PMA-qPCR 聯用快速檢測蘋果中擴展青霉活菌

陽 瑾，丁 宇，于呂健，范盈盈，劉峰娟，趙雪祺，焦子偉 ，王 成,

（1.伊犁師范大學生物與地理科學學院，新疆伊犁 835000；2.新疆農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，農業農村部荒漠綠洲生態區特色農產品功能營養與健康重點實驗室（部省共建），農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室（烏魯木齊），新疆農產品質量安全實驗室，新疆烏魯木齊 830091；3.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052）

以擴展青霉（Penicillium expansum）為主的植物病原菌感染導致每年都會有大量的水果被侵蝕腐爛，造成大量的經濟損失，大概有25%的農產品會受到真菌毒素的污染，部分國家受污染比例可達到農產品產量的一半及以上[1]。擴展青霉產生的展青霉素具有腸、肝、腎、免疫、基因毒性等[2]，對多種人體器官造成傷害，被國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）認定為“第三類可疑致癌物”[3]。早年就有研究者發現切除腐爛部位并不能完全去除展青霉素，擴展青霉和毒素會向未腐爛的組織遷移，并且未腐爛組織中的毒素含量可能會超過最低限量[4]，展青霉素遷移遠慢于擴展青霉菌落的遷移[5]。根據毒素含量與菌落濃度之間的對應關系可以通過菌落濃度來反映毒素含量[6]。近年來越來越多研究者開始利用qPCR 技術對擴展青霉進行檢測從而研究毒素含量。Tannous 等[7]創建了利用qPCR 檢測蘋果中擴展青霉菌DNA 從而估計展青霉素含量的方法。Rodríguez 等[8]也利用SYBR Green和TaqMan 兩種方法進行qPCR 技術檢測展青霉素含量。從控制展青霉素污染角度來說對擴展青霉菌活菌檢測具有重要意義。但普通的qPCR 技術并不能分辨出活菌和死菌的區別，極易出現假陽性結果。

反壟斷法中縱向壟斷協議的解釋學澄清——兼評全國首例縱向壟斷協議行政訴訟案...........................................................................................吳佩乘 11.44

PMA 和疊氮溴化乙錠（Ethidium Monoazide Bromide，EMA）都屬于對DNA 有著高親和力的光敏DNA 染料[9]。PMA 可以選擇性穿過死菌破損細胞膜，在鎢燈強光照射下，PMA 的疊氮基團生成的nitrene 基，在結合部位與DNA 中的碳氫氧鍵結合生成穩共價氮碳鍵，從而抑制了死菌DNA 擴增，qPCR檢測中假陽性信號的產生[10]。PMA 比EMA 多一個正點荷，更加溫和、更難進入活菌細胞膜[11]，近年來研究者更傾向用PMA 結合qPCR 技術研究活菌檢測。目前該技術已廣泛應用于藥物活性檢測[12]、醫源及食源性病原菌檢測[13-14]、污水處理檢測[15]、植物病原菌檢測[16]等。對于利用PMA-qPCR 這一技術對植物病原菌進行研究，已應用于青枯菌（Pseudomonas solanacearum）[11]、十字花科黑斑病菌（Pseudomonas syringaepv.maculicola）[17]、梨火疫病菌（Erwinia amylovory）[9]、丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）[18]的活菌檢測等，但該技術對擴展青霉菌活菌檢測及相關的研究較少。

因此，為了深入研究擴展青霉菌活菌在蘋果上的遷移規律，本文將以產自新疆阿克蘇的紅富士蘋果為材料，人工接種擴展青霉進行常溫培養，改進Crespo-Sempere 等[19]的PMA 處理方法，利用PMAqPCR 技術快速、準確地對擴展青霉活菌數進行計數，為蘋果中擴展青霉的防控提供了理論依據，為食品中擴展青霉活菌檢測提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

