TGF-β/Smad信號通路及Smad4、p15在結直腸癌中的研究進展

于陽，楊柳，袁喜先

TGF-β/Smad信號通路及Smad4、p15在結直腸癌中的研究進展

于陽1，楊柳1，袁喜先2

1.佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江佳木斯 154003；2.佳木斯大學附屬第一醫院消化內科，黑龍江佳木斯 154003

結直腸癌是消化系統常見腫瘤之一，其發病率和病死率較高。轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad（small mothers against decapentaplegic）信號通路可調控腫瘤細胞的增殖、分化、浸潤、遷移，與結直腸癌的發生發展過程相關。研究表明，Smad4和p15是TGF-β/Smad信號通路的關鍵效應因子，與腫瘤的侵襲、進展及預后密切相關。本文對TGF-β/Smad信號通路及Smad4、p15在結直腸癌中的最新研究進展進行綜述。

結直腸癌；TGF-β/Smad信號通路；Smad4；p15

1 引言

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化系統常見腫瘤之一。2020年全球癌癥統計報告顯示，CRC的發病率居全球惡性腫瘤第3位，死亡率居全球第2位；而我國CRC的發病率和死亡率均高于世界平均水平[1-2]。CRC的發病較隱匿，早期常無明顯臨床表現，大多數患者被確診時已處于中晚期或已出現遠處臟器轉移，錯過最佳治療時間。惡性腫瘤的發生是較為復雜的過程，常涉及原癌基因的激活及抑癌基因的失活，亦涉及細胞增殖和凋亡的失衡，是多個異常失活、異常表達基因共同作用的結果。轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad（small mothers against decapentaplegic）信號通路在CRC的發生發展過程中起促進作用，且與多條信號通路相互作用，對CRC的細胞分化、增殖、凋亡、轉移起重要作用[3]。

2 TGF-β/Smad信號通路

TGF-β是多肽類細胞因子超家族，具有多種生物學活性。研究表明，TGF-β在腫瘤初期發揮負性調控作用，可抑制腫瘤細胞的增殖；而在腫瘤末期，TGF-β的過度激活可導致上皮間質細胞增殖、促進血管生成、調節免疫應答、促進腫瘤細胞浸潤轉移等[4]。TGF-β經典信號通路由TGF-β受體（TGF-β receptor，TGF-βR）Ⅰ和TGF-βRⅡ共同參與；上述兩種受體的結構類似，包括由100個氨基酸組成的糖基化的富含二硫鍵的胞外結構域、一個跨膜區、一個短的近膜序列和一個細胞質激酶結構域；其中細胞質激酶結構域具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性及酪氨酸激酶活性，因此被歸為雙特異性激酶[5]。游離的TGF-β激活TGF-βRⅡ，從而發生構象改變，TGF-βRⅠ識別并與之結合形成異四聚體復合物；TGF-βRⅠ磷酸化后進一步促進Smad2或Smad3磷酸化，二者與Smad4結合形成異寡聚體，由此產生的Smad復合物由胞漿轉位至細胞核；在細胞核中，Smad復合物通過DNA結合蛋白與特異性DNA序列結合，直接或間接調節靶基因的表達，從而調控細胞周期[3]。在正常的細胞周期調控中，細胞周期蛋白激活周期蛋白依賴性激酶（cyclindependent kinase，CDK），高度磷酸化的視網膜母細胞瘤Rb基因釋放轉錄因子E2F，啟動相關靶基因的表達，細胞周期由G期進展至S期。p21、p16、p15等周期蛋白依賴性激酶抑制因子可直接與細胞周期蛋白/CDK復合物結合，并抑制其表達。TGF-β/Smad信號通路中的任一環節出現異常均可影響細胞周期，導致細胞異常增殖[6]。

3 Smad4

3.1 Smad4的結構與功能

Smad4最初發現于胰腺癌中，在胰腺癌中其又被稱為胰腺癌缺失基因4（deleted in pancreatic cancer 4，DPC4）。Smad4是定位于染色體18q21上的抑癌基因，由12個外顯子和10個內含子組成，可編碼552個氨基酸殘基[7]。其N端和C端分別含有2個高度保守的功能區，即Mad同源1（Mad homology 1，MH1）結構域和Mad同源2（Mad homology 2，MH2）結構域。MH1和MH2結構域均可與特異性轉錄因子相互作用。Smad4 MH2結構域晶體結構分析表明，該分子以同源三聚體的形式存在，可參與DNA的轉錄激活及核定位。Smad4是介導TGF-β/Smad信號通路應答的關鍵效應因子。研究表明，Smad4的異常表達使其無法與其他Smad形成異聚體，TGF-β/Smad信號通路傳導異常，TGF-β的抑制作用減弱，細胞發生免疫逃逸，從而誘導腫瘤細胞的始動[8]。

