干旱脅迫對(duì)鐵皮石斛生理及不同部位活性成分的影響

楊秋悅 羅影子 楊洋 阮寶麗 黃明進(jìn)

摘要：為了探究干旱脅迫對(duì)鐵皮石斛生理及品質(zhì)的影響，為鐵皮石斛栽培提供理論基礎(chǔ)。試驗(yàn)采用盆栽控水模擬干旱條件，設(shè)置4個(gè)水分處理，分別為濕潤(rùn)水分處理（CK）、輕度干旱脅迫（H）、中度干旱脅迫（M）、重度干旱脅迫（L），研究不同水分處理下鐵皮石斛生理生化指標(biāo)及活性成分的變化。結(jié)果表明，干旱脅迫對(duì)莖粗、葉片含水量、丙二醛含量無(wú)顯著影響，而生物量積累減少；鐵皮石斛在干旱脅迫下以葉綠素含量、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量增加來(lái)抵御脅迫，且莖葉不同部位的多糖、總黃酮、總酚、總氨基酸含量均增加，證明脅迫可促進(jìn)鐵皮石斛品質(zhì)的提升。對(duì)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析可知，株高、莖粗、根鮮質(zhì)量、葉綠體色素含量、抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、多糖含量、總黃酮含量、總氨基酸含量等可作為鐵皮石斛耐旱性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。研究表明，輕度干旱對(duì)鐵皮石斛各指標(biāo)無(wú)明顯影響，而活性成分含量在重度干旱脅迫下達(dá)到峰值，且對(duì)生長(zhǎng)不造成影響，證明鐵皮石斛對(duì)干旱有較強(qiáng)的忍耐力，可在采收前進(jìn)行適度的干旱脅迫從而提高品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；干旱脅迫；生理；活性成分

中圖分類號(hào)：S567.23+9.01? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）13-0142-07

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬草本植物。石斛屬植物主要含有生物堿、多糖、聯(lián)芐、菲類等藥理成分，具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗炎、抗衰老、抗糖尿病等多種作用［1］。在自然條件下鐵皮石斛主要生長(zhǎng)于一些高大喬木陰濕的樹干或石灰?guī)r上，主要栽培模式為附樹、附石、大棚栽培［2-3］，除了大棚栽培鐵皮石斛需定期澆水外，林下仿野生栽培的鐵皮石斛在自然生長(zhǎng)過(guò)程中都經(jīng)受著干旱脅迫。干旱脅迫會(huì)影響植物的各種生理過(guò)程，表觀上會(huì)使植株矮小、葉片萎蔫，還會(huì)影響植株的生物量積累、光合作用、滲透調(diào)節(jié)、次生代謝等過(guò)程［4-6］。植物對(duì)于干旱具有一定的耐受力，但在不同的物種間差異較大，水分缺失對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有一定的影響。目前關(guān)于鐵皮石斛的研究主要在化學(xué)成分、藥理作用、人工栽培及加工產(chǎn)品等方面［7-8］。關(guān)于鐵皮石斛干旱脅迫，前人曾研究過(guò)逆境脅迫下鐵皮石斛愈傷組織保護(hù)酶系統(tǒng)的抵御能力，結(jié)果顯示過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ASP）4種酶活性都呈現(xiàn)適度升高再降低趨勢(shì)［9］，還探究過(guò)內(nèi)生真菌對(duì)干旱脅迫下鐵皮石斛生長(zhǎng)的影響，研究顯示菌根真菌能提高鐵皮石斛的抗旱性［10-11］，以及人工補(bǔ)充外源鈣能增強(qiáng)鐵皮石斛愈傷組織可溶性蛋白的表達(dá)，減緩干旱脅迫的傷害［12］。目前關(guān)于鐵皮石斛干旱脅迫下生理生化響應(yīng)研究較多，但結(jié)合生理指標(biāo)和活性成分在干旱脅迫下變化的研究較少，因此本研究以鐵皮石斛為研究對(duì)象，探索在干旱脅迫下生物量積累、生理及活性成分的變化，以期為鐵皮石斛的栽培及利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料為來(lái)自貴州省黔東南苗族侗族自治州錦屏縣的鐵皮石斛錦斛1號(hào)，是已認(rèn)定品種（認(rèn)定編號(hào)：黔認(rèn)20210012），經(jīng)貴州大學(xué)黃明進(jìn)副教授鑒定為蘭科植物鐵皮石斛。挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的一年生鐵皮石斛苗，整叢移栽于深17 cm、內(nèi)徑22 cm的白色塑料花盆中，所用基質(zhì)為樹皮、木屑，材料均一。

