基于原位培養和傳統培養分析比較不同儲存期醬香大曲的細菌群落

鄒云曼,邱樹毅,鄭佳,戴怡鳳,韋朝陽,閆巖,曾祥勇*

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽,550025)2(貴州省發酵與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽,550025)3(中國輕工業濃香型白酒固態發酵重點實驗室,四川 宜賓,644000)

醬香白酒是中國三大香型白酒之一,具有獨特的釀造工藝。其中高溫大曲是醬香白酒最鮮明的特點之一。高溫大曲可為白酒生產提供豐富的前體物質、微生物及酶類,對白酒品質和風味產生重大影響[1]。醬香大曲的生產工藝包括制作、發酵和儲存3個階段。即將曲料混合后制成曲塊,入倉發酵40～50 d,再經過數月的儲存才能投入生產[2]。在儲存過程中,大曲微生物會進一步優化,形成穩定的利于生產的微生物群落結構[3]。其中,細菌在醬香大曲中的主要功能是“生香”,是形成醬香型白酒典型香氣特征的主要菌群[4]。因此,對醬香大曲可培養細菌進行篩選鑒定及功能性研究具有重要意義。

近幾十年來,對可培養白酒發酵細菌的分離、篩選和分子生物學特性研究絕大多數基于傳統培養法[4-5]。但由于自然界大多都是未培養微生物(占99%),通過傳統培養方法無法分離得到的[6],從發酵過程中分離活性顯著、結構新穎的微生物越來越困難。盡管越來越多的釀酒微生物通過克隆文庫技術[7]、變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis, DGGE)[8]、高通量測序[9]、多組學技術[10]等免培養技術被發現、評估和鑒定,但分子生物學技術提出的各種功能假說以及微生物的生物學特性只有在純培養物中才能得到真正的驗證[11]。因此,在發展分子生物學的基礎上,除了利用培養基優化手段提高微生物的可培養性以外[12-13],一些新型培養技術,包括原位培養、共培養、微流控培養技術和細胞分選技術等,逐漸被開發用于培養和捕獲微生物[14-15]。其中原位培養就是在人工培養條件下,將樣品置于模擬自然環境的條件下進行分離。原位培養裝置中的微生物細胞無法向外擴散,在原生態環境中獲得天然的營養物質、信號分子或其他生長因子,將“未培養微生物”轉變為可培養的菌種而加以研究,從而實現對微生物生長的控制[16]。原位培養解決了傳統培養法因培養基富營養化[17]、生長因子缺乏[18]等原因而無法分離培養部分功能微生物的問題,在增加微生物的可培養率、理解微生物功能以及實現資源利用方面具有重要意義。

原位培養中分離芯片法(isolation chip,Ichip)[19]具備裝置簡單,可高通量操作,工作原理清晰明了等特點。Ichip原位培養法已經被廣泛應用于土壤、海洋、口腔等環境中微生物的分離篩選[20],但迄今為止,還未見食品中特別是白酒發酵領域中利用原位培養法篩選釀酒微生物的相關報道。本課題組率先利用Ichip原位培養技術來篩選釀酒微生物,以不同儲存期的醬香大曲為篩選源,對比分析原位培養和傳統培養中大曲細菌菌群結構組成的差異,同時探究儲存過程中群落結構特點和動態變化規律。這項研究有助于難培養釀酒細菌的分離篩選,使它們能夠從釀造環境中被提取并在實驗室中得到有效地馴化和培養,以期為醬香型白酒大曲中細菌的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細菌原位培養裝置

本研究用于細菌分離的原位培養裝置由兩部分構成,200 μL槍頭板和孔徑為0.03 μm的聚碳酸酯徑跡蝕刻濾膜(polycarbonate track etched,PCTE)[20]。此板本質上是一個有96個通孔的塑料板,能高通量并行操作,且孔與孔之間互不干擾。任何帶有這種通孔的塑料板都可以替代它。

1.2 樣品采集

本試驗高溫大曲樣品取自貴州省茅臺鎮某酒廠。從塊狀大曲不同層次中取樣并研細成粉,等量混合后分裝于無菌取樣袋,于4 ℃保存備用。3個月、4個月、5個月、6個月、8個月高溫大曲用于原位培養的編號為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5;用于傳統培養的編號分別為CY1、CY2、CY3、CY4、CY5。

1.3 培養基

營養瓊脂(nutrient agar,NA)培養基(g/L):牛肉膏5,蛋白胨10,NaCl 5,瓊脂20,pH 7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

LB肉湯培養基(g/L):牛肉膏5,蛋白胨 10,NaCl 5,pH 7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

