以天然多糖為基質構建口服蛋白質納米粒子的研究進展

蔡泓瀅,太敏瑞,李瑞,2*,宋兵兵,2,陳建平,2,劉曉菲,2,鐘賽意,2

1(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東省海洋生物制品工程實驗室,廣東省海洋食品工程技術研究中心,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省亞熱帶果蔬加工科技創新中心,廣東 湛江,524088)2(海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心(大連工業大學),遼寧 大連,116034)

口服是攝入功能性物質最便捷的方式,也是具有活性的蛋白質和多肽最理想的吸收方式。雖然目前已經證明,口服蛋白質納米遞送載體可以被小腸吸收,但其較低的吸收率仍然是開發口服納米載體的最大障礙。蛋白質在口服過程中需要克服數重屏障[1],才能到達體循環被有效吸收。第一個屏障是胃酸屏障:胃部的pH為1.2,在該條件下大部分蛋白質都會失活,且胃液中的蛋白質酶會分解蛋白質。第二個屏障是腸黏膜屏障:腸腔表面附著的黏液層,主要成分是高度糖基化的黏蛋白分子形成的凝膠網絡,確保了腸黏膜屏障的結構穩定性,也阻止了異物入侵;有效的口服納米粒子應能夠穿透腸黏膜屏障,穿過腸上皮細胞,才能進入體循環。在多重屏障的阻礙下,口服蛋白質的生物利用度僅為1%～2%[2]。因此,構建口服蛋白質納米粒子最重要的挑戰是提高蛋白質的口服利用度。近幾年,研究發現納米遞送載體如納米粒子[3]、水凝膠[4]、乳液[5]、微膠囊[6]等對蛋白質具有保護作用,被用于蛋白質類物質的遞送,并能有效提高蛋白質的生物利用度。

天然多糖是由糖苷鍵連接的單糖組成的碳水化合物,具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、降血糖等多種生物活性[7],在食品和制藥行業中均得到了廣泛應用。當多糖作為納米粒子的壁材,它可以穿過內皮系統,在體循環中具有更高的穩定性[8]。此外,多糖中的羧基、羥基和氨基可增加其與細胞和組織間的黏附性,提高芯材在口服過程中的生物利用度[9]。學者們廣泛探究了多糖作為納米載體的可行性及提高口服大分子蛋白質生物利用度的效果[10],天然多糖因其無毒、化學結構可修飾、良好的生物相容性和生物降解性等性質,并與活細胞之間相互作用廣泛,因此,其作為體循環和靶向治療生物材料的原料具有獨特優勢[11-12]。本文主要綜述了以天然多糖為基質制備納米粒子的常用方法,影響口服蛋白質納米載體穩定性的主要因素,制備口服蛋白質納米載體常用的天然多糖及其獨特優勢。

1 以天然多糖為基質制備納米粒子的常用方法

制備納米粒子的方法有薄膜澆鑄、浸涂、自組裝、靜電紡絲、逐層組裝、聚電解質絡合等[13],前2種方法常用于納米復合膜的制備。下文將詳細介紹制備口服納米粒子常用的方法:自組裝、逐層組裝和靜電紡絲等。

1.1 自組裝

自組裝是目前制備納米粒子最常見的方法,是指某些分子、大分子或復合材料能夠與自身結合形成三維網絡或其他結構的形式,并通過相互作用力(如氫鍵、范德華力等)進行交聯,該過程可以在分子或超分子水平上進行[14],常用的方法是化學交聯法和聚電解質絡合法。化學交聯法多用于殼聚糖改性,即將疏水基團接枝到殼聚糖分子上,增加殼聚糖對親脂性藥物的獲取能力,DU等[15]用N-三甲基殼聚糖(N-trimethyl-chitosan, TMC)作為載體,顯著提高了山萘酚的血液滯留時間。聚電解質絡合是將2種具有不同電荷的聚電解質溶液,通過離子相互作用,可以使電解質在不添加任何共價交聯劑的情況下形成聚電解質化合物(polyelectrolyte complex,PEC),與化學交聯化合物相比,PEC通常無毒、耐受性良好且具有生物相容性[16]。