該試驗(yàn)于2021年9—10月在貴州大學(xué)石斛研究院內(nèi)溫室中進(jìn)行，試驗(yàn)設(shè)計(jì)參照巫曉璐的方法［13］：依據(jù)基質(zhì)含水量的不同設(shè)置4個(gè)處理：（1）重度干旱脅迫（L）：相對(duì)含水率為25%～30%；（2）中度干旱脅迫（M）：相對(duì)含水率為40%～45%；（3）輕度干旱脅迫（H）：相對(duì)含水率為55%～60%；（4）濕潤(rùn)水分處理（CK）：相對(duì)含水率為70%～75%。每個(gè)處理20個(gè)重復(fù)，盆栽于電子秤上稱質(zhì)量澆水，先澆至飽和含水量再逐步控制其達(dá)到所設(shè)定的水分條件，每天于 17：00 對(duì)各花盆進(jìn)行稱質(zhì)量，并補(bǔ)充水分使盆栽達(dá)到所設(shè)定的水分范圍（所澆的水為沉淀后的清水）。當(dāng)不同的水分處理達(dá)到設(shè)定條件后，于脅迫50 d后對(duì)植株進(jìn)行采樣，每個(gè)處理采3叢，測(cè)定指標(biāo)。飽和含水量以栽培基質(zhì)含水量達(dá)到飽和狀態(tài)為準(zhǔn)，基質(zhì)含水量=（鮮質(zhì)量-干質(zhì)量）/（飽和含水量-干質(zhì)量）×100%。

1.2 試劑與儀器

試劑：無(wú)水乙醇（購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、蕓香苷對(duì)照品（均購(gòu)自羅恩試劑）；硫酸、磷酸、氫氧化鈉、甲醇（均購(gòu)自貴州福泉川東化工有限公司）；蒽酮、碳酸鈉（均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；蔗糖對(duì)照品、無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、石英砂、碳酸鈣、苯酚（均購(gòu)自成都金山化學(xué)試劑有限公司）；福林酚溶液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；沒(méi)食子酸對(duì)照品購(gòu)自麥克林試劑公司；所有試劑藥品均為分析純。

儀器：百分之一天平Y(jié)P3002N、千分之一天平JA2003N（上海菁海儀器有限公司），電熱恒溫水槽DK-80（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），超聲波清洗機(jī)SB-5002DT（寧波新芝生物科技股份有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6（常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司），離心機(jī)TDL20M/TD4-WS（鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），酶標(biāo)儀SpectraMax ABS Plus［美國(guó)美谷分子儀器（上海）有限公司］，分光光度計(jì)UV-2600i（日本島津公司）。

1.3 測(cè)定方法

用直尺測(cè)定株高；用游標(biāo)卡尺測(cè)定莖粗；葉片含水量采用烘干法測(cè)定［13］；生物量用百分之一天平稱定；用96%乙醇研磨法測(cè)定葉綠素含量［14］；CAT活性用紫外吸收法測(cè)定，SOD活性用氮藍(lán)四唑法測(cè)定，POD活性用愈創(chuàng)木酚法，用北京盒子生工科技有限公司試劑盒進(jìn)行測(cè)定；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定，脯氨酸（Pro）含量采用酸性茚三酮比色法，用北京盒子生工科技有限公司試劑盒進(jìn)行測(cè)定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定［15］；可溶性糖含量采用蒽酮-硫酸法測(cè)定［16］；多糖含量利用苯酚-硫酸法測(cè)定［17］；總黃酮含量采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法［18-19］測(cè)定；總酚含量采用福林酚法測(cè)定［20］；總氨基酸含量采用茚三酮比色法測(cè)定［21］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016整理數(shù)據(jù)及繪圖，SPSS 26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫處理對(duì)錦斛1號(hào)生物量及葉片含水量的影響