改良R2A瓊脂培養基[21]:瓊脂15～20 g、NH4Cl 0.8 g、KNO30.5 g、酪蛋白水解物0.5 g、葡萄糖0.5 g、蛋白胨0.5 g、丙酮酸鈉0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、酵母浸出粉0.5 g、K2HPO40.4 g、KH2PO40.25 g、MgCl2·6H2O 20.0 mg、CaCl2·2H2O 15.0 mg、FeSO4·7H2O 7.0 mg、MnCl2·4H2O 5.0 mg、Na2SO45.0 mg、CoCl2·6H2O 0.5 mg、H3BO30.5 mg、NiSO4·6H2O 0.5 mg、ZnCl20.5 mg、CuCl2·2H2O 0.3 mg和Na2MoO4·2H2O 10.0 μg、用蒸餾水定容至1.0 L,pH 7.0±0.2,121 ℃滅菌15 min。

大曲浸出液(Daquextract,DE):曲樣1.00 g,加入99 mL無菌水,加玻璃珠搖床振蕩4～5 h后用0.2 μm膜過濾除菌。

R2A-DE培養基:90%體積的改良R2A培養基和10%體積的DE浸出液混勻,即為R2A-DE培養基。

1.4 樣品分離及培養

1.4.1 傳統培養法分離純化細菌

在無菌環境下,各儲存期大曲樣品分別稱取1.00 g,用無菌水進行濃度梯度稀釋(10-2、10-3、10-4)。各濃度梯度菌懸液分別取100 μL涂布于R2A-DE培養基平板上,37 ℃倒置培養24 h,每個濃度梯度各做3個平行。挑取平板上不同形態的菌株,將獲得的單菌落進行平板劃線處理,多次純化。觀察純化后的細菌菌落形態,去掉重復的細菌。轉移至25%甘油管中,于-80 ℃保藏,用于后續鑒定。

1.4.2 原位培養法分離純化細菌

原位培養法分離純化細菌的操作流程見圖2。在超凈工作臺中將PCTE膜覆蓋在200 μL槍頭板底側,并用有機硅膠密封,放置2 h以上使膠完全凝固。

圖2 原位培養法分離純化細菌流程圖

在無菌環境下,各儲存期大曲樣品分別稱取1.00 g,用無菌水進行濃度梯度稀釋。為了保證每孔均有合適數量的細胞,本研究選取10-5和10-6梯度菌懸液各5 mL加入45 mL熔融的R2A-DE培養基中混勻后,用排槍吸取250 μL分別加入Ichip板96孔中,待瓊脂凝固后,將PCTE膜覆蓋在200 μL槍頭板頂部并用防水有機硅膠密封,于超凈工作臺放置2 h以上使膠完全凝固。將Ichip放回發酵糟醅中原位培養,在窖池內的放置位置見圖3。

圖3 Ichip板在窖池中原位培養時放置情況示意圖

原位培養1個月后取回實驗室馴化。在無菌條件下,擦拭Ichip板表面雜物后用鑷子輕輕剝下頂膜,取出富集物。用滅菌牙簽取出 Ichip 板中富集物,LB培養基搖床培養6 h。之后進行梯度稀釋(10-2、10-3、10-4),各濃度梯度菌懸液分別取100 μL涂布于NA培養基平板上,37 ℃倒置培養24 h,每個濃度梯度各做3個平行。挑取平板上不同形態的菌株,將獲得的單菌落進行平板劃線處理,多次純化。觀察純化后的細菌菌落形態,去掉重復的細菌。轉移至25%甘油管中,于-80 ℃保藏,用于后續鑒定。

1.5 分子生物學鑒定

將純化菌種接入LB肉湯培養基中活化,37 ℃、200 r/min培養24 h。取1 mL菌液12 000 r/min離心1 min,棄清液,按照細菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA。擴增細菌16S rDNA序列,擴增引物為27f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r (5′-GGT-TACCTTGTTACGAC TT-3′)。PCR擴增條件:94 ℃預變性10 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共33個循環;72 ℃再延伸10 min,4 ℃下保存。PCR擴增體系(50.0 μL)為:2×TaqPCR MasterMix Ⅱ 25.0 μL,上下游引物(1.0 μmol/L)各1.0 μL,DNA 模板2.0 μL,雙蒸水(ddH2O)21.0 μL。

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后,送至上海生物工程有限公司測序。將測序所得的特定細菌菌株序列結果,在NCBI上經BLAST進行同源性比較,對菌株進行菌種鑒定。

