鹿茸肽的酶解工藝優化及其體外抗藍光活性評價

張佳怡，李春楠 ，金澤成，趙峻露，程端端，蘭 夢，李雅靜，孫佳明

（1.長春中醫藥大學藥學院，吉林長春 130117；2.長春中醫藥大學人參科學研究，吉林長春 130117）

藍光是介于380～500 nm 波長之間可見光譜中波長最短的光，是占據可見光譜中能量最大、頻率最高的區域，屬于高能短波光[1]。除太陽中含有藍光之外，生活中手機、電腦等數碼產品中均存在很強的藍光波峰[2]，人們長時間處在一個藍光的世界。電子產品釋放的藍光會造成視力減弱、視疲勞，同時也刺激皮膚加速老化等。研究發現，藍光的穿透力遠大于紫外線，能直達皮膚真皮層甚至更深層，刺激皮膚炎癥因子的產生和釋放，誘發氧化應激反應，延緩表皮屏障的修復，引起色素沉淀，使皮膚出現脫水，進而造成皮膚衰老[3-4]。

鹿茸是上等的滋補保健品，我國擁有悠久的鹿產品食用歷史，經國家市場監督管理總局網站中特殊食品信息查詢平臺檢索到含有鹿茸的保健食品有200 多種，主要以緩解體力疲勞和增強免疫力為主，此外鹿茸與其他的中藥配伍形成了新的保健、美容等作用。鹿茸肽（Velvet antler peptides，VAP）是從鹿科動物雄性梅花鹿或馬鹿的密生茸毛的未骨化的幼角中提取出一種蛋白多肽類活性因子，具有抗炎癥[5]、抗氧化[6]、抗骨質疏松[7]、延緩衰老[8]、促進傷口愈合[9]等藥理作用，被視為傳統名貴中藥鹿茸（Cervi Cornu Pantotrichum）中極具研究價值的活性成分之一。目前，生物活性肽（Bioactive peptides，BAP）已經成為當下研究的熱點，其常見的提取方法有化學水解法、微生物發酵法、酶解法等，在醫藥、化妝品、保健食品等行業均具有廣闊應用前景，為藥食同源中藥的開發提供附加價值[10-11]。近年來，鹿茸肽在美容護膚、養生保健、食品加工等領域得到越來越多的應用，但其在藍光輻射造成的皮膚損傷修復方面研究尚未引起關注[12-14]。因此，本課題組結合當前抗藍光的熱點對鹿茸展開進一步研究。

本研究以鹿茸為原料，選擇較為溫和、提取活性好的酶解法優化鹿茸肽提取工藝，并應用人化角質形成細胞（Human immortal keratinocyte line，HaCat）細胞進行抗藍光活性研究。因此，在提高鹿茸綜合利用的價值的基礎上，為鹿茸肽的提取以及鹿茸高價值產品的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹿茸 吉林省東豐鹿場；堿性蛋白酶（酶活力200 U/mg）、中性蛋白酶（酶活力5 萬U/g）、胰蛋白酶（酶活力250 U/mg）、胃蛋白酶（酶活力3500 U/mg）長春百金生物有限公司；HaCat 細胞 武漢普諾賽生命科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）北京博奧森；牛血清蛋白 Hyclone 公司；胎牛血清、DMEM 培養基 美國Gibco 公司；娃哈哈純凈水吉林娃哈哈食品有限公司；堿性酮 長春百金生物有限公司；福林酚試劑 國藥集團化學試劑有限公司；SOD、GSH 試劑盒 江蘇晶美生物有限公司；MDA試劑盒 美國R&D 公司；其他試劑 均為國產分析純。

