真空濃縮對河蟹酶解液蟹味揮發性風味物質的影響

符慧靖，李 彥，沈德熊，丁 莉，吳子健，馬儷珍,

（1.天津農學院食品科學與工程學院，天津 300392；2.可可溢香（江蘇）味業有限公司，江蘇興化 225700；3.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134）

河蟹，學名為“中華絨螯蟹”，又稱“大閘蟹”，是中國重要的經濟類淡水養殖產品之一[1]。近年來興化及周邊地區大閘蟹產銷量已達到20 萬噸。興化大閘蟹除了具有江蘇蟹“殼青、肚白、金爪、黃毛”的共性特點外，脂膏豐滿純正、肉質玉白爽嫩、蟹黃晶紅油潤、入口鮮香溢甜是興化大閘蟹典型內在特征。但這樣優質的河蟹只能以最初級的“鮮活”方式販售，而且受養殖季節的限制，蟹多價賤，無法體現應有的高附加值，嚴重制約了養蟹業的發展[2]，特別是對于約占河蟹產量40%的50～100 g 重的小螃蟹、殘蟹、“老頭蟹”等，有效利用率更低[3]。然而，這些低值產物中不僅含有豐富的蛋白質，還富含蝦青素、甲殼素和鈣[4]。將這些低值蟹經過蛋白酶作用形成富含鮮味氨基酸的酶解液，可用于制備水產調味（基料）品[5]。隨著科學技術的進步，新型天然海鮮調味品已成為當前水產品開發熱點。陳啟航等[6]以金槍魚蒸煮液為原料，經過酶解調配得到了金槍魚調味汁；耿瑞婷[7]以扇貝加工副產物為原料，經酶解工藝制得了高品質的海鮮調味汁；劉素磊[8]以南美白對蝦蝦頭為原料，經酶解調配研制出一種蝦味濃郁、營養豐富的蝦調味汁。

本試驗前期以殘肢、斷肢河蟹為原料，經高壓浸提、風味蛋白酶酶解，得到一種蟹味濃郁的河蟹酶解液。蟹味是人們非常喜歡的一種風味，是由其風味前體物質在加熱或酶催化的作用下轉化而來。形成蟹味的揮發性風味物質種類較多，主要包括各種醛類、酮類、醇類、烴類、酯類、呋喃類等[9]。在后續研究中發現，將蟹味濃郁的酶解液再進行熱處理時，因為受熱作用而使蟹味發生揮發，導致熱加工后的產品蟹味明顯降低。這一現象對于后續酶解液的進一步加工會帶來不利影響。真空濃縮可以很好地保留原料的營養成分和香氣，是一種很好的加工手段[10-13]。因此，本試驗采用電子鼻、頂空-固相微萃取和氣相色譜-質譜聯用技術（HS-SPME-GC-MS）探究真空濃縮對河蟹酶解液蟹味揮發的影響，為后續河蟹酶解液加工利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低值河蟹 可可溢香（江蘇）味業有限公司；風味蛋白酶（36000 U/g） 天津諾奧酶生產力促進有限公司；小蘇打 上海楓未實業有限公司；冰乙酸 廣州康本生物科技有限公司。

SX-500 高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY 有限公司；Agilent7890A/5975C 氣相質譜儀 美國Agilent公司；HERACLESII 快速電子氣味分析儀 法國ALpha Mos 公司；65 μm PDMS/DVB 萃取頭 美國Supelco 公司；20 mL 頂空進樣瓶 多文醫療器材有限公司；微量進樣針10 mL 瑞士Hamilton 公司；DLK-5003 旋轉蒸發儀 寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 河蟹高壓浸提液（High pressure extract of river crab，HPEC）的制備 根據本實驗室前期研究方法制備：將清洗后的河蟹放入沸水中燙漂3 min 至外殼變紅，取出瀝干水分后用絞肉機絞成蟹泥，將蟹泥與水按質量比1:4 裝入錐形瓶中，121 ℃下高壓浸提2 h后得到HPEC。