擴展青霉菌ACCC 31688 中國農業微生物菌種保藏管理中心；紅富士蘋果（Malus domesticaBorkh.CV.Red Fuji） 同一批次的成熟的大小相近、無創傷，新疆烏魯木齊市；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基 北京陸橋技術股份有限公司；PMA 染料 北京百瑞極生物科技有限公司；真菌DNA 提取試劑盒、CTAB 緩沖液、蛋白酶K 溶液、RNase A 溶液、DNA 提取液、核酸提取液 北京索萊寶公司；2×Taq PCR MasterMixⅡ、2×SuperReal PreMix Plus 天根生化科技（北京）有限公司；異丙醇 分析醇，天津永晟精細化工有限公司。

取10 mL 稀釋好的孢子懸浮液放入水浴鍋，99.9 ℃水浴30 min 進行熱滅活處理。取1 mL 經熱滅活處理的孢子懸浮液涂布于PDA 培養基28 ℃培養72 h，驗證滅活效果。PDA 培養基上無菌生長則認為已完全滅活，可用于后續實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 霉菌孢子懸浮液配制 無菌條件下，向已培養7 d 的擴展青霉菌的PDA 培養基中加入10 mL無菌水，利用無菌涂布器刮下真菌孢子，四層紗布過濾，將濾液轉至50 mL 錐形瓶中，旋渦30 s，使孢子分布均勻后加入無菌水進行梯度稀釋。采用血球計數板法計算孢子濃度，最終將孢子懸浮液稀釋至4.0×107CFU/mL。

生物安全柜ESCO 生命科學集團；霉菌培養箱上海精宏實驗設備有限公司；Thermo Fisher Scientific 離心機 德國賀利氏公司；PCR 儀（SureCycle 8800） 安捷倫科技有限公司；實時熒光定量PCR儀（LightCycler? 96） 德國羅氏診斷有限公司。

2.2.2.1 藥劑拌種該病除選用上述技術原則外，還可用種子100kg，營養液5kg，溶入58%甲霜靈可濕性粉劑300g，（營養液可以用含微量元素葉面肥尿素、磷酸二氫鉀各100g代替）對種子均勻噴灑翻拌，悶種3h～4h，即可播種。有預防霜霉病和壯苗的雙重作用。

1.2.2 霉菌及蘋果樣品DNA 提取

1.2.2.1 霉菌DNA 提取 取500 μL 孢子懸浮液，12000 r/min 條件下離心2 min，棄上清，沉淀按照真菌DNA 提取試劑盒說明書提取DNA。檢測前放入-20 ℃保存。

1.2.2.2 蘋果樣品DNA 提取 參考Crespo-Sempere 等[19]的方法，根據樣品略有改動。取5 g 樣品（受擴展青霉侵染的蘋果病斑）裝入50 mL 試管，加入5 mL 的磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）。勻質3 min，4 層紗布過濾。將濾液轉移至離心管中，12000 r/min 離心10 min，棄去上清。沉淀重懸于1 mL PBS 緩沖液后進行PMA 處理。PMA 處理后，12000 r/min 離心2 min，棄去上清。

在開展施工安裝及施工后的模板拆除工作前，要讓工作人員參與安全技術交底中，申明施工操作中的各種規范，如要求工人持證件上崗，高空作業時做好安全措施，在危險區域設置安全標示等。

1.2.3.3 曝光時間優化 分別添加PMA 溶液于500 μL 濃度為4.0×107CFU/mL 的熱滅活孢子懸浮液，充分混勻，獲得PMA 最終濃度為10 μg/mL，隨后置于黑暗處孵育5 min，設置曝光時間分別為0、5、10、15 和20 min。之后步驟按1.2.3.1 進行。