METTLER TOLEDO pH 計 上海虹益儀器儀表有限公司；MiliQ 超純水機 美國Bedford 公司；VIS-7220 可見分光光度計 美國瓦里安公司；CO2培養箱 日本Sanyo 公司；JHBE-50S 閃試提取器北京金鼎科技發展有限公司；超凈工作臺 美國Merck-Millipore 公司；ETTLER TOLEDO 電子天平（MAX=210 g，d=0.001 g） SARTORIUS AG；Jing LiL D5-10 型低速離心機 上海安亭科學儀器廠；CR20B2 型冷凍高速離心機 日本日立；GVDV300三頻恒溫超聲波清洗器 江蘇昆山超美；FK-A 型組織搗碎機 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；680 型酶標儀 上海伯樂生命醫學產品有限公司；90-3 型恒溫雙向磁力攪拌器 上海振容科學儀器有限公司；1700 型紫外分光光度儀、LED 藍光燈435～445 nm徐州愛佳LED 科技。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹿茸蛋白的提取 取鹿茸鮮品20 g，去除血漬和茸毛，剪成小塊，用清水浸泡軟化后，加入粉碎機粉碎，按照料液比1:10（g/mL），置于閃式提取裝置中，室溫25 ℃下提取30 min 后，以4000 r/min 離心20 min，取上清液，微濾后，選用3000 Da 的Millipore 超濾膜對鹿茸蛋白溶液進行超濾，收集濾出液，凍干備用[15]。

1.2.2 鹿茸肽酶解工藝

1.2.2.1 鹿茸酶解蛋白的選擇 稱取一定量鹿茸蛋白凍干粉，將底物濃度為1%，反應的過程中加入1 mol/L NaOH 或HCl 以維pH 恒定，分成4 份分別置于恒溫磁力攪拌器中攪拌，酶解溫度選擇45 ℃，分別加入堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，待酶解反應5 h 后，升溫至100 ℃滅酶10 min。冷卻，在4000 r/min 條件下離心20 min，取上清液凍干，即鹿茸肽，在相同條件下比較不同蛋白酶解收率。并將所制鹿茸肽儲存于-20 ℃，備用。

1.2.2.2 鹿茸肽酶解收率計算 精密稱定牛血清蛋白標準品12 mg，加少量水溶解后轉移至50 mL 容量瓶中，再繼續加水定容至刻度線，混勻，配成標準溶液（50、100、150、200、250 μg/mL）。以吸光度（Y）為縱坐標，各標準溶液的濃度（X，mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程A=0.0036x-0.0007，R2=0.9994，結果表明質量濃度為50～250 μg/mL 范圍內時，蛋白質標準溶液的質量濃度與吸光度線性關系良好。取鹿茸酶解肽，加水配制為1 mg/mL 的溶液，再精密量取供試品溶液1.0 mL 放置于25 mL 容量瓶中，加水溶解稀釋至刻度，混勻，即可得到待測溶液，按照標準曲線制備，于650 nm 測定吸光度，然后將得到的吸光度代入至牛血清蛋白標準曲線中，根據公式計算。

式中，C 為供試品（樣液）溶液中的蛋白質濃度，μg/mL；D 為樣品溶液的稀釋倍數；W 樣為樣品質量，μg。

1.2.3 鹿茸肽酶解工藝單因素實驗設計 確定實驗最佳酶解蛋白酶，設置酶解體系的固定條件為酶底比5%、pH8、酶解時間為4 h，考察不同溫度（30、35、40、45、50、55 ℃）對鹿茸肽酶解的影響；設置酶解體系的固定條件為pH8、酶解時間為4 h，溫度45 ℃，考慮不同酶底比（1%、2%、3%、4%、5%、6%）對鹿茸肽酶解的影響；設置酶解體系的固定條件為酶底比5%、pH8、溫度45 ℃，考慮不同酶解時間（2、3、4、5、6、7 h）對鹿茸肽酶解的影響；設置酶解體系的固定條件為酶底比5%、溫度45 ℃、酶解時間為4 h，考慮不同pH（6、6.5、7、7.5、8、8.5）對鹿茸肽酶解的影響。實驗均重復三次，實驗結果以平均值±標準差表示。