1.2 逐層組裝

逐層組裝是一種用于制備納米復合材料的獨特構造方法。將2種不同的納米材料交替堆疊在一起,得到納米復合材料結構[17],ZHANG等[18]用陰離子羧甲基淀粉和季銨型陽離子淀粉作為載體,包載牛血清白蛋白制備納米膠囊,該納米膠囊能夠靶向到結腸釋放并有一定的作用效果。但逐層組裝技術用于口服蛋白質納米粒子的研究仍處于起步階段,更常用于對脂質體的包載,并且在毒性以及高分散性等方面仍存在一定挑戰。

1.3 離子凝膠法

離子凝膠法是利用聚陽離子殼聚糖和帶負電離子之間的絡合作用誘導并形成凝膠,常應用于單克隆抗體的遞送。VONGCHAN等[19]制備了負載抑制肝細胞癌的單克隆抗體的三甲基殼聚糖和蛋白質形成納米粒子,該納米制劑可以進入細胞,并在癌細胞中保留更長的時間,能夠潛在延長抗體的半衰期。

1.4 膠體組裝法、共沉淀法

多糖可以與某些合成聚合物形成穩定的離子仿生納米復合物,用肝素-Pluroinc偶聯物包載聚丙交酯-乙交酯,改善了聚丙交酯-乙交酯的腫瘤靶向效率[20]。共沉淀是一種同時沉淀技術,納米復合材料通過沉淀形成最終結構,在殼聚糖-賴氨酸體系中共沉淀伊曲康唑和殼聚糖,180 min時,伊曲康唑在角膜上的累積滲透率達到(5.22±0.20)%,為商業懸浮液的1.7倍[21]。

1.5 其他方法

在制備天然多糖納米載體中,靜電紡絲[22]、薄膜澆鑄[23]、浸涂[24]也是常用的方法。靜電紡絲是在高壓場的作用,經過注射器擠出納米材料復合溶液的過程[25], FARALLI等[26]制備了黃原殼聚糖納米纖維,封裝了姜黃素,證明該納米纖維可用于胃腸道中水溶性差的化合物的口服遞送應用,當黏液附著于靜電紡絲制備的納米纖維可以設計多種功能,如快速溶解特性、控釋等作用,在黏膜遞送存在較大優勢,但靜電紡絲用于遞送時,存在技術規模小、載藥量不穩定等限制。而薄膜澆鑄、浸涂通常用于制備柔性納米復合膜,以延長食品貨架期,而在蛋白質遞送方面的研究較少。

2 影響納米粒子遞送效果的因素

已知的口服蛋白質納米粒子的吸收有3種途徑,分別是腸道淋巴途徑、跨細胞膜轉運、細胞旁途徑。腸道淋巴途徑是讓多肽和蛋白質物質通過胃腸壁直接進入淋巴管[27]。口服蛋白質納米制劑通過該通路,直接將藥物輸送到腔靜脈,避免了首過效應,避免了在腸黏膜和肝臟中代謝的過程,能有效提高生物利用度[28]。跨細胞膜轉運是指納米粒子被腸上皮層的腸細胞吸收,因此粒徑較大的口服藥物可以靶向到派伊爾結中,大于500 nm的口服藥物微球更容易被派伊爾結中的M細胞吸收,隨后通過跨膜運輸進入體循環中[29],有效提高藥物的生物利用度。細胞旁途徑即納米粒子從細胞間隙的緊密連接(tight junctions, TJs)穿過上皮細胞,進入體循環的途徑,是被動擴散,也是親水分子被吸收的唯一途徑。因此,粒徑和電位是影響納米粒子穩定性和遞送效果的2個重要因素。