目前高師院校創新創業的教師多由本校教師擔任，絕大多數教師不具備創業能力，創新意識也不夠強，對創新創業的理解有待進一步深化，他們在創新創業課程教學中，主要偏重于創業理論的闡述、創業案例的分析，而未將注意力集中在師范生創新意識的培育上。此外，絕大多數高師院校教師認為，師范生的創新意識的培育是創新創業課程教師的任務。殊不知每門課程的教學都有責任去培育師范生的創新意識。全體高師院校的教師要轉變觀念，適應新時代創新創業發展的需求，除了要傳授師范生的知識、訓練師范生的技能、培育師范生的職業情懷外，還要在課程教學中注重滲透培育師范生的創新意識。

1.2.3 PMA 處理條件優化

1.2.3.1 PMA 濃度優化 稱取1 mg PMA 加入1 mL的無菌水，制備濃度為2 mmol/L 的PMA 溶液，4 ℃儲存。取500 μL 濃度為4.0×107CFU/mL 的熱滅活孢子懸浮液，加入不同體積的PMA 溶液，使最終每管的PMA 濃度分別為0、5、10、15、20 和 25 μg/mL。充分混勻后黑暗孵育20 min，然后將試管放置冰上在鎢燈強光下照射10 min。12000 r/min 離心 2 min，棄上清，取沉淀提取孢子DNA，具體步驟同1.2.2.1。所提DNA 按照1.2.5 中的反應體系及條件進行qPCR 檢測，獲得循環閾值（Cycle Threshold，Ct 值），根據Ct 值變化來研究能夠抑制死菌DNA 擴增的PMA 最小濃度。同樣方法處理活孢子懸浮液，研究不影響活菌DNA 擴增的PMA 最大濃度。

(2)第二個階段：從“校內實踐環境”到“企業財務工作環境”。新經濟環境對會計業務影響較大，如營改增等政策變化、新會計政策制訂和執行都會影響到《中級財務會計》課程內容。所以要了解企業最新的經濟業務，使校內實踐環境與企業財務工作環境結合更為密切。通過“引進來”和“走出去”的方式，使企業專家、學校任課老師在實踐環節得到有效融合，也寒暑假社會實踐、頂崗實習等途徑來檢驗校內實踐部分有效性，對實際崗位操作中出現的新趨勢、新內容保持同步更新，防止校內實踐教學內容過于陳舊。

1.2.3.2 黑暗孵育時間優化 分別添加PMA 溶液于500 μL 濃度為4.0×107CFU/mL 的熱滅活孢子懸浮液，充分混勻，使PMA 最終濃度為10 μg/mL，隨后置于黑暗處孵育。設置孵育時間分別為5、10、15、20 和25 min，黑暗孵育后放置冰上在鎢燈下照射10 min，之后步驟按1.2.3.1 進行。

參考Tannous 等[7]的方法，根據實驗條件略做修改，提取沉淀DNA。將沉淀重懸于經95 ℃預熱100 μL 無菌水中并在冰上放置10 min。加入500 μL CTAB 緩沖液，10 μL 蛋白酶K 溶液，65 ℃水浴1 h，4 ℃條件下13000 r/min 離心10 min。吸取上清，加等體積的DNA 提取液（酚/氯仿/異戊醇25:24:1）靜置5 min，4 ℃條件下1000 r/min 離心20 min。吸取上清，加入10 μL RNase A 溶液（10 mg/mL），37 ℃恒溫水浴1 h。水浴后，加等體積的核酸提取液（氯仿/異戊醇24:1），4 ℃條件下13000 r/min 離心5 min。取上清液用等體積的異丙醇-20 ℃沉淀過夜。4 ℃條件下13000 r/min 離心20 min，棄去上清，沉淀中加入500 μL 的75%乙醇進行洗脫，12000 r/min 離心5 min，重復洗脫2 次。棄上清，加入室溫干燥5～10 min，加入30 μL 的dd H2O，-20 ℃保存。

1.2.4 引物選擇及驗證 實驗所用的4 種引物均參考已發表文獻，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，詳情見表1。

