微陣列芯片技術在耐多藥結核病臨床診斷中的應用研究

張國翠，王建，勞海黎，張盟，孟慶捷

微陣列芯片技術在耐多藥結核病臨床診斷中的應用研究

張國翠，王建，勞海黎，張盟，孟慶捷

濱州市中心醫院檢驗科，山東濱州 251700

探討微陣列芯片技術在耐多藥結核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）臨床診斷中的應用。收集2020年6月至2021年5月經濱州市中心醫院確診的245例住院肺結核患者的標本（痰液標本125例和痰培養分離菌株120例）。痰液標本同時采用DNA微陣列芯片技術和傳統培養法檢測其結核桿菌陽性率。痰液標本和分離菌株均采用DNA微陣列芯片技術進行肺結核耐多藥檢測和分枝桿菌菌種鑒定。125例痰液標本經DNA微陣列芯片技術和痰培養法檢測，陽性率分別為58.4%（73/125）和24.8%（31/125），兩種方法比較差異有統計學意義（2=14.520，<0.001）。采用DNA微陣列芯片技術檢測125例痰液標本和120例分離菌株，共檢出結核分枝桿菌復合群192例，非結核分枝桿菌7例。結核分枝桿菌復合群192例檢出耐藥者41例，其中耐異煙肼15例，耐利福平19例，同時耐兩種藥物7例。非結核分枝桿菌包括胞內分枝桿菌4例，堪薩斯分枝桿菌2例，鳥分枝桿菌1例。DNA微陣列芯片技術檢測周期短，能同時進行結核分枝桿菌耐多藥檢測和菌種鑒定，對MDR-TB的早期診斷和治療有較大的臨床應用價值。

肺結核；非結核分枝桿菌；耐多藥肺結核病；異煙肼；利福平

世界衛生組織報道的全球每年新發耐多藥結核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）患者37.8萬例，中國的新發病例數約11萬[1-3]。我國結核病控制的總體形勢仍然嚴峻，耐藥結核病尤其是MDR-TB是目前結核病防治的重點和難點。MDR-TB引起的高發病率及高病死率在結核病控制中引起更多的關注[2-4]。傳統耐多藥檢測方法耗時且敏感度較低，無法滿足臨床需求，本研究利用DNA微陣列芯片技術快速診斷和鑒別診斷肺結核及其耐藥情況，為臨床早期診斷治療提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源

收集2020年6月至2021年5月經濱州市中心醫院確診的245例住院肺結核患者的標本（痰液標本125例和痰培養分離菌株120例）。納入標準：符合《肺結核診斷 WS 288—2017》中診斷標準；有肺結核典型臨床癥狀；經影像學檢查，肺部有活動性肺結核病變。排除標準：合并其他肺部疾病；精神異常患者。納入患者中男127例，女118例，年齡18～76歲，平均年齡46.9歲。所有患者均簽署知情同意書，本研究經濱州市中心醫院內部倫理委員會批準（倫理審批號：2020005）。

1.2 試劑和儀器

晶芯?結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒（DNA微陣列芯片法）和晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（DNA微陣列芯片法）購自博奧生物技術有限公司。使用儀器有ABI500熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀；晶芯?E-Cycler?96 PCR儀；晶芯?BioMixer?Ⅱ芯片雜交儀；晶芯?SlideWasher?芯片洗干儀；晶芯?LuxScan?10K/B微陣列芯片掃描儀等。

1.3 方法

125份合格痰液標本取半量（約2.5ml）加入兩倍體積4%NaOH溶液，震蕩15min，取0.1ml液化痰液接種酸性羅氏培養基中，37℃孵育，4周報告結果，操作按《分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊》[5]要求；剩余半量（約2.5ml）痰液標本加入兩倍體積4%NaOH溶液，反復震蕩后靜置30min，取1ml液化痰液加入1.5ml離心管中，高速離心（14 000轉/min）10min，棄上清，加1ml生理鹽水于沉淀中離心（15 000轉/min）10min，棄上清，再加50μl核酸提取液于沉淀中，充分震蕩，100℃金屬浴10min，離心（15 000轉/min）5min，取其上清作為反應模板，然后進行PCR擴增、芯片雜交和掃描判讀。

120例患者支氣管肺泡灌洗液經BACTEC MGIT 960培養報告陽性的分離菌株，用取菌環直接挑取單個菌落加入80μl核酸提取液中，置100℃金屬浴10min，離心5min，取上清。所得核酸進行PCR擴增、芯片雜交和掃描判讀。結核分枝桿菌耐多藥檢測和分枝桿菌菌種鑒定實驗嚴格按《結核病實驗室標準化操作與網絡建設》[6]基因芯片法標準操作規程進行。

1.4 質量控制

每個標本進行耐藥檢測時，芯片內部設有內部質控。一個分枝桿菌屬質控，一個結核分枝桿菌質控，2個芯片制備質控，2個芯片雜交質控，一個空白對照質控，一個陰性對照質控，以及靶基因ropB、KatG和inhA擴增質控。如果其中任何一個質控結果錯誤，則標本結果定位無效，需要進行復檢；每個標本進行實時熒光定量PCR檢測時設有空白對照質控、陰性對照質控、陽性對照質控、四個濃度的標準曲線。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 兩種方法檢測痰液的結核桿菌陽性率比較

125份痰液標本采用DNA微陣列芯片技術和痰培養法檢測，DNA微陣列芯片技術檢出陽性73例（58.4%），痰培養法檢出陽性31例（24.8%），兩種方法檢出陽性結果比較差異有統計學意義（2=14.520，<0.001）。

