馮斌,楊琦,曹佳
1(北京科技大學(xué) 天津?qū)W院,天津,301830)2(河北大學(xué)附屬醫(yī)院,河北 保定,071000)3(天津生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院,天津,300462)
隨著生物實驗科技的更新迭代以及對于人體生理健康研究的不斷深入,對于人體運動后疲勞狀態(tài)下自由基生物學(xué)的探索受到來自于多個學(xué)科領(lǐng)域科研人員的普遍重視。目前對于運動康復(fù)實踐尤其在生理機能提升的恢復(fù)訓(xùn)練階段,通常以有氧耐力性運動作為主要手段[1-2]。由此分析,產(chǎn)后腰痛患者在運動康復(fù)過程當(dāng)中,承受來自于病理部位生理機能恢復(fù)機制、運動行為超量恢復(fù)機制的雙方面影響,雖不比針對某一肌群的大運動強度刺激所形成運動疲勞的生理變化明顯,但產(chǎn)后腰痛患者通過以人體核心區(qū)域為協(xié)調(diào)的較長時間有氧運動,消耗更多的人體儲備能量大幅提升每分攝氧量,是其運動生理代謝水平增長的重要體現(xiàn),也是造成運動疲勞積累的另外一種表現(xiàn),并且會在體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基,造成脫氧核糖核酸主鏈斷裂、細胞發(fā)生異變、病變等,極易造成產(chǎn)后腰痛患者的二次損傷[3-4]。
鐵棍山藥(DioscoreaoppositaThunb.cv.Tiegun)為薯蕷科薯蕷屬植物,其塊莖使用方式通常分為食用和藥用兩種,其在中國產(chǎn)地集中于河南省焦作市溫縣、沁陽市、武陟縣等地,中醫(yī)學(xué)中對于鐵棍山藥的功效表述為健脾養(yǎng)胃、滋腎養(yǎng)肺等。鐵棍山藥包含了多糖、皂苷、多酚氧化酶、自由氨基酸等豐富的生物活性物質(zhì)以及多種微量元素,對于人體能夠起到良好的降低血糖血脂、提升免疫能力、調(diào)節(jié)激素代謝紊亂、促進組織器官生理損傷的機能康復(fù)與提升等作用,而鐵棍山藥富含的多糖物質(zhì)被視為構(gòu)成的主要活性成分,其作用價值在藥學(xué)領(lǐng)域以及營養(yǎng)補充領(lǐng)域當(dāng)中備受關(guān)注[5]。
鐵棍山藥的多糖提取通常選用水提醇沉法[6],產(chǎn)生了微波、纖維素酶等多糖提取方法。鐵棍山藥的多糖結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,其生物活性與結(jié)構(gòu)呈線性關(guān)系,因此提取方法的差異會造成多糖得率、提取成分、生物活性等直觀的結(jié)果影響。目前對于鐵棍山藥多糖提取,以及鐵棍山藥作為營養(yǎng)補充干預(yù)運動后抗氧化和疲勞恢復(fù)相關(guān)研究成果較少,客觀限制了鐵棍山藥多糖活性的應(yīng)用與推廣[7]。本研究以鐵棍山藥作為研究對象,通過水提醇沉法、微波輔助提取法、纖維素酶法、微波-酶法分別進行鐵棍山藥的多糖提取,并且對不同提取結(jié)果進行體外抗氧化性能測試,將不同方法提取結(jié)果配制飲品作為受試對象運動康復(fù)訓(xùn)練的補充劑,通過雙盲試驗方法,受試者于訓(xùn)練后及次日晨通過血液指標的采集,實現(xiàn)對鐵棍山藥抗氧化及抗運動疲勞的科學(xué)驗證。
鐵棍山藥,購于河南省焦作市溫縣;羥自由基試劑盒、超氧陰離子試劑盒、丙二醛測試盒、超氧化物歧化酶測試盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司;無水乙醇、葡萄糖等均為分析純、DPPH、纖維素酶、α-淀粉酶,北京索萊寶科技有限公司。