由表1可知，不同干旱脅迫處理鐵皮石斛株高和莖、葉鮮質(zhì)量間存在差異，在莖粗、葉片含水量、根鮮質(zhì)量指標(biāo)中無(wú)顯著差異。L與H、CK處理在株高間無(wú)顯著差異，M與L、CK處理間存在顯著差異，M處理比L、CK處理株高分別減少37.35%、40.28%。莖、葉鮮質(zhì)量趨勢(shì)一致，M與CK處理間存在顯著差異，其他處理間無(wú)顯著差異。

2.2 干旱脅迫處理對(duì)錦斛1號(hào)葉綠素含量的影響

由表2可知，不同干旱脅迫處理鐵皮石斛葉綠素含量無(wú)顯著差異，但總體呈隨著水分減少而增加的趨勢(shì)。L處理下葉綠素a含量比M、H、CK處理分別增多12.11%、6.58%、20.64%；L處理下葉綠素b含量比M、H、CK處理分別增多8.19%、2.59%、12.81%；L處理下類胡蘿卜含量比M、H、CK處理分別增多15.65%、9.02%、27.88%；L處理下葉綠體色素含量比M、H、CK處理分別增多10.69%、5.84%、18.85%。

2.3 干旱脅迫處理對(duì)錦斛1號(hào)抗氧化酶活性的影響

由圖1可知，干旱脅迫處理下鐵皮石斛CAT、POD活性隨著水分減少整體呈下降趨勢(shì)，SOD活性總體呈增加趨勢(shì)。L處理下CAT活性與M、H、CK處理間均存在顯著差異，分別減少64.65%、62.16%、61.96%；對(duì)于POD活性，L處理與CK處理間存在顯著差異，其他處理間無(wú)顯著差異，L處理下POD活性較M、H、CK處理分別減少66.13%、61.11%、86.18%；4個(gè)處理間SOD活性無(wú)顯著差異，L、M、H處理較CK處理分別增加14.21%、90.86%、29.94%。

2.4 干旱脅迫處理對(duì)錦斛1號(hào)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及丙二醛含量的影響

由圖2可知，不同干旱脅迫處理下鐵皮石斛可溶性糖含量存在顯著差異，可溶性蛋白含量L處理與M、H、CK處理存在顯著差異，脯氨酸和丙二醛含量無(wú)顯著差異，呈先減后增趨勢(shì)。可溶性糖含量隨著水分含量的減少呈增加趨勢(shì)，L、M、H處理較CK處理分別增加24.25%、5.47%、11.48%；L處理可溶性蛋白含量與其他3個(gè)處理間存在顯著差異，L、M、H處理較CK處理分別增加73.41%、減少19.43%、增加20.70%；脯氨酸含量L、M、H處理較CK處理分別增加1.46%、減少14.60%、減少29.20%；丙二醛含量4個(gè)處理間無(wú)顯著差異。

2.5 干旱脅迫處理對(duì)錦斛1號(hào)不同部位多糖、總黃酮、總酚及總氨基酸含量的影響

由表3知，重度干旱脅迫處理下鐵皮石斛莖葉多糖、莖葉總黃酮、莖葉總酚含量增加，莖總氨基酸含量增加，葉總氨基酸含量無(wú)明顯變化。鐵皮石斛莖多糖含量隨水分減少呈先減后增趨勢(shì)，在L處理下莖多糖含量最高，葉多糖趨勢(shì)相同，在L處理下有最大值；鐵皮石斛莖總黃酮含量隨水分的梯度減少先減后增，在L處理時(shí)含量最高，在H處理下含量最高，其中H處理和CK處理莖葉總黃酮含量差異顯著；莖總酚含量在M處理下減少，葉總酚含量在H處理下最高；莖葉總氨基酸含量隨水分減少總體呈增加趨勢(shì)，其中M處理異常，其值略微下降，莖總氨基酸含量在L處理時(shí)最高，且與其他處理間差異顯著，葉總氨基酸含量在H處理時(shí)最高，與其他處理差異顯著。