3.2 Smad4的異常表達

Smad4是細胞發育和生長調控的多功能調節器，其作為抑癌基因在腫瘤細胞的分化、凋亡、增殖過程中起關鍵作用[9]。Smad4的失活與其突變和（或）缺失的位置及功能受損相關。

3.2.1 純合子缺失或雜合子丟失 雜合子丟失（loss of heterozygosity，LOH）通常發生在染色體的5q、18q和17p等位置。在散發性胃腸道腫瘤中可廣泛觀察到染色體18q處發生LOH、Smad4基因的純合子缺失或基因內突變。Iacobuzio-Donahue等[10]對63例患者中的70個Smad4/DPC4錯義突變基因進行研究，結果發現錯義突變76%位于MH2結構域內，18%位于MH1結構域內，只有6%位于接頭區域內，表明Smad4/DPC4錯義突變在MH2結構域編碼區占絕對優勢。MH2結構域突變可阻止Smad4的核質易位，導致信號傳導中斷；MH2結構域的斷裂突變可減弱其本身的轉錄調節功能，致使DNA無法轉錄[11]。

3.2.2 啟動子高甲基化CpG 高甲基化可反映腫瘤調控中發揮作用的基因沉默情況，包括DNA修復、細胞周期調節、促進細胞凋亡或控制與腫瘤相關的關鍵信號網絡[12]。雖然高甲基化相當罕見，但亞硫酸氫鹽DNA測序證實，啟動子的甲基化狀態與Smad4表達缺失存在顯著相關性。

3.2.3 Smad4突變導致泛素化增加 越來越多的研究證據表明，泛素化和蛋白酶體降解也與腫瘤衍生的Smad突變體有關，可能誘導腫瘤細胞進展。現已發現，有多種靶向Smad4進行降解的E3泛素-蛋白質連接酶，其具有較高的蛋白質水平，可增加受體和Smad4的降解速率，從而終止信號通路傳導[13]。

3.3 Smad4與CRC的發生

在CRC中，Smad4可與多種轉錄因子、轉錄激活物及阻遏因子相互作用，通過調節多條信號通路發揮作用，促進腫瘤細胞發育，從而導致CRC的發生[14]。

3.3.1 Smad4與β-連環蛋白（β-catenin） 經典Wnt/β- catenin信號通路在干細胞的生長發育及腫瘤細胞的發育、誘導分化中起決定作用。90%的CRC都與此信號通路相關靶點的突變密切相關。當Wnt/β-catenin信號通路處于失活狀態時，胞內由軸抑制蛋白、腺瘤性結腸息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）蛋白、酪蛋白激酶及糖原合成酶激酶3β構成的降解復合體可促使游離的β-catenin持續降解，使其在胞內處于較低水平。當Wnt/β-catenin信號通路處于激活狀態時，組成胞內復合體的基因會發生突變，導致復合體的結構和功能發生改變，β-catenin無法被降解，在胞內不斷穩定積聚，最終向核內轉移，從而激活下游靶基因[15]。因此，β-catenin在胞內不斷累積并進入細胞核內是其傳遞下游信號并激活靶基因轉錄的關鍵事件。研究發現，Smad4可降低人CRC細胞株SW480中相對熒光素酶活性，表明Smad4與Wnt/β-catenin信號的減少、β-catenin/轉錄因子靶基因表達的減少及E-鈣黏蛋白表達的誘導有關[16]。Freeman等[17]研究發現，CRC患者組織樣本中的Smad4水平降低與β-catenin信使RNA水平升高有關，Smad4缺失與β-catenin信使RNA水平的增加及Wnt靶基因表達的增加相關。

3.3.2 Smad4誘導E-鈣黏蛋白 E-鈣黏蛋白是建立和維持細胞黏附和上皮分化的關鍵分子。作為腫瘤抑制因子，其功能性下調在腫瘤細胞表達及轉移過程中十分重要，涉及細胞間黏附、細胞存活、局部侵襲、內滲和外滲變化[18]。Ioannou等[19]研究發現，Smad4與E-鈣黏蛋白轉錄調控呈負相關，E-鈣黏蛋白很有可能是CRC發生中Smad4的靶基因。另外，Smad4可能與腫瘤細胞的淋巴侵襲相關。綜上，Smad4被認為是人CRC上皮間質轉化的中心成分，其與轉錄因子結合減少E-鈣黏蛋白的表達并改變上皮表型。