1.2.4 正交實驗設計 本試驗主要分析酶解溫度、酶底比、酶解時間、pH 四個因素對酶解的影響。如表1 所示，以鹿茸肽酶解收率為指標，建立四因素三水平的實驗，選出最優鹿茸肽酶解工藝條件，實驗結果用L9（34）正交表來考察。

表1 堿性蛋白酶正交實驗因素設計Table 1 Alkaline protease orthogonal experimental factor design

1.2.5 鹿茸肽對HaCat 細胞活性影響

1.2.5.1 細胞培養 將冷凍的HaCat 細胞復蘇后，接種于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基中，并在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱下培養，當細胞貼壁生長時，吸去培養液，用PBS 洗3 次，加入完全培養基繼續培養，隔2～3 d 傳代1 次，取對數生長期細胞用于相關實驗[16]。

1.2.5.2 CCK-8 法測定細胞存活率 將配制好的細胞以1×104個/mL 接種于96 孔培養板中，每孔加入200 μL 完全培養基培養，置于37 ℃的CO2培養箱，培養24 h，給藥組給予不同質量濃度稀釋的藥液，每組設5 個復孔，四組每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，在培養箱中37 ℃避光孵育2 h，于450 nm 處檢測各組吸光度（OD）值[17]，OD 值越高，細胞增值率越好，存活率越高，計算公式如下：

1.2.5.3 鹿茸肽對藍光照射HaCat 細胞的影響LED 藍光燈設定波長440 nm，水平放置細胞板底正下方進行避光照射，考察藍光照射時間，分別選取10、20、30、40 和50 min，CCK-8 法計算存活率，確定藍光模型照射時間。

將藍光照射模型組和藍光+給藥組（12.5、25、50、75、100 μg/mL）進行藍光照射，空白對照組在同等條件下避光培養。每次照射完成后將細胞放入培養箱中繼續培養，24 h 后進行CCK-8 檢測，計算細胞存活率[18]。

1.2.5.4 鹿茸肽對HaCat 細胞SOD、GSH 及MDA分泌量的影響 將孵育好的各組細胞，吸去每孔培養液，模型組和空白組加入新的完全培養液，給藥組（12.5、25、50、75、100 μg/mL）加入不同劑量藥物，培養24 h 后，利用反復凍融法進行細胞破碎，離心取上清液。根據ELISA 試劑盒說明書進行操作，分別檢測超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）水平[19-20]、丙二醛（MDA）的含量，實驗獨立重復3 次。

1.2.6 鹿茸肽的體外抗氧化能力分析

1.2.6.1 鹿茸肽對DPPH 自由基清除能力的測定參考文獻[21-22]測定鹿茸肽清除DPPH 自由基的能力。用無水乙醇配制DPPH 溶液2×10-4mol/L，避光，保存備用。精確吸取2 mL 樣品于試管中，加入2 mL DPPH溶液，充分混合、搖勻，水浴27 ℃ 30 min后倒入比色皿中，于517 nm 處測定其吸光度值A1。平行測定三次，結果以平均值±標準差表示（±SD），對照組以無水乙醇代替DPPH 無水乙醇溶液A2，空白組以無水乙醇代替樣品A0，BHT 為陽性對照組。按下式計算DPPH 自由基清除率：

1.2.6.2 對羥自由基清除能力的測定 參考文獻[23-25]測定鹿茸肽清除羥自由基的能力。向1 mL的樣品溶液中，分別加入2.0 mmol/L FeSO4溶液1.5 mL、30 mmol/L H2O2溶液1.5 mL、6 mmol/L 水楊酸溶液1.5 mL，振蕩，搖勻。37 ℃條件下水浴15 min 后，在510 nm 處測定吸光度A1。用蒸餾水代替水楊酸溶液作為對照組，用無水乙醇溶液代替樣品溶液作為空白組，平行測定三次，結果用平均值±標準誤表示，采用蒸餾水代替H2O2作為對照組，使用無水乙醇代替樣品作為空白組分別測定吸光度為A2和A0，VC為陽性對照組。按下式計算OH 自由基清除率：