1.6 數據處理

采用分離頻率(isolation frequency, IF)比較判斷優勢菌群[22]。IF:分離到的某一指定類型微生物的菌株數占該樣品分離總微生物菌株數的百分比。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離純化和菌落形態觀察

從5個儲存期的醬香型高溫大曲樣品中共分離純化出679株細菌,其中原位培養法471株,傳統培養法208株,部分細菌菌落形態如圖4所示。從菌落特征來看,相同培養條件下,不同細菌菌落形態、顏色、質地、邊緣等特征略有不同。菌落形狀多為圓形;顏色多為白色,兼有米色和黃色;質地有的濕潤、黏稠、有光澤,有的干燥、有褶皺,邊緣大多不規則。根據菌落形態特征進行感官性初篩,原位培養和傳統培養分別選擇296株和96株進行后續分子生物學鑒定。

2.2 菌株分子生物學鑒定

細菌16S rRNA序列擴增,部分菌株瓊脂糖凝膠結果見圖5,都得到1 400 bp大小片段,與預期產物大小一致。根據所得的基因序列,在NCBI上通過BLAST程序進行同源序列比較與分析。每種細菌的參考菌株編號及具體分離情況見表1和表2。結果表明這些菌株與各自的參考菌株的相似度都是100%,說明是同一種。

表1 高溫大曲細菌基于原位培養法的分離情況

表2 高溫大曲細菌基于傳統培養法的分離情況

圖5 部分細菌瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 傳統培養和原位培養法細菌多樣性分析

如圖6所示,原位培養在3、4、5、6個月儲存期大曲中獲得的細菌屬都比傳統培養多。在種水平上,原位培養在5個儲藏期大曲中獲得的細菌物種數分別為13、15、14、16、12;傳統培養獲得的細菌物種數分別為8、6、8、7、10。統計分析表明,原位培養和傳統培養在種水平上獲得的菌種數量存在極顯著差異(P<0.01;Fcalculated=22.09>Fcritical;df=1)。因此,本研究的原位培養裝置適用于細菌培養,這種Ichip原位培養方法在醬香大曲細菌分離培養中是有效的。另外,隨著儲存時間的增加,傳統培養細菌屬和種數量呈現先降低后增加的整體趨勢;原位培養呈現先增加后降低的整體趨勢,這與2種培養法整合后的趨勢基本吻合,同時與本課題組對同批次醬香大曲的高通量測序結果相符。這可能是因為原位培養裝置被置于窖池糟醅中,糟醅中的信號分子和關鍵營養因子等被細菌利用,因此原位培養細菌變化趨勢更接近于實際醬香大曲的細菌多樣性,在實驗室研究中具有較高的參考價值。

a-屬水平;b-種水平

2種培養法從不同儲存期大曲中共分離獲得17個細菌屬,其中原位培養獲得15個屬;傳統培養獲得5個屬(圖7)。比較2種培養法的屬級細菌多樣性,原位培養獲得特有屬10個,傳統培養獲得特有屬1個。原位培養獲得的10個特有屬中,大多都只基于高通量測序等分子生物學技術檢測到豐度及功能預測,但未見從白酒發酵環境中分離出它們相關物種的報道。SUN等[23]通過高通量測序揭示了濃香型白酒糟醅中之前未發現的Alcaligenes。基于高通量測序技術,Citrobacter和Paenibacillus被證明是醬香白酒主要優勢菌屬[24-25]。Citrobacter分泌的水解酶可降解酒中氨基甲酸乙酯,保障食品安全性[26]。Paenibacillus對醬香型糟醅的香氣成分影響較為顯著[27]。Paenibacillussp.中克隆出的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因能有效降解釀酒谷物中β-葡聚糖,降低啤酒糟黏度和濁度,促進優質啤酒生產[28]。母應春等[29]利用高通量測序技術發現Acinetobacter和Ralstonia與貴州酒曲酸度變化呈正相關。因此,在基于免培養技術和認識微生物的基礎上,利用原位培養分離得到發酵功能菌以研究其生理生化以及發酵特性,為提高白酒品質做出重要貢獻。