3.3.3 Smad4與APC基因 APC基因是Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵因子，是CRC中最常見的突變基因之一。有學者運用減數分裂法構建在同一染色體上攜帶APC和Smad4兩種突變的復合雜合子，在含有APC和Smad4順式復合雜合子的裸鼠中可觀察到廣泛的黏膜下浸潤及腺癌進展，而單純APC雜合子息肉則無疾病進展；表明在APC基因缺陷小鼠中，剩余野生型Smad4等位基因的丟失可促進腸息肉向CRC進展[20]。

3.4 Smad4在CRC中的意義

Smad4缺失常為CRC發展的晚期事件。作為晚期事件，Smad4的表達缺失常伴隨腫瘤的遠處轉移，其狀態也與腫瘤微環境密切相關。在原位異種移植模型中，Smad4缺陷型CRC細胞可分泌更多的趨化因子CCL9和CCL15，募集CCR1+骨髓細胞，從而促進腫瘤細胞的進一步轉移[21]。

Smad4的缺失與惡性腫瘤的復發及其耐藥性相關。當Smad4缺失時，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/細胞分裂周期蛋白2/凋亡抑制因子survivin信號通路被激活，通過級聯反應可減弱G1/G2細胞周期阻滯，觸發5-氟尿嘧啶的化學敏感性，使其無法發揮胸苷酸合成酶抑制劑的作用，對介導細胞凋亡具有耐藥性[22]；且在產生耐藥性后其對CRC腫瘤細胞的免疫浸潤喪失，使其再次復發[23]。Mizuno等[24]研究顯示，伴有Smad4低水平的Ⅲ期CRC患者的平均總生存時間為1.7年，而Smad4高水平患者的平均生存時間>9年，Smad4的丟失是其發生不良事件的獨立影響因素；另有研究證實，Smad4突變可作為腫瘤不良預后的標志物[25]。

4 p15

4.1 p15的結構及功能

p15位于人染色體9p21上，含有2個外顯子，其編碼的蛋白屬于周期蛋白依賴性激酶抑制因子家族，包含137個氨基酸，分子量為14.7kDa。p15參與細胞周期的調節，與CDK4/6結合，阻止CDK與細胞周期蛋白D的結合，抑制Rb磷酸化，抑制相關基因轉錄，阻止細胞由G1期進入S期[26]。p15是調控細胞周期、減少細胞異常分化的因子之一，多種腫瘤的發生與p15密切相關。

4.2 p15與Smad4

TGF-β可誘導Smad2、Smad3和Smad4形成異源三聚體復合物，Smad2、Smad4在細胞核內與轉錄因子Sp1結合并共同激活Sp1的轉錄活性，Smad3通過間接作用反式激活p15啟動子，p15Ink4B啟動子可誘導細胞生長停滯，使TGF-β對正常上皮細胞的生長發揮抑制作用。研究證實，在TGF-β信號通路誘導的復合物中，p15的激活須有Smad4參與，這進一步肯定Smad4腫瘤抑制因子的作用。Smad4失活的情況下，TGF-β不能誘導p15Ink4B（或p21）表達，從而無法誘導細胞生長停滯[27]。Rajasekaran等[28]研究發現，細胞周期抑制劑p15Ink4B可作為TGF-β/ Smad4誘導的腫瘤抑制功能的重要靶標。

4.3 p15在CRC中的意義

p15啟動子CpG島甲基化失活在CRC的發生發展中起關鍵作用。梁晶等[29]研究發現，p15在正常大腸黏膜、腺瘤、癌癥序列中表達率逐步遞減，大腸癌組織中p15的表達率明顯降低，表明大腸癌中p15的陽性表達率與大腸癌的組織分化程度有關，認為p15表達下調為CRC發生的中晚期事件。作為腫瘤抑制基因，p15表達量的高低與腫瘤的發展及預后密切相關。近年來基因治療逐步進入人們的視野。研究表明長鏈非編碼RNA的過表達可抑制p15表達，從而導致CRC[30]；新型化合物（阿魏酸結合白藜蘆醇）能誘導p15的表達，抑制HCT116細胞的增殖[31]。

5 小結與展望

在腫瘤細胞惡變過程中，TGF-β/Smad信號通路起至關重要的作用[32]。CRC的發生機制較為復雜，是多基因、多途徑共同作用的結果。Smad4和p15在CRC中起關鍵作用，且與CRC的其他信號通路相互作用，進一步介導細胞增殖，抑制凋亡。隨著研究的不斷深入，希望Smad4和p15能為CRC患者帶來治愈的希望。

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（2022–11–06）

（2023–07–18）

R735

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.22.030

袁喜先，電子信箱：1590055933@qq.com