1.3 數據處理

采用Graphpad Prism 8.0 軟件進行作圖，應用SPSS 21.0 軟件進行數據的顯著性分析，n=3，計量數據以標準差（±SD）表示，組間比較應用單因素方差分析和t 檢驗。

2 結果與分析

2.1 鹿茸肽酶解蛋白的篩選

結果如圖1 所示，在相同條件下以鹿茸肽收率為指標，所得酶解鹿茸肽收率順序為堿性蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞胃蛋白酶，最終確定堿性蛋酶水解效果更優，因此，本實驗最終選擇堿性蛋白酶作為鹿茸蛋白的水解酶。

圖1 蛋白酶的種類對鹿茸酶解的影響Fig.1 Effect of protease species on enzymolysis rate

2.2 鹿茸肽制備影響單因素初篩結果

2.2.1 不同溫度對鹿茸肽酶解收率的影響 如圖2，隨著溫度的升高，鹿茸肽的酶解收率呈現先升高再下降的趨勢。當酶解溫度達到45 ℃時，鹿茸肽的酶解收率最大為19.52%，顯著高于其他樣品組。當溫度大于45 ℃時，肽收率隨著溫度升高而下降。這是因為溫度升高時，分子熱運動加快，導致與底物的碰撞幾率增加，進而加快酶促反應，當溫度超過一定限度時，酶的穩定結構被破壞，最終使酶變性甚至失活[26]。因此酶解溫度在40～50 ℃為宜。

圖2 酶解溫度與鹿茸肽酶解收率的關系Fig.2 Relations between temperature and yield of antler peptidas

2.2.2 不同酶底比對鹿茸肽酶解收率的影響 從圖3可知，隨著酶底比的百分數增加，鹿茸肽的酶解收率先增加后降低，當酶底比為5%左右時，肽的含量最高18.25%。由于隨著蛋白酶量的增加可以加快酶解速率，當底物已經充分酶解時，繼續增加酶會使體系流動性會變差，降低酶解速率[27]。故酶解反應時酶底比應控制在4%～6%。

圖3 酶底比與鹿茸肽酶解收率的關系Fig.3 Relation between enzyme base ratio and enzyme unyield of antler peptides

2.2.3 不同時間對鹿茸肽酶解收率的影響 從圖4中可得，隨著時間延長，鹿茸肽的酶解收率隨著時間的增加呈現先快速增加后逐漸平緩，再降低的趨勢，在6 h 時，鹿茸肽的酶解收率最高為17.66%。這是種現象是由于剛開始時反應時間較短時，酶與底物的作用不夠充分，隨著時間延長底物逐漸被消耗，產物含量增加，反應出現競爭性抑制，酶解速度逐漸降低[28]。但由于4 h 與5、6 h 時的多肽酶解收率相差不大，從工業化的角度考慮，故最適時間為3～5 h。

圖4 酶解時間與鹿茸肽酶解收率的關系Fig.4 Relation between enzymatic digestion time and the yield of antler peptides

2.2.4 不同pH 對鹿茸肽酶解收率的影響 從圖5中可知，鹿茸肽的酶解收率隨著酶解溫度的升高先增大后減小，當酶解pH 達到8 左右時，鹿茸肽酶解收率達到最大18.65%。這是因為酶都有一個最適pH 反應條件，當pH 過高或過低會影響酶的天然空間構型，使酶的活性受到抑制或失活[29]。因此，pH 應控制在7.5～8.5 左右。

圖5 pH 與鹿茸肽酶解收率的關系Fig.5 Relationship between pH and unyield of deer antler peptides