勻漿機,上海歐河設(shè)備有限公司;電子天平,天津市德安特傳感技術(shù)有限公司;水浴鍋、干燥箱,常州億通分析儀器有限公司;722S分光光度儀,上海棱光技術(shù)有限公司;MAS-II Plus常壓微波反應(yīng)工作站(滿足微波提取實驗功率與溫度的即刻監(jiān)控與調(diào)節(jié)),上海新儀微波化學(xué)科技有限公司;Pilot2-4LD冷凍干燥機,天津中斯立孚生物技術(shù)有限公司;H1850離心機,深圳三莉科技有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,鄭州華辰儀器有限公司。
1.3.1 鐵棍山藥多糖提取及處理方法
篩選出外形完整的鐵棍山藥進行表面清水處理后去除外皮,以2 mm為標準進行切片,避免因?qū)嶒炛芷趩栴}導(dǎo)致實驗樣本發(fā)生褐變,使用1 g/L檸檬酸以及0.2 g/L維生素C溶液對切片護色30 min,然后冷凍并且研磨粉碎后過80目篩備用。
(1)水提醇沉法[6]:按照料液比1∶9 (g∶mL)進行混合,80 ℃恒溫水浴靜置240 min,8 000 r/min離心15 min,去除上清液。所獲得的沉淀物經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,依據(jù)1∶5(體積比,下同)的配比融入80%乙醇同時進行24 h的醇沉,最后以離心方式獲取沉淀部分并且完成干燥處理,即可得到山藥多糖。(2)微波輔助提取法[8]:將微波儀器設(shè)置功率為650 W,60 min,實驗料液比為1∶12 (g∶mL);80 ℃恒溫水浴240 min后,8 000 r/min離心15 min,以1∶5比例加入80%乙醇后靜置24 h,通過離心方式進行沉淀提取與干燥。(3)微波-酶劑協(xié)同提取法[9]:實驗料液比設(shè)定為1∶6(g∶mL)、微波儀器功率830 W、150 min,酶添加量為0.5 g淀粉酶、0.05 g纖維素酶(50 g山藥粉末),85 ℃恒溫水浴過程當(dāng)中進行緩慢攪動加快溶解速度,8 000 r/min離心15 min,以1∶5比例加入80%乙醇后靜置24 h,通過離心方式進行沉淀提取與干燥。(4)纖維素酶提取法[10]:酶添加量為3%、酶解時間設(shè)置為75 min、酶解溫度設(shè)置60 ℃、料液比1∶30(g∶mL)、0.05 g纖維素(50 g山藥粉末),恒溫水浴過程當(dāng)中進行緩慢攪動加快溶解速度,8 000 r/min離心15 min后以1∶5比例加入80%乙醇后靜置24 h,通過離心方式進行沉淀提取與干燥。
以水提醇沉法為例,鐵棍山藥進行多糖提取得率的計算方式如公式(1)所示:
山藥多糖得率/%=ρ×V/(m×10)×100
(1)
式中:ρ,提取結(jié)果當(dāng)中多糖的質(zhì)量濃度,μg/mL;V,提取結(jié)果的體積,mL;m,鐵棍山藥粉添加的質(zhì)量,g。
1.3.2 鐵棍山藥多糖提取濃度的測定
使用苯酚-硫酸法測定研究當(dāng)中所采用的不同方法提取后鐵棍山藥多糖含量[11]。添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液,用蒸餾水定容至2 mL,不添加葡萄糖的對照管用于對照調(diào)零。在490 nm處測定各管的吸光值,以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制葡萄糖標準曲線為y=10.616x-0.021,R2=0.997。
1.3.3 鐵棍山藥多糖的抗氧化能力