1.2.6 標準曲線的制作 參考Crespo-Sempere 等[19]的標準曲線的制作方法，略有改動。挑選無病害的蘋果，用清水清洗，75%酒精消毒，晾干后打漿。取5 g樣品裝入50 mL 試管，加入5 mL 的PBS 緩沖液。配制106CFU/mL 的擴展青霉孢子懸浮液，加入無菌水梯度稀釋至濃度為105、104、103CFU/mL。加入孢子懸浮液，使樣品中孢子最終濃度達到105、104、103、102CFU/mL。按照1.2.2.2 提取DNA，通過qPCR測定對應的Ct 值，反應體系參照1.2.5，重復3 次。建立菌落濃度（log10CFU/mL）與Ct 值之間的線性關系，并通過公式E=10-1/s-1 計算擴增效率，其中s 為標準曲線的斜率。

1.2.7 人工染菌樣品活菌檢測 用清水清洗蘋果晾干后，用75%酒精擦拭表面。用滅菌過的移液槍頭在每個蘋果赤道部位對稱刺2 個直徑2～3 mm、深度5～7 mm 的傷口，每個傷口接種10 μL 孢子懸浮液（1.0×105CFU/mL），待孢子懸浮液晾干后，放入經紫外滅菌的紙箱中。在室溫條件下培養3 d 后，以病斑為中心，分別取外擴0.5、1、2 cm 處蘋果組織為樣品（如圖1 所示）。取1 g 樣品參照尉冬梅等[23]的方法進行平板菌落計數。

以所提的擴展青霉菌DNA 作為模板，各引物經PCR 擴增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳法驗證擴增產物的大小及引物的特異性，PCR 反應體系詳情見表2。PCR 總共35 個循環，每個循環包括94 ℃預熱 4 min，94 ℃變性30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃最后延伸10 min。

預制裝配式混凝土結構有多種形式，如剪力墻結構，框架結構，框架剪力墻結構和部分框架剪力墻結構。由于預制裝配式結構的預制構件全部通過連接節點連接，所以混凝土結構在大范圍內尚未廣泛使用。與傳統建筑方法相比，預制建筑物具有更多的連接界面和接縫，而裝配式混凝土結構中的節點是裝配式建筑的薄弱環節，在連接節點的處理問題上，國內的技術手段目前并不是很成熟。但裝配式建筑結構在環保、節能和施工上與現澆相比優點比較突出。

普通工頻電機在正常運行時產生的軸電流大多是由于磁路不對稱，主要表現為低頻循環電流。變頻電機會額外增加軸電流的來源，主要是受變頻器共模電壓的影響，表現為高頻循環電流、容性共模電流及放電電流、軸與機座電位差產生的脈沖式容性電流。在大型電機設計時，需盡量減少磁路的不對稱，從源頭上遏制軸電流的產生。同時，當機組中含有電機尤其是變頻電機時，需要特別注意整個機組對軸電流的預防措施，這樣才能保證機組平穩、可靠、安全運行。

1.2.5 擴展青霉菌熒光定量PCR 實驗 選取實驗1.2.4 選擇出特異性最好的引物按照表3 中的體系用實時熒光定量PCR 儀進行聚合酶鏈式反應。熱循環條件為：95 ℃作用3 min，40 個循環95 ℃作用20 s，65 ℃作用20 s（在此期間測量熒光），57～95 ℃繪制熔解曲線，升溫速率為1 ℃/min。

所有實驗均重復3 次，數據結果以平均值±標準差表示。利用OriginPro 2019 作圖，Excel 2016 進行數據分析，IBM SPSS Statistics 23 軟件進行單因素ANOVA 檢驗及獨立樣本t檢驗分析差異顯著性。