1.2.2 河蟹酶解液（River crab enzymolysis liquid，RCEL）的制備 根據本實驗室前期研究方法制備：將上述得到的HPEC，調節pH 至7.0，加入0.25%（質量濃度）的風味蛋白酶，攪拌均勻后在50 ℃溫度條件下酶解2 h，沸水浴滅酶10 min，過濾得到RCEL。

1.2.3 真空濃縮單因素實驗設計 影響RCEL 真空濃縮后蟹味揮發程度的因素主要考查真空濃縮溫度和真空濃縮體積，真空度為0.125 MPa。

1.2.3.1 真空濃縮溫度對RCEL 蟹味揮發程度的影響 取1.2.2 制備的RCEL（每組100 mL）放入真空濃縮瓶中，按試驗設計選擇溫度，固定轉速為60 r/min，固定真空濃縮體積（樣品濃縮至原體積的1/2）時，停止旋轉蒸發過程，得到酶解液濃縮液（Concentration of the enzymatic solution，CES），同時收集蒸餾出的水分（Evaporated water，EW）。試驗過程中設置真空濃縮的溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃，這樣就可以得到6 組CES 和6 組EW，分別記為20CES、30CES、40CES、50CES、60CES、70CES；20EW、30EW、40EW、50EW、60EW、70EW。將所得到的12 份樣品（6 組CES 和6 組EW）和RCEL 進行電子鼻PCA 分析。

根據電子鼻（PCA）分析結果，試驗取HPEC、RCEL、50CES、50EW 樣品，采用頂空-固相微萃取和氣相色譜-質譜聯用技術（HS-SPME-GC-MS）進一步定性定量分析，以探究RCEL 的主要揮發性風味物質。

1.2.3.2 真空濃縮體積對RCEL 蟹味揮發程度的影響 取1.2.2 制備的RCEL（每組100 mL）放入真空濃縮瓶中，固定轉速為60 r/min，真空濃縮溫度為50 ℃，當真空濃縮體積分別濃縮至原體積的3/4、1/2、1/4 時，停止旋轉蒸發過程，得到CES，同時收集EW，分別記為3/4CES、1/2CES、1/4CES；3/4EW、1/2EW、1/4EW。最后將3/4CES、1/2CES、1/4CES；3/4EW、1/2EW、1/4EW 以及RCEL 進行電子鼻PCA分析。

1.2.4 指標測定方法1.2.4.1 HeraclesII 超快速氣相電子鼻分析 取5 mL樣品于20 mL 頂空樣品瓶中，將樣品放置于50 ℃水浴鍋中水浴24 min，用10 mL 進樣針吸取頂空瓶中5 mL 氣體，手動進樣，注射入HERACLESII 快速電子氣味分析儀進樣口中。試驗參數：進樣口溫度200 ℃，持續進樣時間10 s，捕集阱溫度40 ℃，捕集井分流速率10 mL/min，閥溫度250 ℃，柱溫的程序升溫方式0.5 ℃/min 升到100 ℃，1 ℃/min，100～200 ℃，采集時間140 s。

1.2.4.2 香氣感官評定 隨機選擇10 名經過感官評定培訓的人員，對制備的HPEC、RCEL、50CES 和50EW 蟹味強弱進行評定，蟹味濃，取7～10 分；蟹味稍濃，取4～7 分；蟹味較淡，取0～4 分。

1.2.4.3 揮發性風味物質的檢測 分別取待測樣品于20 mL 的頂空瓶中，加入5 mL 飽和NaCl 溶液和1 μL 的2-甲基-3-庚酮（0.08 μg/μL），將老化的萃取頭插入樣品瓶，恒溫60 ℃吸附45 min 后拔出，萃取頭在GC 進樣口（240 ℃）下解吸附4 min。

GC 條件：DB-WAX 毛細管色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；載氣（He）流速：1 mL/min，不分流進樣；起始溫度45 ℃，2 min，后以6 ℃/min 速率升到230 ℃，保持5 min；運行時間：38 min。