2.6 干旱脅迫下鐵皮石斛各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

對(duì)鐵皮石斛干旱脅迫下測(cè)定的25個(gè)生理及品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行Person相關(guān)分析，結(jié)果如表4所示：莖鮮質(zhì)量與葉鮮質(zhì)量存在極顯著正相關(guān)；葉綠素a含量與葉綠素b含量呈極顯著正相關(guān)； 類胡蘿卜素與葉綠素a、葉綠素b含量呈極顯著正相關(guān)；葉綠體色素含量與葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量呈極顯著正相關(guān)；SOD活性與株高呈極顯著負(fù)相關(guān)；POD活性與莖鮮質(zhì)量呈顯著正相關(guān)，與葉鮮質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)；CAT活性與葉綠素a含量呈顯著負(fù)相關(guān)；可溶性糖含量與CAT活性呈極顯著負(fù)相關(guān)；可溶性蛋白含量與葉片含水量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)；莖多糖含量與葉綠素a、類胡蘿卜素、葉綠體色素含量呈顯著正相關(guān)，與CAT活性呈顯著負(fù)相關(guān)；葉總黃酮含量與莖粗呈顯著負(fù)相關(guān)；莖總酚含量與莖粗、葉片含水量呈顯著負(fù)相關(guān)，與可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)；葉總酚含量與POD活性呈顯著負(fù)相關(guān)；莖總氨基酸含量與葉片含水量呈顯著負(fù)相關(guān)，與CAT活性呈極顯著負(fù)相關(guān)，與可溶性糖、可溶性蛋白含量呈極顯著正相關(guān)；葉總氨基酸含量與莖粗呈極顯著負(fù)相關(guān)，與莖總黃酮呈顯著負(fù)相關(guān)，與莖總酚含量呈極顯著正相關(guān)。

2.7 干旱脅迫下鐵皮石斛各指標(biāo)間的主成分分析

對(duì)鐵皮石斛干旱脅迫下的25個(gè)生理及品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如表5所示，提取3個(gè)主成分因子，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)89.271%。第1主成分的貢獻(xiàn)率為47.483%，其主要影響因子包括根鮮質(zhì)量、葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量、葉綠體色素含量、PRO含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、莖多糖含量、莖總氨基酸含量，主要反映干旱脅迫對(duì)葉綠素含量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及莖活性成分的影響；第2主成分的貢獻(xiàn)率為30.127%，其主要影響因子包括株高、莖粗、SOD活性、莖總黃酮含量、葉總氨基酸含量，主要反映干旱脅迫對(duì)農(nóng)藝性狀、酶活性及活性成分的影響；第3主成分的貢獻(xiàn)率為11.661%，其主要影響因子包括MDA含量，主要反映干旱脅迫對(duì)膜脂過(guò)氧化的影響。綜上所述，株高、莖粗、葉綠體色素含量、可溶性蛋白含量、莖總黃酮含量、莖總氨基酸含量、葉總氨基酸含量這幾個(gè)指標(biāo)的影響比較大，可以作為鐵皮石斛耐旱性的鑒定指標(biāo)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫對(duì)鐵皮石斛的莖粗、葉片含水量無(wú)顯著影響，隨著水分含量的減少，莖、葉鮮質(zhì)量都減少，表明干旱脅迫能抑制生物量積累，根鮮質(zhì)量在L處理下出現(xiàn)最小值，應(yīng)該是由于基質(zhì)水分含量低，根系水分吸收少。莖和葉鮮質(zhì)量則是在M處理下出現(xiàn)最小值，這和在紫花苜蓿、毛竹中的研究結(jié)果相同，干旱脅迫下地上和地下部分的生物量減少，阻礙根系對(duì)水分養(yǎng)分的吸收［22-23］。

對(duì)于干旱脅迫對(duì)葉綠素含量變化的影響，有相當(dāng)一部分研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下葉綠體色素含量降低，干旱抑制光合色素的生成，甚至在重度干旱下色素會(huì)分解［24-25］，但也有部分研究證實(shí)在干旱脅迫下葉綠素含量不降反升［5，26］。本研究中干旱脅迫下鐵皮石斛光合色素含量，隨著基質(zhì)水分的減少而增加，目前關(guān)于水分脅迫對(duì)葉綠素含量的影響機(jī)制尚不清楚，但本現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是水分脅迫減弱了植物光合作用，植物通過(guò)提高葉綠素含量來(lái)維持光合速率［27］，這種現(xiàn)象在耐旱性強(qiáng)的植物中較為常見(jiàn)，保持高葉綠素含量能夠維持生長(zhǎng)速率，也有可能是干旱脅迫后產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)增加葉綠素含量來(lái)緩解和抵御干旱脅迫對(duì)植株的傷害［28］。