圖1 蘋果取樣示意圖Fig.1 Sampling diagram of apple

冰浴研磨后，稱取5g 樣品裝入50 mL 試管，加入5 mL PBS 緩沖液。勻質3 min，4 層紗布過濾。將濾液轉移至離心管中，12000 r/min 離心10 min，棄去上清。沉淀中加入1 mL PBS 緩沖液，按照優化后的PMA 處理條件進行處理。按照1.2.2.2 的方法提取樣品DNA 后，進行qPCR 反應。反應條件及體系同1.2.5。所有DNA 樣品在qPCR 檢測之前都經過常規PCR 和凝膠電泳檢測，以防后期因蘋果DNA樣品問題出現假陰性結果。

1.3 數據處理

基于以上分析，廣西大學行健文理學院專創融合的市場營銷專業師資隊伍的建設已有較好的基礎，未來應有效利用面臨的機遇充分發揮挖掘現有優勢、彌補不足，同時盡力以優勢去迎接挑戰。以科學發展觀主動適應經濟新常態發展、區域經濟、產業經濟轉型升級的需求，堅持復合應用型市場營銷人才培養的辦學理念，深化有地域特色的專創融合的師資隊伍的打造。

2 結果與分析

2.1 PMA 條件優化

2.1.1 PMA 濃度優化 添加不同濃度的PMA 對擴展青霉熱滅活孢子懸浮液和活孢子懸浮液進行處理，研究不同濃度PMA 對擴展青霉熱滅活孢子和活孢子qPCR 擴增的影響。圖2 結果顯示使用PMA 溶液能夠明顯抑制熱滅活擴展青霉的DNA 擴增，當PMA 濃度=0 時，Ct 值與PMA 處理組Ct 值具有顯著差異（P＜0.05）；當PMA 濃度＜10 μg/mL 時，Ct 值隨著PMA 濃度增加而增大，這說明低濃度的PMA不能完全抑制熱滅活孢子DNA 擴增；當PMA 濃度＞10 μg/mL 時，Ct 值不存在顯著差異（P＞0.05），說明10 μg/mL 的PMA 能完全與熱滅活孢子DNA 結合，并完全抑制熱滅活孢子DNA 擴增。不同濃度的PMA 對活孢子進行處理，對活孢子qPCR 擴增無顯著抑制作用（P＞0.05）。故選10 μg/mL 為最佳PMA處理濃度。

圖2 不同濃度PMA 處理對擴展青霉熱滅活及活孢子qPCR 擴增的影響Fig.2 Effects of different concentrations of PMA treatment on the qPCR amplification of Penicillium expansum dead spores and live spores

2.1.2 黑暗孵育時間優化 如圖3 所示，黑暗孵育處理5、10、15、20 和25 min 的Ct 值無顯著差異（P＞0.05），說明黑暗孵育5 min 時PMA 就能夠完全與熱滅活孢子DNA 結合，抑制熱滅活孢子DNA 的擴增；同時不同黑暗孵育處理，對活孢子DNA 擴增并無顯著抑制作用（P＞0.05），說明黑暗處理5～25 min均不會對活孢子產生毒性，且不會影響活孢子DNA的擴增，黑暗孵育5 min 處理能夠抑制熱滅活孢子DNA 的擴增，但不影響活孢子DNA 的擴增，故選5 min 為最佳黑暗孵育時間。

3)γCa/γCl系數。由表3的γCa/γCl系數結果可知，所有的水樣的γCa/γCl都較大。充分說明了榆林市礦區第四系潛水含水層水動力條件較好，更新循環較好，導致Cl-含量相對較低。

圖3 不同黑暗孵育時間處理對擴展青霉熱滅活及活孢子qPCR 擴增的影響Fig.3 Effects of different dark incubation time treatments on the qPCR amplification of Penicillium expansum dead and live spores

2.1.3 曝光時間優化 如圖4 所示，使用PMA 對擴展青霉熱滅活孢子進行處理，曝光時間＜10 min 時，Ct 值會隨著曝光時間的增加而增大，說明不足的曝光時間，不能使殘留的PMA 充分光解，從而不能完全抑制熱滅活孢子DNA 擴增；當曝光時間＞10 min時，Ct 值無顯著差異（P＞0.05），說明曝光10 min 就能夠使殘留的PMA 充分光解。使用PMA 處理擴展青霉活菌處理，不同的曝光時間組的Ct 值無顯著差異（P＞0.05），說明不同的曝光時間并不影響活孢子DNA 擴增。故選10 min 為最佳曝光時間。