MS 條件：離子源溫度230 ℃，界面溫度250 ℃，MS 四極桿溫度150 ℃，溶劑延遲3 min，質量掃描范圍m/z 30～500。

風味化合物相對于2-甲基-3-庚酮的含量，計算公式如下：

式中，C：測定揮發性化合物濃度，μg/L；AX：測定揮發性化合物的峰面積，AU·min；C0：內標物的濃度，0.08 μg/μL；A0：內標物的峰面積，AU·min；V：內標物的進樣量，μL；v：測定樣品的體積，mL。

1.3 數據處理

采用電子鼻自帶的軟件系統進行PCA 分析，采用Excel 軟件進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 不同真空濃縮溫度下RCEL 蟹味揮發程度的電子鼻主成分分析

真空濃縮溫度對RCEL 蟹味揮發程度的電子鼻PCA 分析結果如圖1 所示，圖1A 和圖1B 分別代表在不同真空濃縮溫度下濃縮得到的各組酶解液（CES）和蒸餾出來的水分（EW）的PCA 分析。由圖1可知，圖1A 和圖1B 的第一主成分的方差貢獻率分別為88.535%和99.967%，第二主成分的方差貢獻率分別為5.041%和0.021%，兩者累計的總貢獻率為93.576%和99.988%，表明該圖譜能夠真實地反映出所測樣品中氣味數據的完整性。在PCA 圖譜中，樣品之間的相對距離越近，說明樣品的整體氣味越接近，反之差異則越大。從圖1 可以看出，在不同真空濃縮溫度下濃縮得到的酶解液（CES）和蒸餾出來的水分（EW）與河蟹酶解液原液（RCEL）之間的相對距離均較遠，說明RCEL 只要經過真空濃縮，無論真空濃縮的溫度如何變化，其風味均發生了顯著變化。由圖1A 可知，隨著真空濃縮溫度的升高，各組之間距離發生不同程度的變化，除20CES 之外，30CES、40CES、50CES、60CES 和70CES 在第一主成分上的相對距離非常近。從第二主成分上看20CES、30CES、40CES 之間距離較大，而50CES、60CES、70CES 之間的距離較近，且在同一象限中。第一主成分的貢獻率遠大于第二主成分，說明樣品在橫坐標上距離越大，差異性也越大。由圖1B 可知，EW 整體上與RCEL 和HPEC 之間相對距離較遠，但除20EW 之外，30EW、40EW、50EW、60EW 和70EW 基本都重疊在一起，這說明不管真空濃縮溫度如何變化，蒸餾出來的水中（EW）的風味基本一致，與RCEL 和HPEC 的風味完全不同。由此可以看出，結合第一主成分和第二主成分的分析結果，除20 ℃外，其它6 個溫度下的真空濃縮樣品在第一主成分的PCA 幾乎重疊在一起，而在第二主成分上則是50CES、60CES、70CES、50EW、60EW、70EW樣品也重疊在一起，但它們均與RCEL 和HPEC 距離較遠。可見不同真空濃縮的溫度下各樣品的變化是一致的。所以，根據實際生產中常應用的真空濃縮溫度，選擇50 ℃下真空濃縮的50CES 和50EW 樣品與RCEL 和HPEC 樣品進行HS-SPME-GC-MS分析，以了解發生變化，如丟失使得蟹味強度降低的揮發性風味物質。

圖1 不同真空濃縮溫度下RCEL 蟹味揮發程度的電子鼻PCA 分析圖Fig.1 Electronic nose PCA analysis chart of volatilization degree of RCEL crab flavor at different vacuum concentration temperatures