2.1 粒徑

對于口服蛋白質納米粒子而言,粒徑是非常重要的指標之一,并且會影響蛋白質的生物利用度,納米載體的大小會影響M細胞和腸細胞對其的攝取,當納米粒子粒徑小于50 nm時可以通過腸細胞內吞優先轉移,而M細胞優先在較小(20～100 nm)的粒徑范圍內運輸顆粒。DESAI等[30]以聚苯乙烯為載體制備了不同粒徑的牛血清白蛋白納米粒子,發現當粒徑小于100 nm時,吸收率較高,并且能夠穿越腸上皮細胞,而粒徑大于100 nm的主要位于小腸上皮層,不能被吸收,同時,小于500 nm的能夠到達循環系統。SUN等[31]發現280 nm級別的環孢菌素A納米懸浮液比522、2 976 nm的納米懸液具有更高的生物利用度。但由于制備較小納米級別的納米懸浮液成本更高,在實際生產中,應考慮成本、效率、能源的消耗,確定一個最佳粒徑范圍。

2.2 電位

帶正電的多糖(如殼聚糖)和帶負電的黏蛋白的靜電作用可導致強烈的黏膜吸附效果,能使納米粒子接近小腸上皮細胞,增加攝入,由于小腸黏液層中帶有負電荷,具備正電荷的納米粒子更可能黏附在小腸黏液層,并延長納米粒子在腸道的滯留時間。但陽離子納米粒子和黏液層的相互作用會阻礙納米粒子通過黏液層,從而影響納米粒子的吸收[32]。帶中性電荷的粒子最適合延長納米粒子在體內的循環時間[33]。目前,常用聚乙二醇修飾納米粒子的表面,提高其親水性,并且使納米粒子的表面電荷接近中性[34],SUSA等[35]發現,納米粒子的電位絕對值大于10 mV時,會有明顯的黏膜黏附性。

3 天然聚合物納米遞送載體的制備及應用

3.1 殼聚糖及其衍生物

3.1.1 以殼聚糖為載體制備口服蛋白質納米粒子

殼聚糖(chitosan, CS)是甲殼素脫乙酰化的產物,由葡萄糖胺和N-乙酰葡糖胺連接構成的陽離子多糖,具有抗菌、抗炎及抗腫瘤等生物活性,其理化性質主要取決于甲殼素脫乙酰度、分子量和pH值,由于氨基葡萄糖單元的脫乙酰殼聚糖主鏈具有高密度的帶電酰胺,殼聚糖表面帶正電荷,能與在中性條件下攜帶負電荷的蛋白質和基因發生強烈的靜電作用,同時也能與負電荷的黏蛋白層形成氫鍵和靜電離子鍵[36],使殼聚糖納米粒子能夠穩定穿越腸道屏障[37]。SONAJE等[3]發現,殼聚糖能夠誘導緊密連接蛋白中的閉合蛋白4(claudin-4)從細胞膜重新分布到胞質溶膠,從而減弱緊密連接,并可在短時間內增強細胞旁通透性。使用殼聚糖作為包載材料能夠延長其在腸道的滯留時間,增加藥物對膜的通透性。YAO等[38]用果膠和殼聚糖修飾牛乳鐵蛋白,有效提高了口服牛乳鐵蛋白在大鼠血液內的平均停留時間。體外釋放是評價蛋白質類藥物給藥納米制劑穩定性的常用方法。首先,將納米粒子置于人工胃液(simulated gastric fluid, SGF)中孵育0～2 h,隨后將納米粒子轉移到人工腸液(simulated intestinal fluid, SIF)中孵育6～12 h,測游離蛋白質含量,模擬納米粒子在胃腸道中的釋放情況,進而推斷納米粒子在體內的消化方式[39],得到的殼聚糖納米粒子具有pH響應性,即酸性條件下穩定,堿性條件下釋放。LING等[40]用海藻酸鹽、鈣離子和殼聚糖包裹綠色熒光蛋白形成的綠色熒光納米液滴,得到的綠色熒光蛋白保留效率為(59.9±1.1)%,交聯后的海藻酸鈉/殼聚糖多磺酸粘多糖包裹綠色熒光蛋白的納米粒子在模擬胃液中培養2 h后熒光能夠逐漸恢復,在模擬腸液中2 h約70%納米粒子(nano particle, NPs)可被釋放,說明使用海藻酸鹽、鈣離子、殼聚糖包載的綠色熒光蛋白保證了其在胃液中白的穩定,通過實驗發現綠色熒光蛋白能夠在腸液中有效釋放。由于氨基的質子化作用,殼聚糖在酸性條件會高度溶解,這說明殼聚糖在胃液的條件下時常不穩定。若以殼聚糖作為單純的載體,制備的CS-NPs在人工胃液中可能會發生嚴重腫脹和離解,導致內部蛋白質的突然釋放。但在小腸的堿性條件下,殼聚糖去質子化,去質子化后的CS變得不溶于水,會削弱聚合物網絡并導致納米顆粒的破損[41]。因此,單純的殼聚糖不適合作為口服蛋白質的載體,為了克服殼聚糖載體的這個缺點,目前常采用化學交聯或殼聚糖改性。