經(jīng)過4種提取方式進行鐵棍山藥多糖的提取后,依據(jù)提取順序進行體外DPPH自由基、·OH的清除能力檢測[12-13],記錄鐵棍山藥不同提取方法及不同濃度多糖對體外抗氧化能力結(jié)果的數(shù)據(jù)[14-15]。
1.3.4 運動后氧自由基消除及抗疲勞能力
以水提醇沉法、微波輔助提取法、微波-酶劑協(xié)同提取法、纖維素酶提取法完成鐵棍山藥多糖提取,配制營養(yǎng)補充劑并且依次劃分試驗組,共分為試驗組A、B、C、D組、對照組1組,每組人數(shù)12人,共60人,產(chǎn)后腰痛患者受試者統(tǒng)計年齡為(30±1.26)歲。通過雙盲試驗研究,在進行封閉式運動康復(fù)28 d過程中,參照GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》并且依據(jù)試驗不同提取方法配制劑量為200 mg/kg體重的鐵棍山藥提取液,對受試者進行不間斷康復(fù)訓(xùn)練后補充,對照組康復(fù)訓(xùn)練后以同體積的水替代。在每日膳食搭配當(dāng)中排除番茄、胡蘿卜、山竹等目前研究成果顯示抗氧化能力較強食物,并且除鐵棍山藥補充劑外不再進行其他營養(yǎng)劑攝入。
所有測試組在周期內(nèi)運動康復(fù)皆采取有氧耐力性運動作為訓(xùn)練手段,受試者、測試人員與教練員對于每日練后營養(yǎng)補充劑成分皆不清楚。由于運動康復(fù)整體周期變化也是受試人員身體機能恢復(fù)到提高的過程,因此在產(chǎn)后腰痛患者運動康復(fù)周期內(nèi),前期訓(xùn)練會導(dǎo)致體能供能物質(zhì)的過量消耗,對于受試者抗氧化能力與抗疲勞能力的測試會存在顯著誤差,所以對于抗氧化與抗疲勞監(jiān)控安排在康復(fù)周期最后一周的周二、周五,進行10 km/h的50 min勻速耐力跑訓(xùn)練,于康復(fù)訓(xùn)練的當(dāng)日清晨、次日清晨以及訓(xùn)練后第2天清晨對所有受試人員進行空腹狀態(tài)下血清睪酮和血清肌酸激酶數(shù)據(jù)采集,在最后一日的康復(fù)訓(xùn)練前、后即刻采集靜脈血進行血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測試。
運用4種不同工藝對山藥多糖進行提取,重復(fù)3次并計算平均數(shù)值,對鐵棍山藥多糖得率如表1所示。以水提醇沉法為參照,微波輔助提取法、纖維素酶法、微波-酶法的多糖得率均顯著提高,并且節(jié)約了提取時間,這也說明在鐵棍山藥的多糖提取過程中對于細胞壁的破壞是影響多糖得率的重要影響因素。

表1 不同提取方法對鐵棍山藥多糖得率的影響
鐵棍山藥的多糖物質(zhì)多存儲于細胞內(nèi)部,而鐵棍山藥細胞壁為纖維素、果膠等物質(zhì)構(gòu)成,因此能夠采用添加單一的酶制劑,例如纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等,或以添加復(fù)合酶等制劑均能達到提升鐵棍山藥細胞壁裂解的功效[6,16],進而促進提取過程當(dāng)中多糖的釋放。鐵棍山藥通過采用微波-酶劑協(xié)同提取法所獲得多糖得率為13.83%,在各提取方法中得率最高的,相對于水提醇沉法所獲得多糖得率提升了83.42%,且反應(yīng)用時縮短90 min。此外微波輔助提取法(9.30%)與纖維素酶提取法(11.55%)相比較而言,后者鐵棍山藥多糖得率較高,這表明在反應(yīng)過程中酶劑對于鐵棍山藥細胞壁裂解的效果優(yōu)于機械式破壁。
與水提醇沉法相比,微波輔助法的鐵棍山藥多糖得率僅小幅提升,也表明微波作用在一定程度上也可能會造成鐵棍山藥多糖降解,從而破壞多糖結(jié)構(gòu),客觀的導(dǎo)致鐵棍山藥多糖的生物活性降低。
