人參多糖的分離純化及其對UVB 致皮膚損傷的保護作用

聶 梅，黎 鵬，湯靜潔，張平軍，黃冬婷,

（1.廣東省科學院生物與醫學工程研究所，廣東廣州 510316；2.廣東省綠色制糖工程技術研究中心，廣東廣州 510316）

皮膚是人體的最外層器官，很容易暴露在紫外線下造成刺激。根據波長的不同，紫外線可以分為UVA（320～400 nm）、UVB（280～320 nm）、UVC（100～280 nm）。大氣中的臭氧層對UVC 有較強的吸收能力，到達地球表面的紫外線主要是UVA 和UVB[1]。UVB 的波長處于DNA 和蛋白質的吸收峰附近，其輻射是皮膚光化學反應中最活躍部分，誘發的炎癥在皮膚光老化中起核心作用[2-3]。過量的UVB 輻射導致皮膚組織中的ROS 被大量激活，超過了機體的清除能力，導致細胞膜受損，脂質過氧化產生過量MDA，致使細胞凋亡從而引起光老化[4-5]。因此，開發含有天然成分或配方的藥物、食物抑制UVB 對皮膚的損傷實現抗衰老受到越來越多人的關注。

人參作為一種被廣泛使用了幾千年的著名中藥材，其有效成分包括皂苷、多糖、揮發油和氨基酸等[6]。主要有效成分人參皂苷的研究比較完整，其生理功能已經有了大量的實驗依據和證明[7-9]。然而，人參成分中最豐富的多糖（約占總含量的40%）還沒有得到充分的研究，此前對人參多糖的研究主要集中在其具有抗氧化作用[10]，通過降低組織過氧化程度，保護組織器官免受氧化損傷[11-13]。目前還缺乏人參多糖在皮膚抗衰老方面的研究。抗衰老活性研究中，細胞模型和動物模型都已有報道。董坤等[14]建立了UVB 致HFF-1 損傷模型，考察草莓葉水提物對UVB 致皮膚損傷的保護作用，結果表明草莓葉水提物有助于緩解氧化應激造成的細胞損傷，達到延緩衰老的功效。王慧云[15]通過建立過氧化氫刺激人臍靜脈血管內皮細胞誘導的衰老細胞模型發現，黨參多糖干預后細胞血清中內皮素-1（Endothelin-1，ET-1）、誘導型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）、ROS 含量降低，內皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）含量升高，DNMT1、EZH2、Bmi-1 蛋白與基因表達量、細胞DNA 甲基化水平也得到了調節，表明黨參多糖可以延緩內皮細胞衰老。趙苑伶等[16]分離純化得到鐵皮石斛多糖，以秀麗隱桿線蟲為模式生物，研究了鐵石斛多糖的抗衰老作用，結果表明鐵皮石斛多糖可以顯著延長秀麗隱桿線蟲的壽命，對高溫損傷和氧化應激損傷有一定的抵御作用。朱秋軼等[17]利用秀麗隱桿線蟲模型研究羊乳酪蛋白酶解物的抗衰老作用，實驗表明羊乳酪蛋白酶解物能延長線蟲壽命，降低線蟲體內脂褐素積累，提高線蟲在應激條件下的抵抗能力和體內抗氧化酶活力，具有較好的抗衰老活性。

由于對分離純化后的人參多糖在皮膚抗衰老方面的研究較為少見，因此，本文制備了人參精多糖，對其進行均一性測定、波譜表征及延緩皮膚衰老功效評價，為人參多糖的分離純化及在延緩皮膚衰老方面的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參的干燥根及根莖 河北省安國市藥材市場；α-淀粉酶（酶活力4000 U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力3000 U/g） 分析純，麥克林試劑生化科技有限公司；無水乙醇 市售，分析純；窄分部普魯蘭多糖標準品 日本Shodex 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒、人基質活性氧（ROS）ELISA 試劑盒、人基質丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒、人基質谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、人基質超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 試劑盒 深圳子科生物科技有限公司；人基質金屬蛋白酶1（MMP-1）ELISA 試劑盒、人基質金屬蛋白酶9（MMP-9）ELISA 試劑盒 杭州聯科生物技術股份有限公司。

