金華火腿中單增李斯特菌的風險評估

李銀輝，張紅敏, ，孟媛媛，薛 甜，王曄茹，白 莉，李 豪，謝家瑩，劉海泉,3,4，謝慶超,3,5, ，趙 勇,3,5,

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.國家食品安全風險評估中心，北京 100022；3.農業農村部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（上海），上海 201306；4.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；5.上海海洋大學食品質量安全檢測實驗室，上海 201306）

單增李斯特菌是一種能導致侵襲性李斯特菌病的食源性致病菌，受污染的即食食品是人類李斯特菌病的高風險來源[1]。自20 世紀80 年代以來，單增李斯特菌對食品行業產生了巨大的經濟影響，人類李斯特菌病的暴發與受污染食品的關聯一直被衛生部門所關注[2]。目前國外諸多學者對發酵肉制品中單增李斯特菌進行了污染情況調查，總體污染率為3.29%，其中歐洲的污染率為2.82%，美洲的污染率為7.50%[2-4]；根據我國污染物檢測網2010～2020 年的相關資料[5-7]顯示，生禽肉、即食肉制品和即食涼拌菜中都不同程度的受到單增李斯特菌污染，其中發酵肉制品的總體污染率為0.82%。對以上國內外研究結果進行比較分析后，發現豬肉以及豬肉制品中單增李斯特菌是較為常見且危害較大的食源性致病菌。

發酵火腿是以豬腿肉為原料，在特定微生物和酶的作用下，經過較長時間的腌漬發酵處理后制成的具有獨特風味的產品。中式發酵火腿品類繁多，是我國重要的發酵肉制品，由于不同的習俗，各地加工工藝有細微差異，但加工原理基本一致[8]，其中金華火腿是中式發酵火腿的典型代表，因其具有獨特的色、香、味、形在國內外享有盛名。2008 年通過并實施了修訂后的GB/T 19088-2008《地理標志產品 金華火腿》，其中描述的是經傳統加工方式制成的火腿。但隨著科技的進步，現代化的加工工藝逐步取代傳統加工工藝成為主流，實現了中式發酵火腿產品規模化，標準化的量產，從而成為人們餐桌上的常見美食[9]，但針對現代生產工藝過程中各個環節的食品安全風險研究較少。同時關于發酵火腿的研究中，多以其理化指標的表征以及保健作用的探究為主，而對其中食源性致病菌的定量風險評估的報道同樣較少。發酵火腿生產過程較長，易造成病源微生物的污染，再加上部分地區有生食的習慣，因此亟需對發酵火腿中單增李斯特菌進行風險評估[10]。

本研究以金華火腿為研究對象，通過模擬現代工藝金華火腿生產銷售的全過程，如腌漬、發酵成熟、銷售貯藏環節中單增李斯特菌的生長可能性及污染程度，用概率分布進行描述。對金華火腿中單增李斯特菌進行初步定量暴露評估，并對即食金華火腿切片進行定量風險評估，以期為發酵火腿中食源性致病菌的風險評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 數據來源

1.1.1 初始污染量 我國豬肉中單增李斯特菌污染率和污染水平等數據主要通過查閱國內外相關的調研報告[11-12]；用Beta 分布描述其污染率，用PLm進行表示。用累積分布函數描述陽性樣品中單增李斯特菌的污染水平，并用CLmM+（lg CFU/g）表示。為了計算陰性樣品中該菌的濃度（CLmM-），采用Jarvis 等式計算陰性樣品中的實際污染水平[13]，公式如下：其中，M 表示陰性樣品中單增李斯特菌的真實濃度（lg CFU/g），V 表示檢測時所使用的樣品量（g），Z 表示陰性樣品數量，N 表示檢測樣品總量，用反向偏斜累積概率分布（Left-handtailed cumulative）描述陰性樣品中單增李斯特菌的濃度。生豬肉中單增李斯特菌的污染水平（NLm）采用離散函數Discrete（CLmM+:CLmM-, PLm:（1-PLm））進行表示[14]。

1.1.2 加工及銷售過程中相關參數 本研究主要參考金華火腿的現代加工工藝，包括原料預處理、腌制、發酵成熟等基本過程[9,15]。制作過程中pH、水分活度（Water activity，aw）、溫度，以及發酵過程中乳酸菌的濃度等參數從國內外有關金華火腿的文獻資料中獲得。采用下文中的微生物預測模型模擬現代工藝條件下單增李斯特菌在金華火腿中的生長概率及存活數量[16-20]。