3.1.2 以殼聚糖衍生物為載體制備口服蛋白質納米粒子

由于殼聚糖在堿性條件下溶解性差,會使納米粒子無法穩定抵達目標位點,目前采用對殼聚糖改性的方法提高殼聚糖納米載體的穩定性。N-三甲基殼聚糖(N-trimethyl-chitosan,TMC)是殼聚糖的伯胺基被碘代甲烷取代而成的產物,TMC有較好的溶解性,在pH 1～9內均能溶解,TMC引入了三甲基,使殼聚糖帶有更多的正電荷,能顯著促進其吸收,效果與其季氨化程度成正比。當pH>6時,殼聚糖的溶解性較差,多用于酸性環境納米粒子的構建,而使用TMC構建納米粒子能減少pH對其溶解性影響的問題[42]。除了TMC,常見的殼聚糖衍生物還有鄰苯二甲酸殼聚糖、硫醇化殼聚糖、十二烷基琥珀酰殼聚糖等[42]。通過殼聚糖改性,HE等[43]開發出一種由羧化殼聚糖接枝納米顆粒和雙層薄膜包裹鈣綠素的復合載體,該羧化殼聚糖接枝納米載體(carboxylated chitosan grafted nanoparticles, CCGN)具有海藻酸鹽-Ca2+黏附層和疏水背襯層。體外模擬釋放時,CCGN在模擬胃液環境的酸性介質中的釋放量受到限制,在模擬腸液環境的中性培養基中,在30 min內達到了100%的釋放量,說明CCGN或許能夠有效實現口服的有效遞送。LI等[44]合成了一種具有抗蛋白水解能力的口服細胞程序性死亡-配體1(programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1)結合肽(oral pd-l1 binding peptide 1, OPBP-1),它可以阻斷免疫PD-1/PD-L1細胞蛋白的過表達,從而抑制腫瘤生長,有作為癌癥免疫治療的潛在作用。用TMC負載OPBP-1形成水凝膠,該水凝膠呈現高度多孔結構,有利于OPBP-1在水凝膠內封裝,能保護封裝的OPBP-1免受蛋白酶的降解,同時,在緩沖液的作用下,多孔結構能夠提高OPBP-1從水凝膠中釋放出來的效率。

3.2 以海藻酸鈉為載體制備口服蛋白質納米粒子

海藻酸是一種天然多糖,由甘露糖醛酸(mannuronic acid, M)和古洛糖醛酸(guluronic acid, G)結合而成,高甘露糖醛酸海藻酸鹽纖維具有更好的膠凝能力,高古洛糖醛酸海藻酸鹽通過靜電紡絲形成的納米纖維膜具有纖維薄和高孔隙率的特點,并且這2種單體的比例會對海藻酸與金屬離子的結合能力有一定的影響[45]。鈉離子是海藻酸鹽常結合的一種離子,古洛糖醛酸殘基通過鈉離子交換可與二價離子交聯,形成凝膠,并將目標物質包裹在內部,結合后的海藻酸鈉具有良好的生物降解性、生物相容性、低毒性和控釋效果良好等特點,在制備營養素或藥物釋放載體方面中應用廣泛。通過離子凝膠法或聚電解質絡合法制備了多種海藻酸鈉納米粒子,除了使用納米技術外,還探索了具有pH響應性的復合水凝膠等微粒[46]。