a-屬水平;b-種水平

2種培養法從不同儲存期大曲中共分離獲得46個細菌種,其中原位培養獲得36個種;傳統培養獲得17個種(圖7)。比較2種培養法的種級細菌多樣性。原位培養獲得特有種28個,傳統培養獲得特有種9個。原位培養的28個特有細菌種中,Bacillusparamycoides、Bacillusvallismortis、Staphylococcusxylosus、Brevibacillusborstelensis等在白酒發酵環境中鮮有報道,這些微生物大多在醬香白酒中首次報道或者分離。其中,B.paramycoides分泌耐堿耐熱的木聚糖酶證明了其在酒精飲料和發酵工業的應用潛力[30]。B.vallismortis已經被報道對提高芝麻香型白酒中含硫風味成分的重要性[31]。S.xylosus是常見的食品發酵物種[32],但在白酒領域深入研究較少。高亦豹等[33]利用DGGE檢測到了傳統方法未能分離鑒定的S.xylosus。B.borstelensis被報道能產生一種類似細菌素的抗菌物質,對Listeriamonocytogenes、Staphylococcusaureus等常見食品腐敗致病菌具有抑制作用[34]。原位培養法提高了對醬香型白酒中潛在功能菌種的認識。

原位培養和傳統培養共有優勢屬中,Bacillus是2種培養法的絕對優勢屬。原位培養中Bacillus在5個儲存期總的IF為86.15%,共分離出Bacillus屬下的15個種;傳統培養中Bacillus在5個儲存期總的IF為58.95%,只分離出Bacillus屬下6個種(表1和表2)。除了5個共有種,原位培養獲得Bacillus獨有種10個。結果表明,原位培養分離出的Bacillus屬不僅優勢度大且種類多,體現了原位培養相較于傳統培養的分離優勢。Bacillus是醬香白酒的核心物種,具有產蛋白酶、淀粉酶、吡嗪和有機酸的功能,對白酒的生產和風味有重要影響[35-37]。基于原位培養法,人們將進一步加強對醬香型白酒絕對優勢功能屬Bacillus的認識,為改善白酒品質和風味提供參考。

本課題組研究發現同批次醬香大曲的高通量測序顯示絕對優勢菌屬并不是Bacillus,而是Kroppenstedtia。然而,本試驗原位培養法中卻未分離出Kroppenstedtia,這可能是由于Kroppenstedtia是一種高溫放線菌,而原位培養膜PCTE的孔徑只有0.03 μm,高溫放線菌的菌絲不能探出膜孔吸收外界營養物質。未來可將孔徑為0.22 μm的無菌生物濾膜應用到絲狀真菌及高溫放線菌的原位培養中[38]。

為全面探究3～8個月儲藏期大曲可培養細菌的菌群結構多樣性,分析了2種培養法整合后的大曲菌群數量變化(圖6),結果顯示6個月儲存期大曲中分離到的物種在種屬水平上均最豐富,但是整體上菌種數量波動較小。同時,5個儲藏期的大曲主要優勢菌群相似且穩定(表1和表2),可以投入生產使用。梁晨等[39]利用高通量測序發現貯存4～6個月大曲微生物群落結構及風味成分更有利于白酒的釀造。XI等[2]基于高通量測序發現春季醬香大曲的有效儲存期為6個月,夏季為2個月,秋季為6個月以上。本研究結果與上述研究基本吻合,因此,可選用3～8個月儲存期的陳曲釀酒。值得注意的是,有些菌屬在儲存后期的IF較高。原位培養和傳統培養法中Bacillus分別在8個月和6個月儲存期達到最大IF,分別為89.9%和78.9%(表1和表2)。Staphylococcus屬所有的種都在6～8個月儲存期才篩選到(表1和表2)。Bacillus是醬香白酒生產的核心物種[37]。WANG等[40]證明Staphylococcus是3種不同類型(白大曲、黑大曲和黃大曲)高溫大曲的主要細菌屬。這種高IF現象可能是因為儲存到后期的醬香大曲溫度和濕度比較適合這些菌的生長。醬香大曲在發酵結束后,需要在干燥環境下儲存并降低濕度,進一步優化大曲微生物菌系,從而積累大曲的酶系、香氣和風味[3]。因此,從微生物的菌屬特性、平衡角度分析,6個月儲存期的陳曲更適合投入生產。

3 結論

本研究首次采用原位培養法和傳統培養法技術對比分析不同儲存期茅臺鎮醬香型高溫大曲的細菌群落結構。與傳統培養法相比,原位培養能培養出更多種類的細菌,分離效率是傳統培養法的2倍。同時,原位培養基于高通量測序可篩選得到、難培養的功能微生物。盡管本研究只選取了不同陳化期的高溫大曲,樣品數較少,但研究結果較好地體現了原位培養技術在傳統釀造環境中分離培養功能微生物、挖掘豐富的微生物資源所具有的技術優勢和良好應用前景。本課題組接下來將繼續利用原位培養技術分離篩選糟醅和窖泥中的釀酒微生物,并進一步研究功能微生物。