鐵棍山藥多糖提取物中主要雜質(zhì)為蛋白類及酚類,為避免因雜質(zhì)產(chǎn)生的誤差,提取后采用Sevag法去除蛋白類雜質(zhì)[17],在完成8次除雜操作之后,利用紫外光譜掃描提取物,波長260和280 nm處無吸收峰,則說明蛋白類雜質(zhì)已被清除。使用Folin-Ciocalteu試劑檢測酚類物質(zhì)殘留[18-19],呈陰性則說明提取物中無酚類雜質(zhì)。
2.3.1 鐵棍山藥多糖清除DPPH自由基的能力
如圖1所示,對DPPH自由基清除能力的量效關(guān)系相關(guān)性較好,隨著多糖濃度的提升清除活性增強。多糖質(zhì)量濃度2 mg/mL時,水提醇沉法的體外DPPH自由基的清除率為69.32%,微波輔助法的清除率為83.11%,微波-酶法及纖維素酶法清除統(tǒng)計結(jié)果分別為94.51%和88.21%。將多糖質(zhì)量濃度調(diào)至3 mg/mL時,纖維素酶、微波輔助酶2種提取方法的DPPH自由基清除率都超過了92%。

圖1 不同提取方法鐵棍山藥多糖的DPPH自由基清除能力
2.3.2 鐵棍山藥多糖清除·OH的能力
山藥多糖分子末端的半縮醛羥基能還原自由基。如圖2所示,微波-酶協(xié)同法提取多糖的·OH清除能力最突出,而水提醇沉法提取的多糖效果最差。多糖質(zhì)量濃度2 mg/mL時,水提醇沉法提取多糖的·OH清除能力為65.01%,微波輔助提取法為75.04%,微波-酶提取法及纖維素酶提取法為88.56%和87.83%,不同濃度下2組差異不明顯。多糖質(zhì)量濃度3 mg/mL時,纖維素酶提取法以及微波-酶提取法多糖對·OH的清除能力均超過95%。

圖2 不同提取方法所得鐵棍山藥多糖的·OH清除能力
如表2所示,有氧耐力運動對產(chǎn)后腰痛受試人員的MDA下降水平影響較大,4組試驗受試者訓(xùn)練后即刻完成血清MDA值采集,相比安靜狀態(tài)時MDA下降非常顯著(P<0.01),對照組運動后血清MDA值與安靜狀態(tài)時同樣呈現(xiàn)出下降趨勢,具有顯著差異(P<0.05)。而訓(xùn)練后即刻采集血清的SOD值均呈明顯上升趨勢,并且具有極顯著差異(P<0.01)。

表2 運前后不同組血清MDA、SOD變化
所有試驗組的受試者在2次單周長時間亞極量康復(fù)運動后,次日晨采集血清肌酸激酶的增長幅度皆比較明顯,康復(fù)訓(xùn)練后第二日晨的測試結(jié)果也呈繼續(xù)下降的趨勢,在第二次康復(fù)運動前基本恢復(fù)到基礎(chǔ)值,如圖3所示,試驗組C、D兩次恢復(fù)速度非常顯著,分別為53.07%、51.82%和55.78%、49.75%,但2組受試人員血清肌酸激酶恢復(fù)速度差異并不明顯。對照組血清肌酸激酶恢復(fù)速度相對較慢,次日晨恢復(fù)速度分別為28.26%和28.61%。

圖3 不同試驗組康復(fù)訓(xùn)練晨間血清肌酸激酶變化情況
如圖4所示,在單周2次長時間亞極量康復(fù)運動后,次日晨采集血清睪酮下降幅度皆比較明顯,在訓(xùn)練結(jié)束后第二日晨間4個試驗組上升幅度均較大,第2次康復(fù)運動前血清睪酮采集結(jié)果顯示,4個試驗組不僅恢復(fù)到正常值,并且表現(xiàn)出不同超量恢復(fù)現(xiàn)象,恢復(fù)速度分別為62.27%、57.39%、65.88%、63.23%,兩次測量結(jié)果組間差異不顯著。對照組血清睪酮恢復(fù)速度較慢,并且在第2次康復(fù)運動前沒有表現(xiàn)出超量恢復(fù)現(xiàn)象,仍然處于恢復(fù)期。