海藻酸鈉與殼聚糖質子化行為不同,它在堿性環境下可溶,在酸性環境中不溶解,酸性條件下形成多孔、不溶性酸基質,能夠保護藥物免收胃腸道的損傷,但是在中性、堿性條件下時,海藻酸鈉基質轉化為可溶性黏性層,導致聚合物分解和化合物的釋放[46-47]。因此,海藻酸鈉納米粒子在SIF中的釋放曲線更快,可能是因為中性或堿性的條件下,海藻酸鈉網絡被侵蝕[47],PARK等[48]從蛋清中提取的溶酶體在胃中低pH條件的影響下,抗菌活性顯著降低,通過制備海藻酸鹽-溶酶體復合物,將水解時間延長至2 h,有效提高了該復合物在酸性條件下的穩定性。但海藻酸鈉納米粒子存在機械強度低、膜密度不均勻等問題,使膜變性,導致藥物泄露。因此,目前采用制備PEC的方法制備海藻酸鈉-子蛋白質納米制劑,以提高穩定性、減少給藥后的快速破裂。CHEN等[49]開發了一種新型pH敏感口服胰島素PEC,該PEC由2種已經負載胰島素的納米粒子,CS-NPs和海藻酸鈉NPs通過靜電相互作用制備而成。CS上游離的氨基(—NH3+)和海藻酸鈉上游離羧基(—COO-)之間靜電吸引是PEC形成的主要作用力,形成的PEC能夠提高胰島素的穩定性,不受胃液和胃蛋白酶的影響[16]。用透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察到PEC在不同pH條件下的形態,在pH為1.2時PEC結構破損,交聯結構有明顯差異,在pH為6.8和7.4時呈現不規則圓形狀,該納米粒子有利于pH敏感性的納米載體的研制。

3.3 以淀粉為載體制備口服蛋白質納米粒子

淀粉在自然界分布廣泛,并具有價格低廉、生物相容性好、易獲取、無毒、高穩定性等特點。不管是直鏈淀粉還是支鏈淀粉,均含有大量羥基基團,具有強大的吸水性。但作為口服制劑,淀粉容易被上消化道中的如唾液淀粉酶等多種淀粉酶水解,若將其作為口服藥物載體,必須將大小為微米級別的淀粉顆粒改性成為納米級別的淀粉顆粒,提高穩定性[50]。對比其他載體材料,淀粉納米顆粒最終降解產物為H2O和CO2,可以通過循環系統排出體外,在體內無殘留,安全性較高。貝伐單抗是一種人源化單克隆抗體IgG1,能夠有效抑制腫瘤血管生長,但無法通過口服吸收。DE DLIVEIRA等[51]通過結冷膠和逆行淀粉包載了貝伐珠單抗,有效提高貝伐珠單抗的締合效率,并保證其穩定性。姬娜[52]通過自組裝的方法,以短直鏈淀粉作為主要基材、玉米醇溶蛋白和殼聚糖作為輔助基材,包載胰島素。糖尿病大鼠口服實驗表明,當短直鏈淀粉-胰島素納米復合物劑量為100 IU/kg時,生物利用度為4.59%,在8 h內血糖無明顯波動,表明此載體具有長時降血糖效果,但由于制備的淀粉顆粒為混合物,無法明確具體相互作用的方式。因此,淀粉作為納米載體的作用機制需進一步探究。

3.4 以右旋糖酐為載體制備口服蛋白質納米粒子

右旋糖酐是由葡萄糖為單糖組成,由糖苷鍵連接而成的同型多糖,具有較好的水溶性、生物相容性和生物降解性。在納米遞送系統中發揮重要作用,如,SONG等[53]用右旋糖酐-低分子量魚精蛋白-聚乳酸-羥基乙酸共聚物制備包封艾塞那肽的納米粒子,該納米粒子能夠促進黏液屏障的滲透,通過蛋白轉導域介導細胞易位,此外,口服艾塞那肽納米粒子的相對生物利用度為8.4%,對2型糖尿病小鼠有顯著降血糖作用。