2.2 不同真空濃縮體積下RCEL 蟹味揮發程度的電子鼻主成分分析

真空濃縮不同體積下RCEL 蟹味揮發程度的電子鼻PCA 分析結果如圖2 所示，圖2A 和圖2B 分別代表在不同真空濃縮體積下濃縮得到的各組酶解液（CES）和蒸餾出來的水分（EW）的PCA 分析。由圖2可知，圖2A 和圖2B 的第一主成分的方差貢獻率分別為91.643%和65.667%，第二主成分的方差貢獻率分別為4.488%和20.058%，兩者累計的總貢獻率為96.131%和85.725%。從圖2 可以看出，在不同真空濃縮體積下濃縮得到的酶解液（CES）和蒸餾出來的水分（EW）與河蟹酶解液原液（RCEL）之間的相對距離均較遠，但3/4CES、2/4CES、1/4CES 之間距離很近，3/4EW、2/4EW、1/4EW 之間的距離也很近，且基本處于同一象限中，說明雖然隨著真空濃縮體積的變化，RCEL 的蟹味也發生了變化，但與真空濃縮體積之間關系并不密切。由圖2A 和圖2B 可知，3/4CES、2/4CES、1/4CES 之間和3/4EW、1/2EW、1/4EW 之間從第一主成分和第二主成分上分析得出，三者的位置基本一致，這也說明雖然RCEL 的蟹味發生了變化，但主要是與真空濃縮溫度有關，與真空濃縮體積之間的關系并不密切。

圖2 不同真空濃縮體積下RCEL 蟹味揮發程度的電子鼻PCA 分析圖Fig.2 Electronic nose PCA analysis chart of volatilization degree of RCEL crab flavor under different vacuum concentration volumes

2.3 香氣感官評定

圖3 為HPEC、RCEL、50CES 及50EW 四組樣品蟹味強弱的感官評定，由圖3 可知，RCEL 的蟹味最強，這是由于風味蛋白酶的酶解作用，產生了更多的揮發性風味物質，使得RCEL 的蟹味更加濃郁；HPEC 和50CES 兩者的蟹味強弱基本一致；50EW的蟹味最弱，可能是因為RCEL 在真空濃縮50 ℃條件下，雖然失去部分揮發性風味物質，但是并未被蒸發出的水分吸收。

圖3 HPEC、RCEL、50CES 及50EW 蟹味強弱感官評定Fig.3 HPEC, RCEL, 50CES and 50EW crab taste strong and weak sensory evaluation

2.4 HPEC、RCEL、50CES、50EW 樣品揮發性風味物質GC-MS 分析

由圖1 的試驗說明RCEL 經過真空濃縮，其風味會發生顯著的變化，為進一步了解具體揮發性風味物質的變化情況，試驗分析了HPEC、RCEL、50CES、50EW 樣品揮發性風味物質的GC-MS 變化，結果見表1 所示。由表1 可以看出，共有8 大類36 種揮發性風味物質被檢測出，主要有醛類5 種、醇類2 種、酯類4 種、酮類5 種、烴類6 種、酚類2 種、醚類1 種、雜環類（包括喹啉、吡嗪、吲哚）11 種。HPEC、RCEL、50CES、50EW 樣品中的揮發性風味物質含量大小關系依次為RCEL＞50CES＞HPEC＞50EW，其值分別為13.9753、8.3862、6.2235、1.0855 μg/L，由此說明，河蟹高壓浸提液（HPEC）蟹味并不濃郁，但經酶解后產生了更多的揮發性風味物質[5]，使河蟹酶解液（RCEL）具有濃郁的蟹味，但RCEL 在真空濃縮溫度為50 ℃的條件下濃縮至其體積的一半時，其揮發性風味物質有明顯的減少，即使在真空濃縮條件下對RCEL 中蟹味的揮發也會造成很大程度的影響。

表1 HPEC、RCEL、50CES、50EW 樣品揮發性風味物質的含量Table 1 Contents of volatile flavor substances in HPEC, RCEL, 50CES and 50EW samples

2.4.1 醛類化合物分析 醛類一般由脂肪酸降解、氧化和氨基酸Strecker 反應產生的[14-15]，其氣味閾值相對較低，可以提供花香和油脂香，對河蟹的風味形成有重要作用[16]，可以為河蟹增加鮮香。例如，苯甲醛是由氨基酸的斯特勒克反應生成的，與氨基酸的降解有關[17]，提供令人愉快的香氣，是河蟹中的一種重要風味物質[18]，從表1 中可以看到HPEC 和RCEL中都含有苯甲醛，且HPEC 中苯甲醛含量最高為3.0143 μg/L，這可能是因為HPEC 經過121 ℃的高溫高壓處理。但經過真空濃縮處理后，苯甲醛含量降低為零。壬醛通常會產生一些令人不愉快、辛辣的刺激性氣味[19]，壬醛僅在HPEC 中存在且含量較低（0.0573 μg/L）。在RCEL 種共檢測到4 種醛類物質，除苯甲醛外，還有大茴香醛、3-乙基苯甲醛和2,4,5-三甲基苯甲醛，這3 種醛類物質均未在HPEC、50CES 和50EW 中檢出。由此可以推斷，構成RCEL 蟹味組成的重要醛類成分也許與苯甲醛、大茴香醛、3-乙基苯甲醛和2,4,5-三甲基苯甲醛及其比例組成有關。