在日常生活當(dāng)中,人體內(nèi)環(huán)境能夠滿足氧自由基動態(tài)平衡,并且在正常范圍內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)生理免疫功能以及體內(nèi)信號傳遞功能等。目前對于動物及人體的氧自由基運動變化研究多集中于單次高強度活動后即刻水平,生物體的清除能力很難繼續(xù)維持體內(nèi)氧自由基的穩(wěn)定狀態(tài)。從生理學(xué)研究角度分析,骨骼肌的運動主要依靠肌細胞內(nèi)K+、Na+、Ca2+的流動,隨著運動時間的延長,人體抗氧化能力減弱,細胞蛋白質(zhì)多肽鏈斷裂,發(fā)生結(jié)構(gòu)變化,堿基喪失,形成細胞畸變,此外骨骼肌細胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)會與氧自由基發(fā)生過氧化反應(yīng),使細胞膜通透性發(fā)生改變,細胞膜內(nèi)外電位失衡大量Ca2+堆積,從而抑制細胞進行ATP合成,最終肌纖維失去控制能力,形成炎癥變化以及痙攣狀態(tài),導(dǎo)致運動損傷與疼痛加劇[20-21]。
鐵棍山藥多糖的主鏈主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖構(gòu)成[6],對于氧自由基的清除作用主要是通過羥基提供的H+[22-23],結(jié)合體內(nèi)游離的·OH消除;此外鐵棍山藥多糖中不同單糖、糖苷鍵、構(gòu)型會對人體DPPH自由基清除能力有一定影響,但清除能力均較強[5],并且有效激活、快速提升SOD的活性,降低脂質(zhì)過氧化物MDA、總膽固醇等的整體水平[24],以此實現(xiàn)對細胞內(nèi)氧自由基數(shù)量的控制,加快人體對運動后抗氧化應(yīng)激的反應(yīng)時間。
本研究中鐵棍山藥多糖得率最高為微波-酶劑提取法(13.83%),其次分別為纖維素酶提取法、微波輔助提取法和水提醇沉法。不同方法提取的鐵棍山藥多糖均具有較高的體外抗氧化活性,且在濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性。其中,由微波-酶劑協(xié)同提取法獲得的多糖DPPH自由基、·OH清除能力最強,在多糖質(zhì)量濃度3 mg/mL時,對DPPH自由基清除率達到96.37%、·OH清除率為95.32%。采用微波-酶劑提取法多糖的抗氧化活性大于微波輔助法,微波輔助酶提取法效率優(yōu)勢明顯,其在酶制劑裂解細胞壁的基礎(chǔ)上,通過微波共同作用實現(xiàn)效果遞增優(yōu)勢,由于淀粉酶和纖維素酶能夠結(jié)合微波機械作用,以相對溫和的方式裂解鐵棍山藥細胞壁,客觀提升了鐵棍山藥細胞內(nèi)部的水分及極性物質(zhì)熱量生成速率,導(dǎo)致其對細胞壁的壓力增加進而加速細胞破裂,達到對溶出多糖成分提取的效果。因多糖提取工藝不同,在制備條件、操作等外界因素影響下,對鐵棍山藥多糖的提取也會造成差異,此外,微波的非熱效應(yīng)對化學(xué)鍵也會產(chǎn)生作用,有幾率導(dǎo)致減弱亦或者發(fā)生斷裂,降解為單糖、低聚糖等被篩除。鐵棍山藥多糖包含單糖種類較多,提取工藝所造成的單糖組成以及摩爾比差異會直觀影響提取多糖的活性,而目前相關(guān)研究結(jié)論并不統(tǒng)一,因此對于此類表征實驗研究仍有廣闊的潛力與空間。
而微波-酶劑提取法與纖維素酶提取法多糖體外抗氧化活性無顯著差異,表明微波可促進鐵棍山藥多糖提取,但是同時可能會對鐵棍山藥提取多糖的活性產(chǎn)生影響。采用纖維素酶法的提取過程較微波處理更加溫和,其能夠降低機械提取所造成多糖的降解率,使多糖具有更高抗氧化性。此外,纖維素酶提取法提取周期較短,且所需的設(shè)備相對簡單,最終多糖得率也較高(>11.0%)。但對于酶劑的類別、使用劑量則需要進行反復(fù)篩選,從經(jīng)濟性以及實用性角度考慮要盡量減少不必要的損耗。