火腿制作過程的第一步是將豬腿肉進行腌制，腌制的作用是使肉中的水與鹽接觸，將鹽擴散到肌肉組織中。腌制的時間根據不同類型火腿的工藝而有所差異，金華火腿的腌制期通常為20～30 d[21]。腌制期間內部及表面沒有檢測到乳酸菌，所以在腌制過程中不考慮乳酸菌的影響，而在腌制完成之后，表面和內部微生物數量增加[22]。火腿在腌制過程中的pH是動態變化的（最大值6.14，最小值5.72），在火腿內部測量的aw水平在0.92 到0.992 之間，但在其表面的aw小于0.94（范圍為0.64～0.94），腌制過程中溫度為4～10 ℃[9]。腌制時間（Timesal）和腌制時的溫度（Tsal）用Uniform 函數進行描述；腌制時的水分活度（awsal）和pHsal值用Pert 函數進行描述。

金華火腿在發酵成熟過程中經歷了微生物的生長演替，許多研究表明乳酸菌可以抑制單增李斯特菌的生長，抑制方式主要通過細菌競爭、產酸和產生細菌素等[23]。金華火腿發酵成熟過程中，火腿表面微生物迅速增加，進入發酵期后乳酸菌的數量在較短時間內增加至6 lg CFU/g，隨著發酵的進行乳酸菌的數量下降至3 lg CFU/g 并維持很長一段時間，發酵成熟后乳酸菌數量降至較低水平[22,24]。本研究中，用Pert函數來描述發酵成熟過程中乳酸菌的數量。發酵成熟過程于溫控房中進行，溫度控制在10～30 ℃之間，發酵成熟時間一般為45～80 d[25]。根據發酵過程中乳酸菌的水平（NLABf）、發酵溫度（Tf）、pHf和發酵過程中水分活度（awf）等參數模擬了單增李斯特菌的生長狀況[26-27]。

發酵成熟期后，金華火腿會被分發給零售商，這一過程通常在室溫下進行。采用Triang 分布模擬全國氣溫分布[28]，并假設該產品的零售期為7～8 個月。火腿儲存期間pH 在5.54～6.55 之間變化，水分活度（awret）最小為0.857，最大為0.986。儲藏過程中乳酸菌初始量相對較少，生長緩慢，大部分時期保持在2 lg CFU/g 的水平；本次評估中假設儲存銷售期間乳酸菌的數量不變。

1.1.3 消費及人口數據 第七次人口普查顯示全國總人數為1.4×109人，成人為1.1×109人，嬰幼兒為1×108人，老年人為2×108人，孕婦為1.5×107人[29]。消費者每餐食用即食火腿切片的量用2016 版《中國居民膳食指南》中即食食品攝入量代表，采用Pert 函數進行表示[30]。

澳大利亞不同年齡段消費者對于酒種的偏好具有較大差異：14～17歲年齡段消費者更偏愛喝預調烈酒，但隨著年齡增長，喜愛瓶裝葡萄酒的消費者占比逐漸增加，而預調烈酒的占比逐漸減少。對于烈酒，14～17歲年齡段消費者消費烈酒比例占該群體總消費酒精飲料的60%，為各年齡階段群體中最高。但隨著年齡的增加，消費者飲用烈酒的比例總體上呈下降趨勢，18～24歲年齡段消費者消費烈酒的比例占該人群總消費酒精飲料的22%，為各年齡階段群體中最高。25～29歲及30～39歲消費者消費普通烈度啤酒占該人群總消費酒精飲料的27%，為各年齡層最高。具體情況見圖2。

1.2 實驗方法

1.2.1 風險評估流程 依據國際食品法典委員會頒布的CAC/GL-30（1999）《微生物風險評估原則和指南》，從危害識別、危害特征描述、暴露評估和風險特征描述4 個方面進行定量風險評估。

危害識別、危害特征描述：通過查閱相關專著、教材、國內外文獻或評估報告，收集單增李斯特菌的危害特征資料。

暴露評估是從我國生豬肉中單增李斯特菌的初始污染水平開始，以零售時最終污染水平結束，該模型分為四個模塊：生肉、腌漬、發酵成熟和銷售環節，每個模塊的輸出分布被用作下一個模塊的輸入或作為最終輸出。考慮到金華火腿的特定制造條件（溫度、pH、aw及乳酸菌數量），采用單增李斯特菌生長/不生長的簡化建模方法，用于確定火腿加工和銷售過程中單增李斯特菌的生長概率及生長模型，由于火腿制作過程中每個階段的時間跨度較長故不考慮單增李斯特菌的延滯期。