2.2 125例痰液和120例分離菌株的菌種鑒定情況

采用DNA微陣列芯片技術檢測125例痰液和120例分離菌株，共檢出結核分枝桿菌復合群192例（痰液73例，分離菌株119例），非結核分枝桿菌7例（痰液6例，分離菌株1例）。7例非結核分枝桿菌包括胞內分枝桿菌4株，堪薩斯分枝桿菌2株，鳥分枝桿菌1株。

2.3 192例結核分枝桿菌復合群耐多藥檢測情況

DNA微陣列芯片技術檢測結核分枝桿菌復合群192例，檢出野生型151例，耐藥者41例，總耐藥率21.4%；其中，檢出耐異煙肼（isoniazid，INH）單藥者15例（7.8%），耐利福平（rifampicin，RIF）單藥者19例（9.9%）；同時耐INH和RIF者7例（3.6%），其基因型分布見表1。

3 討論

MDR-TB是指同時對包括INH和RIF兩種或兩種以上抗結核藥物發生耐藥的結核分枝桿菌所致的結核病。傳統MDR-TB的表型診斷方法主要有絕對濃度法和比例法，上述兩種方法必須在獲得菌株的基礎上進行藥敏試驗，耗時較長且培養的敏感度較低，導致部分患者漏診或不能及時被檢出。DNA微陣列芯片技術在固相載體上很小面積內包被多達千萬個核酸分子，組成微點陣列，在一定條件下載體上的核酸分子可與來自標本互補的核酸片段雜交，然后把標本中的核酸片段進行標記，在專用的芯片閱讀儀上可檢測到雜交信號，敏感度和特異性較高。DNA微陣列芯片技術操作僅需兩步，即擴增和雜交，可將檢測時間由傳統方法的2～3個月縮短到6h左右，檢測RIF和INH耐藥情況的同時還能完成菌種鑒定分型。

表1 耐藥結核桿菌DNA微陣列芯片法檢測結果

研究顯示，采用DNA微陣列芯片技術檢測的INH和RIF總耐藥率為17.81%～27.5%，耐多藥率為6.85%，INH和RIF單耐藥率分別為13.3%、7.5%[1-4]。本研究DNA微陣列芯片技術共檢測245例患者，結核分枝桿菌檢出率78.4%，總耐藥率21.4%，INH、RIF耐藥率分別7.8%和9.9%，耐多藥率3.6%。本研究結果顯示，41例耐藥者基因突變位點前兩位的是katG315（G→C）突變型、rpoB531（C→T）突變型，其突變發生率分別為36.6%（15/41）和39.0%（16/41），與相關研究有所差異[7]。

國內報道，臨床分離株藥物作用靶基因發生突變是結核分枝桿菌產生耐藥的主要分子機制，現已發現96%耐RIF菌株的rpoB基因中一個81bp區域出現點突變；耐INH菌株中約70%與katG基因突變有關，20%～35%與inhA基因調節區突變有關，katG/inhA位點總突變率為35.1%（33/94）[8-10]。

非結核分枝桿菌感染有逐年升高趨勢，由1984年的4.2%升至2010年的22.9%[9]。山東省2625株分離菌株檢出36株非結核分枝桿菌，占1.4%，其中29株為胞內分枝桿菌（80.6%）[10]。北京市721株分離菌株檢出非結核分枝桿菌93株（12.9%），以膿腫分枝桿菌占首位[11]。上海市877株分離菌株PCR快速鑒定法檢出非結核分枝桿菌96株（10.9%）[12]。本研究結果中，非結核分枝桿菌占比2.9%（7/245），胞內分枝桿菌居首位，其次為堪薩斯分枝桿菌和鳥分枝桿菌。提示我國非結核分枝桿菌發病率有一定差異，可能與患者所在區域、生活環境和生活習性有關。

綜上所述，DNA微陣列芯片技術檢測周期短，操作簡單，能同時進行結核分枝桿菌耐多藥檢測和菌種鑒定，對MDR-TB的早期診斷和治療有較大的臨床應用價值。

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Application of microarray chip technology in clinical diagnosis of multidrug resistant tuberculosis

Department of Clinical Laboratory, Binzhou Central Hospital, Binzhou 251700, Shandong, China

To explore the application of microarray chip technology in the clinical diagnosis of multidrug resistant tuberculosis (MDR-TB).Samples (125 sputum specimens and 120 strains isolated from sputum culture) were collected from 245 patients diagnosed with pulmonary tuberculosis in Binzhou Central Hospital from June 2020 to May 2021. Sputum samples were tested by DNA microarray chip technology and traditional culture method. DNA microarray chip technology was used to detect multidrug resistance and identify mycobacterium strains in sputum samples and isolated strains.The positive rates of 125 sputum samples were 58.4% (73/125) and 24.8% (31/125) by DNA microarray chip technology and sputum culture, respectively, and the difference between the two methods was statistically significant (2=14.520,<0.001). Using DNA microarray chip technology, 125 sputum samples and 120 isolated strains were detected. A total of 192 mycobacterium tuberculosis complex and 7 nontuberculous mycobacteria were detected. Among 192 cases of mycobacterium tuberculosis complex, 41 cases were drug resistant, including 15 cases resistant to isoniazid, 19 cases resistant to rifampicin and 7 cases resistant to both drugs. Nontuberculous mycobacteria included 4 cases Mycobacterium intracellulare, 2 case Mycobacterium kansasii and 1 case Mycobacterium avium.DNA microarray chip technology has a short detection cycle, can be used to detect multidrug resistance and strain identification of mycobacterium tuberculosis at the same time, and has great clinical application value for early diagnosis and treatment of MDR-TB.

Tuberculosis; Nontuberculous mycobacteria; Multidrug resistant tuberculosis; Isoniazid; Rifampicin

R372

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.22.018

張國翠，電子信箱：15215437913@163.com

（2023–01–15）

（2023–07–18）