在對人體實施不同運動強度、運動量的刺激之后,皆會引起體內(nèi)氧自由基的增加[25-26],其增長幅度直接取決于運動強度和量的整體關(guān)系,也有研究表明在非高強度、大量運動刺激下,人體的血清MDA、SOD值與安靜狀態(tài)下無差異[16,27]。試驗組受試者會隨著訓(xùn)練量的不斷疊加最終形成運動強度的刺激,從而導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化酶得到迅速動員,如表2所示,試驗組C、D的SOD水平顯著上漲,分別為63.17%、59.02%,可平衡體內(nèi)大量生成的氧自由基,因此所有受試者訓(xùn)練后MDA水平均降低。抗氧化趨勢與體外抗氧化能力的結(jié)果基本相符。依據(jù)試驗組血清肌酸激酶與血清睪酮的測試結(jié)果分析,對產(chǎn)后腰痛患者進行亞極量有氧耐力康復(fù)運動,并且進行不同鐵棍山藥多糖提取液補充,試驗組與對照組患者都表現(xiàn)出了顯著的運動恢復(fù)水平,這與針對性的康復(fù)運動手段有直接關(guān)系,從短期效果看試驗組患者表現(xiàn)出更快速的恢復(fù)能力,并且身體機能在訓(xùn)練后第二日呈現(xiàn)出不同的超量恢復(fù)狀態(tài),尤其以微波-酶提取法配制的營養(yǎng)補充劑干預(yù)(試驗組C)效果最為明顯,血清肌酸激酶2次訓(xùn)練后次日晨分別下降53.07%、55.78%,血清睪酮的訓(xùn)練后第2日晨上升65.88%。但總體而言,4個試驗組間恢復(fù)的差距并不明顯,也客觀說明試驗組產(chǎn)后腰痛患者在運動康復(fù)后期,具備了一定的連續(xù)運動能力。
此外,本研究對于女性產(chǎn)后腰痛進行運動康復(fù)4個試驗組進行28 d不間斷訓(xùn)練后鐵棍山藥多糖提取液營養(yǎng)補充,不僅彌補了運動當(dāng)中水分的流失,也滿足了受試者運動恢復(fù)過程中糖的即刻攝入,同時補充劑的口感、味道也對受試者運動后神經(jīng)疲勞以及本能的運動抗拒心理起到緩解作用[28]。更短周期的運動機能水平恢復(fù)不僅幫助患者能夠以更積極的心態(tài)參與到運動康復(fù)訓(xùn)練當(dāng)中,也能夠幫助患者在超量恢復(fù)的基礎(chǔ)上快速提升生理運動能力水平。
通過水提醇沉法、微波輔助提取法、微波-酶提取法、纖維素酶提取法進行鐵棍山藥的多糖提取,實驗顯示微波-酶提取法的多糖得率最高,體外氧自由基清除能力與運動狀態(tài)下產(chǎn)后腰痛患者抗氧化能力干預(yù)結(jié)果相似。鐵棍山藥多糖的結(jié)構(gòu)能有效激活人體的抗氧化酶活性,降低細胞過氧化反應(yīng)水平,提升產(chǎn)后腰痛患者運動康復(fù)過程中氧自由基清除能力,補充運動中糖、蛋白質(zhì)、維生素等物質(zhì)的消耗,從而增強人體抗氧化、抗疲勞能力,消除疼痛感,加速生理機能恢復(fù)[29]。鐵棍山藥作為日常人們主要食物之一,價格相對低廉,易吸收,并且還具有多樣性的藥用價值,其諸多優(yōu)點會隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及相關(guān)研究的不斷進行而受到更加廣泛的關(guān)注,采用最優(yōu)化加工工藝制作鐵棍山藥營養(yǎng)補充劑,能夠完善產(chǎn)后腰痛運動康復(fù)中的營養(yǎng)補充體系,也將成為運動訓(xùn)練營養(yǎng)補充結(jié)構(gòu)中重要的組成部分。