風險特征描述：在危害識別、危害特征描述、暴露評估的基礎上，考慮不確定性因素，確定特定人群食用含有單增李斯特菌污染的即食金華火腿切片而患李斯特菌病的概率。

1.2.2 微生物預測模型 預測微生物學模型是風險評估中有用的工具，其中預測性生長/不生長模型多次被用作風險評估工作中，供食品經營者和法規制定者用來獲取有關產品中微生物生長的信息。單增李斯特菌的生長限度作為安全標準而構建的生長/不生長模型，被確證是預測食品中單增李斯特菌生長狀況的良好工具[17]，本研究所涉及的模型及相關參數[3,20,31]如下所示：

其中，Π 是乘積算子；P 是生長概率；Tmin、pHmin、awmin分別是能使單增李斯特菌生長的溫度、pH 和水分活度的下限值，其中Tmin=-0.4 ℃；pHmin=4.4；awmin=0.92；η是一個歸一化因子（η=0.73）；NLAB是乳酸菌的種群密度（CFU/g）；NLm是單增李斯特菌的種群密度（CFU/g）；NcpdLAB是乳酸菌的臨界種群密度（CFU/g），NcpdLAB=108CFU/g。

如果單增李斯特菌有生長的可能性，即當生長概率P≥0.1 時，根據發酵過程中溫度、pH、aw和乳酸菌濃度估算了發酵火腿中單增李斯特菌最大生長速率（μmax），如式（2）[31]。

其中μmaxref是參考條件下的最大生長速率，μmaxref=0.181 lg CFU/（g·h）；Tref、pHref、awref分別為溫度、pH 和水分活度的參考值；其中Tref=20 ℃，pHref=6.0，awref=0.99；Tmin，pHmin，awmin分別是溫度、pH 和水分活度的下限值，Tmin=-0.4 ℃；pHmin=4.4；awmin=0.92；NLAB是乳酸菌的種群密度（CFU/g）；NLm是單增李斯特菌的種群密度（CFU/g）；NcpdLAB是乳酸菌的臨界種群密度（CFU/g），NcpdLAB=108CFU/g。

其中，CLm表示單增李斯特菌的濃度（lg CFU/g），CLm0表示上一加工階段單增李斯特菌的濃度（lg CFU/g），Time 表示加工階段的時間跨度（h），aw表示加工階段產品的水分活度，T 表示加工階段的溫度（℃）。

1.3 數據處理

應用Microsoft Excel 2016 進行數據的統計及風險特征描述，用@Risk 5.7 軟件（Palisade 公司）對模型中參數進行模擬分析。風險評估模型采用拉丁超立方抽樣方法進行10000 次迭代的蒙特卡洛（Monte Carlo）模擬。同時，采用Spearman 相關系數對變量與模型暴露評估結果進行敏感性分析，并據此提出合適的風險管理措施。

單增李斯特菌在生豬肉中和金華火腿生產及銷售過程中的評估模型及參數如下表1。

表1 金華火腿中單增李斯特菌的風險評估模型及參數Table 1 Summary of variables and parameters used in risk assessment model of Listeria monocytogenes in Jinhua ham

2 結果與分析

2.1 危害識別

單增李斯特菌在環境中廣泛存在，可以在設備表面形成生物膜，并在低溫、廣泛的pH、較高的鹽濃度和低aw下具有一定的生存能力[46]。發酵火腿中尤其是即食火腿切片，消費者在購買該產品之后，不會進一步做熱處理，并且可能會存在一定的交叉污染，導致單增李斯特菌數量上升，是人類李斯特菌病的一個潛在來源。2014 年歐盟有2161 宗李斯特菌病確診案例[47]。2011 年至2016 年間我國的19 個省份中共報告了253 例侵襲性李斯特菌病病例，病死率為25.7%[48]。近年來世界范圍內發生了多起有關發酵肉制品的單增李斯特菌病疫情，引起了社會各界廣泛關注。2017～2018 年間南非暴發了有史以來最嚴重的一次單增李斯特菌感染事件，共確診937 例，造成27%的死亡率，暴發來源為即食發酵香腸（polony）[49]。2014 年丹麥因食用發酵香腸和肉卷而導致了15 個死亡病例。2018～2019 年德國因食用受單增李斯特菌污染的血香腸，導致7 人死亡。2020 年世界衛生組織（WHO）和聯合國糧農組織（FAO）對有關單增李斯特菌的風險評估進行了討論，并對單增李斯特菌的分子表征進行了重點聚焦[50]。