2.4.2 醇類化合物分析 醇類大多來源于脂肪的氧化和羰基化合物的還原[20]，一般醇類化合物的閾值較高，所以對食品的風味貢獻較小[21]，除非以高濃度或不飽和形式存在[22]。此次共檢測出2 種醇類，分別為2-乙基己醇和1,3-辛二醇。其中2-乙基己醇在HPEC、RCEL、50CES 和50EW 中均檢測到，其含量則是RCEL＞50CES＞HPEC＞50EW，2-乙基己醇在RCEL 中含量最高（2.0247 μg/L），經過真空濃縮后，50CES 含量幾乎降低一半（1.1034 μg/L），且50EW 中含有0.2931 μg/L。這說明河蟹高壓浸提液（HPEC）經過蛋白酶作用后得到河蟹酶解液（RCEL），代表其蟹味的醇類物質主要含有2-乙基己醇和少量的1,3-辛二醇（0.0988 μg/L），而2-乙基己醇物質容易揮發，50 ℃條件下真空濃縮會丟失一半的量。

2.4.3 酯類化合物分析 酯類被認為是發酵或脂質代謝生成的羧酸和醇的酯化作用的產物[23]，可以賦予食品一種香甜的果香味[24]，癸酸乙酯呈葡萄味[25]。在HPEC 中共檢測到了2 種酯類，分別為環己基異硫氰酸脂和癸酸乙酯。RCEL 中只檢測到1 種獨有的酯類（N-苯甲酰基甘氨酸甲酯），且在HPEC、50CES 和50EW 中均未檢測到，這可能是由于加入風味蛋白酶酶解作用產生的，可以賦予河蟹酶解液特殊的風味，但經過50 ℃的真空濃縮使其揮發，由此可以推斷，N-苯甲酰基甘氨酸甲酯有可能是構成河蟹酶解液的濃郁蟹味的重要成分之一。

2.4.4 酮類化合物分析 酮類一般是由不飽和脂肪酸的氧化或氨基酸分解產生的[26]，酮類貢獻于蟹等甲殼類水產品甜的花香和果香風味，并且有較低的閾值。C3～C17 的甲基酮類是碳鏈烴β-氧化及脫羧基作用后生成的，具有獨特的果香和清香，并且花香味也隨著碳鏈的延長而逐漸增強[16]。表1 中RCEL、50CES、50EW 中都檢測到了2,5-二甲基-3-己酮，并且經過真空濃縮后50CES 樣品中2,5-二甲基-3-己酮的含量比RCEL 有所提高（0.7654→2.1333 μg/L），說明這類物質不容易揮發，因為濃縮的原因導致其含量有所提高。RCEL 中除了檢測到2,5-二甲基-3-己酮之外，還檢測到異丁酰基丙酮和苯亞甲基苯乙酮2 種酮類化合物，并且這2 種酮類化合物在HPEC、50CES 和50EW 中均未檢測到，試驗說明，這兩類物質非常容易揮發，所以推測異丁酰基丙酮和苯亞甲基苯乙酮有可能對構成RCEL 的蟹味有重要作用。