抗氧化酶系統(tǒng)能有效清除多余活性氧（ROS）是植物適應(yīng)逆境脅迫的主要機(jī)制之一，前人研究證實(shí)植物在脅迫狀態(tài)下，保護(hù)酶活性一般隨脅迫加劇而升高，或表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢(shì)［5，29］。本研究中CAT活性在輕中度干旱脅迫下增強(qiáng)，但在重度干旱脅迫下下降；SOD活性在干旱脅迫下均增加，在中度干旱脅迫下達(dá)到峰值，證明鐵皮石斛通過(guò)增加CAT、SOD活性來(lái)清除體內(nèi)活性氧，以此適應(yīng)干旱；而POD活性則在干旱脅迫下減少，或許是由于脅迫時(shí)間較長(zhǎng)，使保護(hù)酶失活，因此其活性降至對(duì)照水平以下。

前人多項(xiàng)研究曾表明，干旱脅迫會(huì)引起生理生化物質(zhì)的增加來(lái)增強(qiáng)抗逆性，如增加脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量［30］，在甜高粱幼苗中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的增加是其響應(yīng)干旱脅迫的重要表現(xiàn)［31］。本研究中可溶性糖含量在干旱脅迫下均增加，且各處理間差異顯著；可溶性蛋白含量?jī)H在中度干旱脅迫下減少，在輕度及重度脅迫下均增多；脯氨酸含量在輕度、中度干旱脅迫下減少，當(dāng)水分減少至重度脅迫后含量增加，證明鐵皮石斛具有抵抗干旱脅迫的能力，且在重度干旱脅迫下較為明顯。丙二醛作為膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成損壞，其含量反映膜脂過(guò)氧化的受損程度［32］。本研究中不同干旱脅迫下的MDA含量與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，沒(méi)有明顯增多，表明鐵皮石斛對(duì)干旱脅迫具有較強(qiáng)的抵御能力，能夠?qū)DA含量控制在較低的范圍從而不對(duì)細(xì)胞膜造成影響，這和在蒭雷草、抗旱型結(jié)縷草、谷子中的研究結(jié)果相同［33-35］。

對(duì)于藥用植物而言，其活性成分的含量比較重要，研究發(fā)現(xiàn)脅迫能夠促進(jìn)植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的增加，有利于藥材品質(zhì)的提高，這一點(diǎn)在黨參［36］、紫蘇［6］、銀柴胡［37］等藥材中均得到了驗(yàn)證。前人的研究中發(fā)現(xiàn)總酚和總黃酮是其重要的次生代謝產(chǎn)物，總酚可以提高植物對(duì)干旱的耐受性，而總黃酮的抗氧化能力會(huì)緩解植物細(xì)胞的膜脂過(guò)氧化情況［38］。本研究中，莖葉多糖、總黃酮、總酚含量整體在干旱脅迫下增加，莖總氨基酸含量在干旱脅迫下整體增多。由此可以看出，鐵皮石斛在經(jīng)受干旱脅迫后，其多糖、總黃酮、總酚含量整體均上升，在抵御干旱的同時(shí)還提升了藥材的品質(zhì)，因此在栽培中可以進(jìn)行適度的干旱脅迫來(lái)提升藥材的品質(zhì)含量，且隨外界環(huán)境而改變其水分含量。

4 結(jié)論

綜上所述，干旱脅迫對(duì)植物的影響是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，對(duì)于鐵皮石斛而言，通過(guò)增加葉綠素含量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、次生代謝產(chǎn)物和抗氧化酶活性來(lái)抵御干旱脅迫，同時(shí)抑制丙二醛的過(guò)度形成來(lái)保護(hù)細(xì)胞膜維持正常生理活動(dòng)。通過(guò)對(duì)各指標(biāo)的分析，發(fā)現(xiàn)輕度脅迫與對(duì)照間差異不顯著，而有些指標(biāo)在重度干旱下達(dá)到峰值（可溶性糖、可溶性蛋白、多糖、總黃酮含量等），因此在實(shí)際生產(chǎn)中可以動(dòng)態(tài)化控制栽培鐵皮石斛的水分含量來(lái)提高其品質(zhì)，平時(shí)可控制在輕度干旱水平，采收前可進(jìn)行適度的干旱來(lái)提升藥用品質(zhì)。

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