2.2 危害特征描述

李斯特菌病的感染癥狀主要表現為輕度發熱，也可導致腦膜炎、中樞神經系統損害和流產。盡管2%～10%的人攜帶有此菌并沒有任何明顯的癥狀，但仍有潛在的風險群體容易感染李斯特菌病，包括孕婦、新生兒、老年人和免疫功能受損的成年人（如艾滋病毒患者）。在孕婦中，即使是無癥狀的李斯特菌病也可以傳播到胎兒，導致死產、敗血癥和新生兒腦膜炎。孕婦在食用受單增李斯特菌污染的食物后患李斯特菌病的概率是普通人群的15～18 倍[2]。侵襲性李斯特菌感染的潛伏期可能長達90 d，這也增加了該菌與食物載體相關聯的難度。目前，國際上一般認為單增李斯特菌的限量標準為2 lg CFU/g[51]。通過即食肉制品建立的指數型劑量反應模型P=1-exp（-r×D）（P 表示嚴重疾病的概率，D 代表單增李斯特菌的攝入數量，r 為單一細菌致病的概率。）來評估攝入即食金華火腿切片而患李斯特菌病的風險概率，其中，健康人群的r=5.34×10-14，易感人群的r=8.39×10-12[45]。

2.3 暴露評估

2.3.1 生豬肉中單增李斯特菌污染情況 通過薈萃分析的方法統計了中國24 個不同地區的新鮮豬肉中單增李斯特菌的流行率，在所分析的4446 個樣本中，有540 個樣本檢出[11]。模擬結果如圖1 所示，其90%的置信區間的污染率變化范圍為-4.78～0.83 lg CFU/g，平均值為-1.90 lg CFU/g。

圖1 生豬肉中單增李斯特菌污染水平分布模擬Fig.1 Fitting distribution of contamination by Listeria monocytogenes in raw pork

2.3.2 金華火腿制作過程中單增李斯特菌的生長及污染情況 根據腌制過程中的特定條件（Tsal、pHsal、awsal），通過上文中生長/不生長模型模擬得到腌制過程中單增李斯特菌的平均生長概率為0.105，腌制時期該菌生長概率的乘積算子模擬數據如圖2 所示。根據生長模型得出腌制結束后火腿中單增李斯特菌的污染水平，90%的置信區間為-5.97～10.5 lg CFU/g，平均值為0.969 lg CFU/g，具體數據如圖4 所示。

圖2 腌制過程中單增李斯特菌生長概率的乘積算子的分布模擬Fig.2 Distribution simulation of the product operator of growth probability of Listeria monocytogenes in curing process

發酵成熟過程中單增李斯特菌的平均生長概率為0，該菌生長概率的乘積算子擬合數據如圖3 所示。根據失活模型進行模擬，發酵成熟后，火腿中單增李斯特菌的平均污染水平為-0.958 lg CFU/g，具體數據如圖4 所示。

圖3 發酵過程中單增李斯特菌生長概率的乘積算子的分布模擬Fig.3 Distribution simulation of the product operator of growth probability of Listeria monocytogenes in fermentation process

圖4 火腿制作過程中單增李斯特菌的污染水平分布模擬Fig.4 Fitting distribution of contamination by Listeria monocytogenes during ham production

2.3.3 零售過程中單增李斯特菌的生長 通過模擬單增李斯特氏菌生長/不生長的概率及生長模型，得出零售時單增李斯特菌的濃度，如圖5 所示結果，90%的置信區間為-9.47～7.05 lg CFU/g，平均值為-2.59 lg CFU/g。

圖5 火腿零售過程中單增李斯特菌的污染水平分布模擬Fig.5 Fitting distribution of contamination by Listeria monocytogenes during ham retail process

2.4 即食金華火腿切片風險特征描述

金華火腿中單增李斯特菌的濃度低于2 lg CFU/g的概率為78.9%，其濃度大于4 lg CFU/g 的概率為15.4%。結合劑量-反應模型，計算了在4 種不同人群每餐因攝入即食火腿切片而患李斯特菌病的概率，詳見表2。考慮到每次食用的份量大小，食用即食金華火腿切片而患該病的風險概率較低。

表2 即食發酵火腿中單增李斯特菌風險預估Table 2 Risk assessment of Listeria monocytogenes in ready-to-eat fermented ham