TDZ4-WS 離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；DNM-9602 酶標分析儀 北京普朗新技術有限公司；BHC-1300IIB2 生物安全柜 蘇州金凈凈化設備公司；Thermo Forma 3111 CO2恒溫培養箱美國Thermo 公司；XDS-500C 顯微鏡 上海蔡康光學儀器有限公司；UV-1750 紫外-可見分光光度計、GPC-20A 凝膠滲透色譜儀、RID-20A 示差折光檢測器 日本島津公司；iS10 紅外（FT-IR）光譜儀 美國尼高力公司；AVANCE III 400M 核磁共振波譜儀德國BRUKER；TSKgel GMPWXL 水相凝膠色譜柱東曹（上海）生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人參粗多糖（GPS）的制備 參考文獻[18]制備人參粗多糖。稱取干燥過篩后的人參樣品，置于玻璃燒杯內，按料液比1:30（g/mL）加入去離子水，在70 ℃溫度、60 Hz 超聲功率下提取30 min。待溶液冷卻后離心（6000 r/min），取上清液。在上清液中加入約4 倍體積的無水乙醇溶液，放置在-20 ℃環境中醇沉24 h。過濾收集沉淀，將其放入真空干燥箱（70 ℃）中干燥至恒重，即得人參粗多糖（GPS），備用。

1.2.2 GPS 純化 參考文獻[19]對GPS 進行純化。利用α-淀粉酶去除上述提取的GPS 的淀粉。精密稱取10.0 g GPS，用少量去離子水溶解后轉移至1000 mL 容量瓶中，用去離子水定容，得到10 mg/mL的GPS 溶液。向配制好的GPS 溶液中加入800 Uα-淀粉酶，50～60 ℃酶解30 min，然后轉移至沸水浴中加熱5 min 終止酶解反應。溶液降至室溫后離心（4000 r/min，10 min），收集上清液。

利用木瓜蛋白酶去除上述提取的GPS 中的蛋白質。將200 U 木瓜蛋白酶加入上述溶液中，30～40 ℃酶解2 h，然后轉移至沸水浴中加熱5 min 終止酶解反應。溶液降至室溫后離心（4000 r/min，10 min），收集上清液。

將上清液加熱至70 ℃以蒸發除去過多的水分，濃縮至50 mL，向濃縮液加入200 mL 無水乙醇，搖勻，-20 ℃冰箱凍存靜置24 h，過濾得到白色固體，放置真空干燥箱中烘干（60 ℃）至恒重，得到4.8 g 酶解后的GPS。

取酶解后的GPS 4.0 g，配制成10 mg/mL 的溶液。溶液用DEAE-52 纖維素填料進行柱層析洗脫，以去離子水為洗脫液，使用試管收集，每管收集10 mL。采用苯酚-硫酸法對每管溶液在490 nm 處吸光度進行檢測，對出現吸收峰的溶液進行收集，將收集的溶液冷凍干燥（-40 ℃），得到2.5 g 人參精多糖（GPS-1）。

1.2.3 GPS-1 的均一性鑒定及相對分子質量測定采用高效凝膠滲透色譜法測定GPS-1 的相對分子質量和純度。采用TSKgel GMPWXL 水相凝膠色譜柱，以0.1 mol/L NaNO3+0.06% NaN3（質量分數）水溶液為流動相，流速0.6 mL/min，檢測溫度35 ℃，進樣體積20 μL。采用示差折光檢測器，窄分部普魯蘭多糖標準品進行對照，對GPS-1 的分子量分布進行測試。