圖4 不同曝光時間處理對擴展青霉熱滅活及活孢子qPCR 擴增的影響Fig.4 Effects of different exposure time treatments on qPCR amplification of Penicillium expansum dead and live spores

本研究最終發現10 μg/mL 為PMA 最佳濃度，5 min 為最佳黑暗孵育時間，10 min 為最佳曝光時間，與于璇等[17]設計檢測十字花科黑斑病原菌的最佳處理條件一致，與王帥等[11]建立的青枯菌PMAqPCR 檢測的最佳處理條件（PMA 濃度為15 ng/μL、黑暗孵育處理10 min、曝光處理5 min）不同。兩種方法的處理條件不同可能是菌種品類不同、PMA 產品不同、鎢燈型號不同所致[9]。

2.2 引物特異性

通過對各引物PCR 擴增、凝膠電泳驗證，結果（圖5）顯示Pexp-patF引物擴增出的片段大小與Tannous 等[7]方法中擴增片段大小一致，為92 bp，且其只產生一條帶，并無引物二聚體的存在，與本實驗所用菌株基因特異性結合，特異性最強，而PG、POL、HHJ等3 個引物擴增產物為多個條帶，另外，對Pexp-patF進行qPCR 擴增，觀察反應熔解曲線在熔解溫度（Melting Temperature，Tm）為87.4 ℃時有單一的熔解峰，無引物二聚體和非特異性出現（圖6），因此，Pexp-patF可以用于后期PMA-qPCR實驗。Pexp-patF是Tannous 等[7]通過展青霉素合成調控基因PatF所設計，PatF基因是調控新棒曲霉素合成酶的基因，展青霉素合成的中間物質葉點霉素在新棒曲霉素合成酶作用下會生成新棒曲霉素，新棒曲霉素在乙醇脫氫酶、葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶的作用下最終轉化為展青霉素[24]，這可能是PexppatF能夠與擴展青霉基因結合、且特異性良好的原因。PG引物實驗所用菌株是從腐爛柑橘中分離，POL菌株來源于加拿大國家食品安全研究所，HHJ菌株來源于中國微生物中國普通微生物菌種保藏管理中心中分離均與該實驗所用菌株不同。PG、POL、HHJ引物沒有跟本實驗所用擴展青霉基因特異性結合可能與引物設計所用擴展青霉的菌株與本實驗不同所致。以后的引物設計中，可選擇菌種的合成代謝物基因來設計引物，從而設計出具有更高的特異性的引物用于qPCR 檢測中，能夠減少假陽性結果的產生，并提高檢測的準確性。

圖5 4 對引物qPCR 擴增擴展青霉DNA 結果Fig.5 qPCR amplification electrophoresis results by 4 pairs of primers with P. expansum DNA

圖6 擴展青霉DNA 與Pexp-patF qPCR 反應熔解曲線Fig.6 Melting curve of P. expansum DNA reaction with Pexp-patF qPCR

2.3 PMA-qPCR 標準曲線及檢出限的評價

利用擴展青霉孢子懸浮液梯度稀釋進行PMAqPCR 擴增，菌落濃度與Ct 值的相關性如圖7 所示。兩者之間具有良好的線性相關關系，y=-2.023x+35.925，R2=0.9948，標準曲線的重復性和穩定性良好。經計算PMA-qPCR 擴增效率（E）為90%。檢測限（Limit of Detection，LOD）通過公式Ct（LOD）=Ct（空白）–3 計算[25]，為102.6CFU/mL。該檢測限比王銀環等[26]利用PMA-qPCR 對地衣芽孢桿菌活菌制品中金黃色葡萄球菌最低檢測限（104CFU/mL）低，與Crespo-Sempere 等[19]建立的PMA-qPCR 檢測人工接種番茄樣品中鏈格孢菌檢出限（102CFU/g）類似。與Frisch 等[27]優化的一種環介導的等溫擴增檢測擴展青霉的方法的檢測下限（103CFU/mL）相比較，本研究采用的PMA-qPCR 檢測擴展青霉檢出限更低，具有更高的靈敏度。