2.3 正交實驗結果

根據單因素實驗結果，選取的正交實驗因素為酶解溫度（A）、酶底比（B）、酶解時間（C）、pH（D），以鹿茸肽酶解收率（Y）為指標，根據正交中心組合原理，設計試驗優化鹿鞭肽酶解工藝，正交實驗設計。由表2 可以看出，采用堿蛋白對鹿茸肽進行水解時，通過方差分析可得出結論，各因素影響順序為酶底比＞溫度＞時間＞pH；最優工藝參數為A2B3C3D3，即當酶解溫度為45 ℃、酶底比為6%、酶解時間為5 h，pH8.5，是提取鹿茸肽的最佳工藝參數，酶解收率為52.7%。根據表3 可知，B 因素F值差異顯著，所以在鹿茸酶解過程中首先應嚴格控制好酶底比的值，其次是酶解溫度和酶解時間。

表2 正交實驗結果分析Table 2 Analysis of the orthogonal test results

表3 正交試驗方差分析結果Table 3 Results of ANOVA of orthogonal test

2.4 鹿茸肽對HaCat 細胞活性影響

2.4.1 HaCat 細胞藍光模型條件確定 通過對藍光模型考察，我們發現隨著照射時間的加長，細胞存活率也逐漸下降，如圖6 所示，30 min 開始具有顯著性（P＜0.01），存活率為49.1%；考慮細胞離開培養箱不易太久，故藍光模型最佳時間選為30 min。

圖6 不同時間藍光照射對細胞存活率的影響Fig.6 Effect of blue light exposure at different times on cell survival rate

2.4.2 鹿茸肽對HaCat 細胞存活率的影響 由圖7可知，在藍光照射30 min 下的細胞模型，與空白組相比，存活率為51.4%，顯著性下降（P＜0.01），表明模型成功；給予不同濃度鹿茸肽溶液后，細胞存活率隨著藥物濃度的增加而提高，與模型組相比，在25～100 μg/mL 濃度之間，具有顯著性，當濃度在100 μg/mL時，平均存活率達82%，與模型組有顯著差異（P＜0.01）。

2.4.3 鹿茸肽對HaCat 細胞SOD、GSH 及MDA 分泌量的影響 SOD 和GSH 是生物體內必要的氧自由基清除劑，是細胞內抵御氧化應激的重要機制[30-31]，SOD、GSH 分泌量高低的變化反映了細胞抗氧化能力的大小，分泌量越高，抗氧化能力越強，MDA 含量的高低反映了機體自由基累積及脂質過氧化損傷的程度。如圖8 所示，同時藍光照射細胞后，加入不同濃度鹿茸肽培育24 h，模型組與空白組比較，具有顯著性差異（P＜0.01），與模型組相比較，給藥組細胞中SOD、GSH 含量水平雖不如空白組高，但隨著濃度增加其含量也有所增加，具有統計學意義；模型組MDA 含量與空白組相比顯著升高，但隨著給藥劑量增加逐漸降低，與模型組相比具有統計學意義；當濃度達100 μg/mL 時，細胞分泌SOD、GSH 和MDA水平最顯著（P＜0.01），表明鹿茸肽在一定范圍內可以增加HaCat 細胞的抗氧化水平。

圖8 鹿茸肽對SOD、GSH、MDA 的影響Fig.8 Effects of different concentrations of deer antler peptides on SOD, GSH and MDA

2.4.4 鹿茸肽抗DPPH 自由基清除能力 DPPH 化學名1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，呈暗紫色棱柱狀結晶，常用于定量測定物質抗氧化能力。本實驗測定不同濃度的鹿茸肽對DPPH 自由基的清除能力與BHT 進行比較，結果如圖9 所示。可以看出鹿茸肽在低濃度時對DPPH 的清除能力明顯弱于BHT，但隨著濃度的增加，二者清除率的差值逐漸變小，當濃度增加到0.8 mg /mL 時，鹿茸多肽DPPH 自由基的清除率接近50%。經過計算鹿茸肽抗DPPH 自由基清除率的IC50為0.98mg /mL，BHT 的清除率IC50是0.50 mg/mL。

圖9 不同濃度鹿茸肽對DPPH 自由基的清除能力Fig.9 Scavenging ability of DPPH radicals by different concentrations of deer antler peptides