2.5 敏感性分析

通過敏感性分析評估中各個參數值與最終結果的相關性，可以找到模型中影響最終結果最重要的因素，以此確定風險控制管理的手段和措施。將相關參數一同進行敏感性分析，計算斯皮爾曼等級相關系數，得出各參數的相關系數，結果如圖6。

圖6 敏感性分析Fig.6 Sensitivity analysis

從圖6 中可以得出，金華火腿腌制過程中水分活度對最終產品的單增李斯特菌的污染水平影響最大，其次是發酵成熟過程中的水分活度和生豬肉中單增李斯特菌的初始污染水平。腌制過程中腌制時間、pH 以及發酵成熟時的pH 對金華火腿中單增李斯特菌的污染水平影響效果有限（相關系數絕對值小于0.1）。

3 討論

本研究初步構建了即食金華火腿切片中單增李斯特菌的風險評估模型。根據相關數據對模型的輸入量進行分布擬合，模擬了從生火腿腌制、發酵成熟以及銷售儲藏環節中單增李斯特菌的生長可能性，腌制過程平均生長概率為0.105，發酵過程為不生長，從模擬數據可以看出，在發酵成熟過程中，火腿中單增李斯特菌的生長受到一定程度的抑制，處于失活狀態。此結論與國外研究者的觀測結果一致，單增李斯特菌在生產前接種至生火腿中，經過發酵成熟后的火腿中該菌呈現減少趨勢[52-53]。根據敏感性分析得知，限制該菌生長的主要因素為加工過程中產品的aw。因此，對生產過程中單增李斯特菌采取控制措施時，首要考慮生產工藝中嚴格控制產品的aw以及減少原料肉中單增李斯特菌的濃度，同時開發出既能快速降低產品中的aw又不影響產品品質的新工藝。

FAO 和WHO 報告稱，攝入每份發酵肉制品而患李斯特菌病的平均風險為2.1×10-12。Giovannini等[54]對帕爾馬火腿和圣丹尼爾火腿中單增李斯特菌進行風險評估，結果表明引起食物中毒的平均概率為4.7×10-10。根據本次評估，我們得出健康成年人食用即食金華火腿切片的平均患病概率小于10-15；對于易感人群的平均患病概率小于10-13。食用即食金華火腿切片而患李斯特菌病的風險較低，金華火腿的現代加工工藝對于單增李斯特菌的控制水平可以與國際接軌。

本研究開創性的進行了金華火腿生產及銷售的全過程中單增李斯特菌的暴露評估，并對即食金華火腿切片進行了風險評估，為發酵火腿中食源性致病菌的風險評估提供了參考模型。對于國內其他類型的發酵火腿，加工工藝及原料選擇與金華火腿可能會有差異，導致火腿理化性質存在不同，這也加重了發酵火腿風險評估的難度以及微生物食品安全控制的復雜性，因此需要加強研究人員對發酵火腿中食源性致病菌的重視。微生物本身的特點決定了微生物風險評估的復雜性，模型每一個環節都存在變異性和不確定性。目前我國食品微生物定量風險評估處于快速發展階段，評估過程中如：模型參數的不確定性、加工過程中環境條件的不穩定性、微生物自身的異質性和在食品基質的理化性質不斷變化的過程中微生物抗逆性及活性的改變，導致本次評估模型具有一定的不確定性。數據方面：消費模型中，由于我國對于居民每餐中食品細分品類的膳食量調查較為缺乏，本次研究采用是膳食指南中即食食品的攝入量，以上模型及參數雖能一定程度模擬金華火腿中單增李斯特菌的暴露值，仍無法準確進行替代。此外本評估未考慮到制作過程中及消費者購買產品后可能造成的交叉污染，對評估結果可能會造成一定的影響。

此外國家應加強單增李斯特菌的監管系統，檢測不同食品中該菌的暴露情況，并匯總統計由單增李斯特菌而引起的相關疾病的數據；通過分析不同來源單增李斯特菌的分子分型，使該菌與相關食品或疾病建立起有效聯系，實現精準防控。企業及政府部門要對發酵火腿的生產車間及生產原料進行嚴格的管控和監督；加工設備定期清洗消毒并定期檢測單增李斯特菌的污染狀況；對不符合加工生產的設備要進行及時更換和維修，衛生條件不合格的工廠要進行及時整治，防止制作過程中設備及生產環境對產品造成污染。同時銷售過程中商家要遵守即食肉制品的規章制度，對刀具、稱量工具等設備進行清洗殺菌，避免后期交叉污染。