圖7 PMA-qPCR 標準曲線Fig.7 PMA-qPCR standard curve

2.4 人工染菌蘋果樣品活菌檢測

對人工接種擴展青霉蘋果樣品進行PMA-qPCR檢測，根據標準曲線計算人工染菌蘋果樣品中擴展青霉活菌數。結果如表4 和圖8 所示，PMA-qPCR 檢測出人工污染3 d 后病斑處擴展青霉活菌數已達到1.61×106CFU/g，平板菌落計數按照國標進行計數[28]結果為1.4×106CFU/g。距離病斑0.5、1 cm 處，PMA-qPCR 檢測出結果及平板菌落計數法檢測出活菌。這與Wei 等[5]利用平板菌落計數方法發現當病斑直徑為1 cm 時仍可在距病斑2 cm 處檢測出擴展青霉活菌類似，這結果再次驗證了擴展青霉菌會向未腐爛組織遷移。距離病斑2 cm 處提取的DNA 未檢測出熒光信號，含量低于最低檢測線，同時平板菌落計數法結果小于10。兩者方法結果進行配對t檢驗，無顯著差異，這一發現與Dias 等[29]的結果一致，這證明該本實驗方法結果可靠，可利用PMA-qPCR來檢測定量擴展青霉活菌。在實際操作過程中，PMA-qPCR 具有顯著的優勢。傳統的平板菌落計數需將樣品稀釋液與未凝固培養基混合均勻后，凝固倒置培養。若培養基溫度過高會燙死原本活的孢子，從而影響結果。除此之外，樣品的破碎不均勻、環境污染都會影響平板菌落計數的結果，然而利用PMAqPCR 技術檢測則會很好地避免這些影響因素。傳統的平板菌落計數法需花費3～4 d 進行菌落培養，而PMA-qPCR 僅需花1 d 時間便可得到準確結果。與平板菌落計數這一傳統活菌檢測手段相比PMAqPCR 檢測更便捷，且具有高度敏感性和特異性[30]。

圖8 人工染菌蘋果樣品PMA-qPCR 檢測結果Fig.8 PMA-qPCR detection results of artificially infected apple samples

表4 人工染菌樣品 PMA-qPCR 結果與平板法計數比較Table 4 Comparison of PMA-qPCR results and plate counts results of artificially infected samples

3 結論

PMA-qPCR 能夠彌補PCR、qPCR 不能檢測活菌的缺陷，同時比傳統平板菌落計數方法更快捷，且具有特異性。本實驗根據已發表文獻篩選特異引物并優化PMA 的處理條件，最終建立了以10 μg/mL PMA、黑暗孵育5 min、曝光處理10 min 為最優處理條件的PMA-qPCR 檢測擴展青霉活菌方法，該方法具有較高的靈敏性和可靠性，能夠快速檢測出樣品中的擴展青霉活菌數，最低檢測限為102.6CFU/mL。將其應用到人工染菌樣品活菌檢測，其結果與傳統的平板菌落計數結果無明顯差異，并且在未腐爛的蘋果組織中發現擴展青霉活菌。未來將該方法應用于食品加工檢測中，可進一步降低人們暴露在展青霉素的潛在危險，為擴展青霉防控提供一種新的技術支持。但本研究中樣品DNA 提取步驟較為繁瑣，花費時間較長，后期可優化樣品DNA 提取方法，從而提高PMA-qPCR 檢測擴展青霉活菌的便捷性。