1.2.4 GPS-1 的初級結構表征 采用溴化鉀壓片法對GPS-1 樣品進行FT-IR 測試，波數范圍：400～4000 cm-1，光譜儀分辨率4 cm-1，信躁比50000:1，掃描64 次。采用核磁共振氫譜（1H NMR）和核磁共振碳譜（13C NMR）對GPS-1 的初級結構進行表征：稱取GPS-1 樣品5 mg，放入核磁管，加入1 mL 氘代試劑（重水）充分溶解樣品，檢測其1H NMR 和13C NMR譜圖。

1.2.5 細胞培養、細胞活力測試 采用含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素（10000 U/mL）與鏈霉素（10 mg/L）混合液）的DMEM 培養基培養HFF-1 細胞，將其置于37 ℃，5% CO2的培養箱中。顯微鏡下觀察HFF-1 細胞為貼壁細胞。

將處于對數生長期的細胞經胰蛋白酶消化，顯微鏡下計數后制成3×104個細胞/L 的細胞懸液。分別取100 μL 至96 孔培養板，每種細胞每塊板設置3 個復孔，3×103個細胞/孔，然后添加100 μL 不同質量濃度的GPS-1 溶液，同時以100 μL 培養液做空白對照，將培養板放置37 ℃、5% CO2的培養箱中培養過夜。分別處理細胞在0、48 h 后，按1:10 體積比混合CCK-8 和無血清必需基本培養基，每孔100 μL加入待測孔中，在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育1 h。用酶標儀測定450 nm 波長下培養板每孔吸光度，記錄數值。

1.2.6 急性光損傷模型的建立及分組 參照文獻[14]建立急性光損傷細胞模型。選擇生長狀態良好、對數生長期的HFF-1，接種密度3×104個/孔，建立實驗分組，每組設置3 個復孔。空白對照組：不照射UVB，不加GPS-1 溶液，細胞正常培養72 h；UVB 照射組：細胞正常培養48 h 后，在功率密度68 μW/cm2、照射距離10 cm 條件下，UVB 輻照100 s 后細胞培養24 h；GPS-1 高中低劑量組（200、500 和800 μg/mL）：細胞正常培養24 h 后，添加GPS-1 溶液和培養基條件下培養24 h，然后在功率密度68 μW/cm2，照射距離10 cm條件下，UVB 輻照100 s 后，再進行細胞培養24 h。

1.2.7 GPS-1 對SOD、MDA、MMP-1、MMP-9、ROS、GSH-Px 的影響 培養后，收集細胞上清，按照ELISA試劑盒說明書對SOD、MDA、MMP-1、MMP-9、ROS、GSH-Px 含量進行測定。

1.3 數據處理

采用SPSS statistics 軟件對數據進行One-way ANOVA 檢驗，數據結果以±s 表示，以*P＜0.05 為差異有統計學意義，**P＜0.01 為差異極其顯著。

2 結果與分析

2.1 GPS-1 的純度及相對分子質量分析

純化后的人參多糖GPS-1 的HPGPC 結果顯示，分子量分布圖（圖1）有兩個峰，其中峰1 峰面積占95.13%，此峰數均分子量（Mn）為1.079 kDa，重均分子量（Mw）為2.104 kDa，分布寬度指數PD（Mw/Mn）為1.95。峰2 峰面積占比4.87%，數均分子量（Mn）為0.055 kDa，重均分子量（Mw）為0.072 kDa，分布寬度指數PD（Mw/Mn）為1.29。結果表明GPS-1分子量分布相對均一，多糖純度為95.13%，相對分子質量較低。

圖1 GPS-1 的分子量分布凝膠色譜圖Fig.1 GPC chromatogram of GPS-1 for molecular weight determination

