田大棗及贊皇大棗可能是乳酸發酵較為合適的紅棗品種，這有助于提高紅棗乳酸發酵產品品質，提高其附加值。此外由于我國紅棗產區及品種眾多，研究只針對我國五大產區的五種代表性紅棗品種進行研究，因此后續更為全面的了解各產區紅棗品種的乳酸發酵特性對十分必要。本文研究結果為提高紅棗汁營養價值，篩選優良紅棗加工品種提供理論依據。