2.4.5 鹿茸肽抗羥自由基（·OH）清除能力 不同濃度的鹿茸膠原多肽對·OH 的清除能力如圖10 所示，結果表明，鹿茸肽清除率隨著樣品濃度的增加而增高，當濃度達到0.8 mg/mL 以上，其·OH 抑制率均在50%以上，經計算，鹿茸肽對·OH 清除率的IC50為0.63 mg/mL，VC的清除率IC50是0.53 mg/mL，表明鹿茸肽清除羥自由基（·OH）能力較強。

圖10 不同濃度鹿茸肽對羥基自由基的清除能力Fig.10 Scavenging ability of hydroxyl radicals by different concentrations of deer antler peptides

3 討論與結論

現有研究發現，鹿茸肽對光損傷造成的皮膚問題具有很好功效，能減緩皮膚衰老，降低日光對皮膚的侵蝕[32-33]，而藍光作為生活中隨處可接觸的光源之一，更不亞于戶外光輻射，其對皮膚的危害常常被人忽視[34]。本研究在單因素實驗的基礎上，結合正交實驗設計，優化了鹿茸肽應用酶解工藝，工藝條件為溫度45 ℃，酶解時長5 h，pH8.5，酶底比6%，方法溫和，確保了得率、純度和活性，且利用膜分離技術，保證了肽分子量低于3000 Da，具有實際應用價值，為鹿茸肽工業制備提供了理論基礎。

通過體外培養HaCat 細胞，構建HaCat 細胞的藍光損傷模型，考察了不同時間及不同濃度下鹿茸肽對藍光照射皮膚HaCat 細胞活力的影響，當藍光照射30 min 時利于細胞損傷模型成功，若時間過久細胞離開培養箱容易受外界影響而死亡，則無法判斷其是否受藍光影響。HaCat 細胞具有遺傳性質穩定、永生性和類角質形成細胞特性等特點，常被應用于研究各種皮膚損傷修復[35]。本研究證實添加鹿茸肽的HaCat 細胞，與模型組相比，鹿茸肽可以減輕藍光照射對HaCat 細胞增殖的不利影響，當鹿茸肽濃度最高時細胞存活率可恢復到82%。同時，鹿茸肽可有效促進HaCat 細胞中SOD、GSH 分泌表達水平，使MDA 含量下降。SOD 是人體中重要的氧化自由基清除劑，對抗皮膚衰老和促進皮膚愈合等方面具有重要的研究價值[36-38]；而GSH 不僅在維持細胞內氧化還原平衡發揮著重要作用，還因其抑制酪氨酸酶的能力而被廣泛用于皮膚美白[39-41]；MDA 作為脂質過氧化的重要產物之一, 其含量的高低間接反映了機體受自由基攻擊的程度及脂質過氧化損傷的程度[42]。另外，在人類的各種疾病研究發現，抗氧化能力是關鍵，生物體中的自由基過多會產生有害影響，如破壞細胞膜、損傷蛋白質和基因，同時可能破壞組織的分子結構，導致出現衰老、炎癥等問題[43-44]。本研究發現，在一定濃度范圍內鹿茸肽能有效清除DPPH 和羥基自由基，有效提高機體抗氧化能力，防止藍光對機體的侵害。另外，同其他學者鹿茸肽的清除自由基活性相比，本優化工藝后提取的鹿茸肽抗氧化能力較強。王琦[21]研究發現只有當濃度增加到10 mg/mL 時，鹿茸多肽對DPPH 自由基的清除率才能達到50%以上。

綜上所述，本研究優化了酶解鹿茸肽的制備工藝，初步驗證了鹿茸肽具有較好的抗藍光活性。該結果對于鹿茸肽抗藍光護膚品或保健品的開發具有一定參考價值[45]。同時，本研究也為進一步開發鹿茸在美容護膚方向上的相關產品提供了新思路。但本研究仍具有一定的局限性，其具體的作用機制還有待進一步研究。