2.2 GPS-1 的初級結構表征

2.2.1 GPS-1 的紅外光譜表征 圖2 為GPS-1 的FTIR 譜圖，該譜圖表現出多糖的特征吸收峰，分別在3385、2928、1632、1594、1413、1364、1153、1079、1024、931 和850 cm-1處出現特征吸收峰。在3385 cm-1附近出現相對較寬的強吸收峰，是由分子間或分子內的O-H 伸縮振動引起的，表明樣品含多糖羥基。2928 cm-1附近的肩峰，是由C-H 或O-H 的伸縮振動引起的特征吸收峰[20]。1632 cm-1是C=O 非對稱伸縮振動峰，是未酯化的糖醛酸羧基特征峰[21]；1413 cm-1處為C-H 的變形吸收峰。在1200～1000 cm-1區間的多糖特征吸收峰是由C-O-C 和C-O-H 的伸縮振動引起的[20]。在1024、1079 和1153 cm-1處分別有三個吡喃糖特征吸收峰，表明該樣品多糖結構為吡喃糖環狀結構。α-型或β-型吡喃葡萄糖通常在960～730 cm-1內有特征吸收峰，其中，在844±8 cm-1處有吸收峰為α-型異構體，在891±7 cm-1處有吸收峰為β-型異構體[22]。該樣品的紅外譜圖在891 cm-1處無吸收峰，在850 cm-1處出現明顯的吸收峰，表明存在α-D-吡喃葡萄糖[23]。紅外光譜分析結果表明GPS-1 存在α-D-吡喃葡萄糖構型。

圖2 GPS-1 的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of GPS-1

2.2.2 GPS-1 的核磁表征 糖苷異頭氫的1H NMR信號一般處于δ4.2～5.8 ppm 范圍，其中，α-型糖苷的異頭質子處于δ4.8～5.8 ppm 范圍內，β-型糖苷的異頭質子處于δ4.2～4.8 ppm 范圍[24]。圖3 顯示，δ4.7 ppm為重水溶劑峰，δ3.2～4.0 ppm 為人參多糖糖環上的質子信號。人參多糖糖苷鍵的質子化學位移在δ4.5～5.4 ppm 范圍內，表明含有α-型和β-型兩類糖苷鍵。在糖苷鍵質子共振區δ4.2～5.8 ppm 范圍內出現7 個信號峰，表明樣品由7 種單糖組成。根據文獻[25]報道推斷氫譜上7 個信號δ5.31 ppm、δ5.27 ppm、δ5.14 ppm、δ5.13 ppm、δ4.88 ppm、δ4.57 ppm、δ4.56 ppm 分別歸屬為α-D-葡萄糖、α-D-半乳糖醛酸、α-D-阿拉伯糖、α-D-巖藻糖、α-D-核糖、β-D-甘露糖、β-D-阿拉伯糖糖苷鍵質子信號。

圖3 GPS-1 在400 MHz 條件下的1H NMR 譜圖Fig.3 1H NMR spectrum of GSP-1 recorded at 400 MHz

13C NMR 譜圖中，糖苷碳的信號共振區通常在δ95～110 ppm 范圍內。根據圖4 可知，δ100.33 ppm、δ99.94 ppm、δ99.69 ppm、δ99.58 ppm、δ98.57 ppm、δ98.25 ppm、δ95.75 ppm 分別對應七種單糖的糖苷碳，表明GPS-1 含有七種單糖成分，與其1H NMR 結果一致。糖環上化學位移一般在δ50～85 ppm 范圍內，其中，未發生取代的C6 在δ60～63 ppm 附近，連接到另一個糖殘基的C6 特征峰出現在δ65～70 ppm附近；糖環上C2、C3、C4 位置未發生取代時特征信號峰在δ70～77 ppm 范圍內，糖環上C2、C3、C4 位置發生取代時特征信號峰在δ77 ppm 以上[26]。圖4中GPS-1 信號在δ68～69.5 ppm 范圍內有特征峰，說明C6 位發生取代；在δ70～77 ppm 范圍內出現明顯的特征峰，可以判斷GPS-1 在C2、C3、C4 位置未發生取代。