3.5 以果膠為載體制備口服蛋白質納米粒子

果膠是一種廣泛存在于植物細胞壁的多糖,果膠可分為2種類型,即低甲氧基果膠和高甲氧基果膠[54]。在納米粒子的運輸中,果膠也得到了廣泛的關注。由于果膠屬于可溶性膳食纖維,直到結腸處才會被微生物降解,因此果膠也是結腸靶向給藥的理想載體[54]。β-乳球蛋白是一種乳清蛋白,有抵抗胃蛋白酶以及易與疏水配體結合等特點,使其具有運輸結腸癌藥物的潛力[55]。將β-乳球蛋白-果膠納米粒子設計用于將新合成的抗癌鉑絡合物轉移到結腸[56],模擬胃腸道條件下,該絡合物在酸性條件下穩定,在pH 7下釋放其產物。

4 天然多糖作為口服蛋白質遞送系統的優勢

4.1 高黏附能力

多糖,如殼聚糖[15]、淀粉[57]、海藻酸鈉[48]等都具有黏膜黏附特性,黏附特性能有效延長納米粒子在腸道的滯留時間,從而提高生物利用度。逆行淀粉形成的納米粒子在pH 1.2和6.8的表達中顯示了較弱的相互作用,說明該多糖不會顯著影響黏液的流變學和屏障特性,該納米粒子形成的弱相互作用,不會輕易受到吐溫20等阻滯劑的影響,可以成為黏膜黏附遞送系統發展方向[57]。

4.2 克服腸道屏障的能力

由于帶負電的黏蛋白和聚合物正電荷的相互作用,殼聚糖能夠提高腸上皮細胞通透性。此外,殼聚糖可以螯合TJs中的Ca2+,同時下調claudin-4蛋白[3]。然而,到目前為止,尚沒有證明完整的納米結構在正常生理條件下能通過細胞旁途徑突破腸道屏障的研究。

4.3 用于結腸靶向用藥

殼聚糖[58]、果膠[59]、海藻酸鈉[60]、右旋糖酐[61]均有結腸靶向運輸的報道,但對殼聚糖、果膠的研究較為深入。殼聚糖在酸性條件下的溶解性,保證了殼聚糖在胃部環境的穩定性,并能夠被豐富的結腸微生物群降解[58],用殼聚糖膠囊和羧甲基纖維素分別包載5-氨基水楊酸治療患結腸炎的大鼠,通過盲腸內容物分析,殼聚糖膠囊釋放的5-氨基水楊酸含量顯著上升,說明該體系具有結腸靶向的潛力[62]。果膠在上消化道保持完整,并幾乎能夠完全被結腸菌群降解,因此能用于結腸特異性藥物輸送。姜黃素被證明具有抗癌作用的藥物,成功配制了柑橘果膠包載的姜黃素,在結腸培養基上顯示了高黏膜黏附性,在胃時黏附性最小,pH 1.2時,約有18%姜黃素釋放,在24 h內在盲腸培養基釋放高達68%,說明該納米粒子具有作為口服靶向治療結腸癌制劑的應用潛力[59]。

5 結語

本文主要概述了天然多糖類物質用于制備口服大分子蛋白質類物質納米遞送載體及其應用。天然多糖因其無毒和生物可降解性、化學結構的可修飾性以及可形成具有不同機械性能和結構的基質,并能在生物分子與基質結合后保持生物活性的能力,因此在過去十幾年中被廣泛用來開發生物療法給藥系統,用于營養物質的遞送。而在口服大分子蛋白質類物質遞送方面,使用單一多糖作為載體通常無法達到口服控釋的效果,需要對多糖進行更精確的化學修飾,或將其與其他天然或合成聚合物結合,以改善遞送載體的總體結構行為,如機械性能或降解行為,并在分子和納米水平上調節與生物活性劑的相互作用,以進一步提高大分子蛋白質類物質的口服生物利用度。同時,到目前,大部分的口服蛋白質納米制劑的研究主要仍處于實驗室階段,未能夠進行商業化,天然多糖主要缺點包括機械強度低、穩定性差、水化速率不受控制以及存在雜質,因此,必須嚴格控制天然多糖的質量穩定性,為后續多糖載體商業化提供研究基礎。