2.4.5 烴類化合物 烴類化合物可能是通過烷基自由基的脂質自氧化過程[27]或類胡蘿卜素分解生成的，通常具有較高的芳香閾值，因此烷烴類對食品整體的香氣貢獻很小[28]。但一些支鏈烷烴，例如2,4,10,14-四甲基-十五烷在報道賦予小龍蝦及加工廢棄物一種清香甜香[29]。表1 的RCEL 中檢測到2,2-二甲基十四烷、十一烷、9-辛基-二十烷和正二十烷，含量分別為2.4444、0.2469、1.1111 和1.1852 μg/L，而在50CES 和50EW 均未檢測出。吉思茹[30]的報道中發現十一烷對蒸制中華絨螯蟹性腺的香氣有重要的貢獻作用。在RCEL 中所檢測出的烴類化合物相對質量濃度占整體揮發性風味物質的相對質量濃度較高（45.2827%）。由此可以推斷，這幾種烴類物質有可能對河蟹酶解液的蟹味貢獻較大。

2.4.6 酚類化合物 簡單的酚生成一般是通過2 種途徑，即木質素熱降解和酚羧酸脫羧作用，所以酚類提供的是木香、焦香和煙熏香氣[31]。此次共檢測到2 種酚類化合物，HPEC 中未檢測到酚類化合物。在RCEL 中檢測到的2-烯丙基-4-甲基苯酚和2,5-二叔丁基對苯二酚，含量分別為0.1975 和0.1235 μg/L，其中2,5-二叔丁基對苯二酚成分，50CES 的含量有所提高（0.1235→0.9195 μg/L），50EW 中仍能少量檢出（0.0326 μg/L）。由此試驗說明，2-烯丙基-4-甲基苯酚與2,5-二叔丁基對苯二酚成分比較，前者容易揮發，而后者揮發性較弱。

2.4.7 醚類化合物分析 醚是醇或酚的羥基中的氫被烴基取代的產物，醚類化合物本身具有特殊的風味[32]。在此次檢測中，只在RCEL 中檢測到了4-烯丙基苯甲醚，含量為2.1975 μg/L，占整體揮發性風味物質含量的15.7242%，這可能是RCEL 與HPEC、50CES 及50EW 具有風味差異的原因之一。

2.4.8 雜環類化合物分析 主要檢測到的雜環類化合物為吡嗪、吲哚和喹啉。雜環類化合物是美拉德反應產物，在食品中通常對蒸煮和燒烤等風味有貢獻[33]。其中吡嗪類化合物是美拉德反應和熱解反應產物，通過斯特勒克反應生成，一般具有烤香和堅果香，風味閾值較低[34]。在HPEC、RCEL 和50CES 中均檢測到的2,5-二甲基吡嗪呈現出較強的果仁香氣，并且經過真空濃縮后50CES 中的2,5-二甲基吡嗪含量有所提高，說明2,5-二甲基吡嗪物質相對不容易揮發。在吉思茹[30]的報道中，2,5-二甲基吡嗪對蒸制中華絨螯蟹的谷物味具有關鍵性貢獻。吲哚類化合物具有極強的揮發性和濃烈的焦油氣味，但濃度低于0.2 μg/mL 時具有令人相當愉快的氣味[35]，是構成蟹肉風味成分的物質之一。

3 結論

電子鼻試驗結果表明：相較于真空濃縮體積來說，真空濃縮溫度對蟹味的變化影響顯著。GCMS 分析結果表明，4 組樣品共有8 大類36 種揮發性風味物質被檢出，主要有醛類5 種、醇類2 種、酯類4 種、酮類5 種、烴類6 種、酚類2 種、醚類1 種、雜環類（包括喹啉、吡嗪、吲哚）11 種等。4 組樣品中的揮發性風味物質的含量大小關系為RCEL＞50CES＞HPEC＞50EW，其值分別為13.9753、8.3862、6.2235、1.0855 μg/L，RCEL 經過50 ℃的真空濃縮后，風味物質含量明顯降低。根據GC-MS 結果分析發現，形成蟹味的物質可能是由醛類（苯甲醛、大茴香醛、3-乙基苯甲醛和2,4,5-三甲基苯甲醛）、酯類（N-苯甲酰基甘氨酸甲酯）、酮類（丁酰基丙酮和苯亞甲基苯乙酮）、烴類（2,2-二甲基十四烷、十一烷、9-辛基-二十烷和正二十烷）、醚類（4-烯丙基苯甲醚）和雜環類（2,5-二甲基吡嗪）等構成的。