圖4 GPS-1 在400 MHz 條件下的13C NMR 譜圖Fig.4 13C NMR spectrum of GSP-1 recorded at 400 MHz

2.3 GPS-1 對正常生長HFF-1 細胞增殖的影響

本實驗使用可快速高靈敏度檢測細胞增殖和細胞毒性的CCK-8 試劑盒，考察GPS-1 對正常生長HFF-1 細胞增殖情況的影響。細胞存活率是可直接表達各組細胞狀態的指標，反映細胞增殖情況，細胞存活率越高說明細胞狀態越好[27]。由圖5 可知，與對照組相比，當GPS-1 的質量濃度小于等于800 μg/mL時，對HFF-1 細胞存活率無顯著影響（P＞0.05）。當GPS-1 的質量濃度大于800 μg/mL 時，HFF-1 細胞存活率降低，GPS-1 質量濃度增至2000 μg/mL 時，細胞活率降至87.1%（P＜0.01）。最終選取200、500 和800 μg/mL 三個質量濃度用于后續實驗。

圖5 GPS-1 對正常生長HFF-1 細胞活力影響Fig.5 Effect of GPS-1 on the viability of normal growing HFF-1 cells

2.4 GPS-1 對UVB 致HFF-1 細胞損傷的保護作用

由圖6 可知，經UVB 輻射后，與對照組相比，UVB 照射組細胞存活率下降了20.1%，細胞存活率顯著降低（P＜0.01），說明UVB 致HFF-1 細胞損傷模型建立成功。而經GPS-1 保護干預后，與UVB照射組相比，GPS-1 質量濃度分別為200、500 和800 μg/mL 時，細胞存活率分別增加了1.9%（P＜0.05）、9.5%（P＜0.01）和18.8%（P＜0.01），均具有顯著性差異，說明GPS-1 對UVB 損傷HFF-1 細胞具有明顯的保護作用，在GPS-1 質量濃度為200～800 μg/mL范圍內，隨著質量濃度增高，對損傷細胞的保護作用隨之增強。

圖6 GPS-1 對UVB 照射組HFF-1 細胞活力影響Fig.6 Effect of GPS-1 on the viability of HFF-1 cells in UVB irradiation group

2.5 GPS-1 對UVB 照射組細胞內SOD、MDA、ROS、GSH-Px、MMP-1、MMP-9 的影響

皮膚成纖維細胞是合成膠原及彈性纖維的主要場所，雖然此種細胞位于真皮層，但更易發生氧化損傷[28]。當UVB 照射成纖維細胞時，細胞內SOD 和GSH-Px 抗氧化酶的活性受到抑制，當大量的ROS未能得到及時清除出現氧化應激反應，將破壞細胞內脂質、蛋白質、核酸等大分子物質，激活基質金屬蛋白酶表達，導致脂質分解，引發脂質過氧化反應，形成過氧化脂質產物（MDA）[14]。因此，測定MDA 含量，可間接反映細胞損傷程度，而SOD 作為衡量機體抗氧化能力大小的重要因素，可反映細胞消除ROS 的能力[29]。

如圖7 所示，與空白對照組相比，UVB 照射組HFF-1 細胞中ROS 和MDA 含量顯著增高（P＜0.01），SOD 和GSH-Px 酶活力顯著降低（P＜0.01），說明UVB照射對HFF-1 有明顯損傷作用，大量的ROS 未能被細胞清除，同時導致生成過量的MDA，造成細胞氧化損傷，引起機體衰老。與UVB 照射組相比，經GPS-1 保護干預后，HFF-1 中ROS 含量降低，GPS-1低、中、高劑量組分別下降了21.5%、42.8%、56.5%，且具有顯著性差異（P＜0.01），說明GPS-1 可有效降低因UVB 刺激產生的ROS。同樣地，當GPS-1 質量濃度分別為200、500 和800 μg/mL 時，HFF-1 中MDA 含量降低，分別為4.9、3.4、2.9 nmol/mL（P＜0.01），呈劑量依賴性。與UVB 照射組相比，當GPS-1 質量濃度分別為200、500 和800 μg/mL 時，SOD 含量分別提高了32.5%、75.0%、128.9%（P＜0.01），說明GPS-1 顯著提升HFF-1 細胞SOD 活力。與UVB 照射組相比，當GPS-1 質量濃度分別為200、500 和800 μg/mL 時，GSH-Px 含量分別提高了29.7%、59.9%、108.3%（P＜0.01），說明GPS-1 可以調節HFF-1 細胞GSH-Px 含量。在衰老細胞中，ROS 和MDA 含量顯著增加，SOD 和GSH-Px 酶活力顯著降低，在該模型下，GPS-1 能有效減少細胞中ROS 和MDA 含量，有效提高SOD 和GSH-Px 酶活力，說明GPS-1 能夠通過減少ROS 含量，防止細胞產生氧化應激，對MDA 的產生具有抑制作用，降低細胞氧化損傷，同時促進細胞內SOD 和GSH-Px 活力提升，提高細胞抗氧化能力，從而幫助細胞對抗由UVB 誘導引起的細胞衰老。

圖7 GPS-1 對HFF-1 細胞內SOD（a）、MDA（b）、ROS（c）、GSH-Px（d）、MMP-1（e）和MMP-9（f）的影響Fig.7 Effects of GPS-1 on SOD (a), MDA (b), ROS (c), GSH-Px (d), MMP-1 (e) and MMP-9 (f) in HFF-1 cells

基質金屬蛋白酶（MMPs）是一種具有廣泛特異性的而且幾乎可以分解所有細胞外基質成分的水解酶。MMP-1 特異性降解I 型膠原蛋白，使得I、III 型膠原比例下降，MMP-9 作為一種明膠酶，可以繼續降解MMP-1 降解產物，導致皮膚膠原蛋白流失，繼而發生衰老發生[30]。如圖7e、圖7f 所示，與UVB線照射組相比，低劑量的人參多糖即可極顯著降低HFF-1 細胞內MMP-1 和MMP-9 的含量（P＜0.01），而當添加高劑量的人參多糖時，MMP-1 和MMP-9 含量接近正常未經UVB 照射組細胞內水平，說明人參多糖可以抑制MMP-1 和MMP-9 的表達，達到減少膠原分解的功效，改善細胞結構，從而具有延緩皮膚衰老的效果。

3 結論

本實驗以人參為原料，通過提取分離純化得到人參精多糖。采用高效凝膠滲透色譜法對人參精多糖進行分析，結果表明該人參多糖為均一性多糖，相對分子質量為2.104 kDa，多糖純度為95.13%，另外通過紅外光譜、核磁譜圖對人參結構進行了初步分析。進一步利用UVB 照射HFF-1 細胞模型，通過ROS、MDA、SOD、GSH-Px、MMP-1 和MMP-9 等指標的測定，對人參精多糖進行抗皮膚衰老的探究。實驗結果表明人參精多糖可有效去除細胞中的ROS，抑制MDA 的含量，緩解由外源條件（UVB）造成的細胞受損，同時，促進SOD 和GSH-Px 抗氧化酶活提升，提高細胞抗氧化能力，通過維持氧化還原平衡來達到抗衰老的作用，為皮膚提供有利的組織環境；此外，人參精多糖還可抑制MMP-1 和MMP-9 的表達，達到減少膠原分解的功效，維持皮膚彈性，延緩皮膚衰老。因此，人參多糖具有一定的抗皮膚衰老作用，可作為一種延緩衰老功效原料，應用于化妝品、保健品等領域，可以有力提升人參的市場競爭能力，進一步提高經濟效益。