微生物干預降低醬香型白酒釀造中的乳酸

羅寒,曾祥煉,陳良強,楊帆,杜海,黃旭

(貴州茅臺酒股份有限公司,貴州 仁懷,564500)

乳酸菌是白酒發酵過程中的主要微生物[1],大量乳酸菌的生長使白酒釀造過程中乳酸大量積累,酒醅酸度過高[2],影響其他產酒酵母的生長與產酒,其中食果糖乳桿菌在發酵產醇階段,通過異型乳酸發酵主導的乙醇代謝模式引起發酵體系乳酸過度積累, 造成“乳酸高酒精不低”的現象,影響后續輪次發酵[3]。因此,通過控制發酵體系生物因素來抑制酸敗菌的生長尤為重要。研究證明,當乳酸含量6 g/100 g時會顯著抑制酵母菌的生長與代謝[4-5]。

目前,降低酒醅中乳酸主要有2種途徑:一是物理除酸,例如,濃香型酒廠通過蒸餾后期,“大氣沖酸”[6],但乳酸為不易揮發性酸,效果不理想;另一種途徑是生物途徑,篩選能利用乳酸的微生物進行降酸,該方法能耗小、無污染且效率高,是當前的主要研究方向[7]。據統計,目前的研究主要選育具有較強乳酸耐受性的酵母菌菌株來提高白酒發酵高酸條件下的產酒力[8]。但是中國白酒的釀造屬于典型的多菌種自然發酵,依靠自然富集獲得的微生物發酵,產生不同特征風味的物質。在此過程中,通過釀造菌群自身降低酒醅中乳酸含量可以緩解乳酸對產酒酵母的抑制作用。畢赤酵母是白酒發酵中最常用的產酒功能菌株之一,在汾酒酒醅發酵前期畢赤酵母占真菌群落的60%以上[9],白云邊出入窖酒醅中,畢赤酵母屬占比約為40%[10],醬香型白酒釀造酒醅中畢赤酵母在前期輪次中占比大于80%[11]。畢赤酵母具有生長周期短、發酵能力強、容易進行大規模培養以及含有多種蛋白質、氨基酸、維生素、生物活性物質等豐富營養成分的優點,是基礎研究及應用研究的主要對象,廣泛應用于食品、醫藥等領域[12]。

研究發現,畢赤酵母有一定的降解乳酸功能[13-14]。然而,傳統釀造微生物自然富集過程存在較大的波動性。不同發酵系統,甚至不同香型白酒釀造中,產乳酸的菌群結構存在較大差異[15-16]。畢赤酵母能否有效抑制醬香型白酒釀造過程中普遍存在的乳酸菌,并實現降解乳酸有待進一步驗證。因此,需明確畢赤酵母對醬香型白酒中主要乳酸菌株的產乳酸抑制情況。

本研究以從醬香白酒釀造過程中篩選的耐酸畢赤酵母為研究對象,探索其在與不同類型乳酸菌混合發酵過程中產乳酸抑制效果,并通過酒醅原位發酵驗證其抑制作用。以期進一步推動自然發酵過程中靶向菌群富集方法與策略,通過生物途徑降低白酒發酵過程乳酸含量,為解決傳統發酵體系中乳酸過度積累共性問題提供理論和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 培養基

高粱汁培養基:將高粱與水按料液比1∶4(g∶mL)混合,按1 μL/g 高粱的添加量加入淀粉酶(20 000 U/mL)蒸煮液化,按5 μL/g 高粱的添加量在60 ℃時加入糖化酶(100 000 U/mL)糖化,4層紗布過濾,10 000 r/min離心10 min,上清液調節糖度至7°Bx。

富集培養基(g/L):乳酸40,葡萄糖50,蛋白胨20,酵母膏10,K2HPO42,NaCl 1,MgSO40.1,MnSO40.05。

篩選培養基(g/L):乳酸40,葡萄糖50,蛋白胨20,酵母膏10。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extracts peptone dextrose,YPD)液態培養基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母膏10;固態培養基加入20 g/L瓊脂。

上述培養基pH自然,115 ℃滅菌15～20 min。

1.1.2 檢測方法

乳酸:取1 mL發酵液于2 mL離心管,12 000 r/min、4 ℃離心10 min,取一定量的上清液,超純水稀釋30倍,經0.2 μm濾膜過濾,濾液進樣液相色譜分析。

乙酸:稱取15 g酒醅于50 mL離心管中,加入30 mL超純水,280 r/min振蕩15 min,超聲波處理5 min,4 ℃、4 000 r/min離心6 min,吸取上清液710 μL置于EP管中,加入790 μL 95%乙醇,-20 ℃冷凍2 h以上,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,離心后上清液(不少于0.5 mL)轉移至2 mL樣品瓶中進樣分析。

乙醇:取15 g酒醅于50 mL離心管中,加入30 mL超純水,280 r/min振蕩15 min,超聲波處理5 min,4 ℃、4 000 r/min離心6 min,吸取4 mL上清液于20 mL 頂空進樣瓶中進樣分析。

1.2 實驗菌株

菌株:庫德里阿茲威氏畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)JP-Y08,來源于茅臺酒發酵過程酒;乳酸菌:植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、橋乳桿菌(Lactobacilluspontis)、面包乳桿菌(Lactobacilluspanis)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、食果糖乳桿菌(Lactobacillusfructivorans),茅臺酒發酵過程酒醅;畢赤酵母模式菌株(ATCC 6258),購買的模式菌株。

1.3 菌株篩選

稱取樣品10 g于90 mL帶玻璃珠的無菌水中,振蕩均勻,吸取0.1 mL上清液于100 mL富集培養基中,分別在有氧/無氧、30 ℃/37 ℃條件下靜置培養2～4 d,觀察培養液是否渾濁;若培養液已明顯渾濁時,吸取0.1 mL富集培養液于新的100 mL液態篩選培養基中30 ℃靜置培養2 d,培養3～4次后將培養液梯度稀釋于YPD固體培養基上,培養3～4 d后,其單菌落即為抗乳酸特性的目標菌株。

1.4 菌株鑒定

將篩選得到的耐乳酸特性菌株接種于YPD固體培養基上,30 ℃培養4 d,觀察菌落形態,將菌落圓形,且表面光滑的菌株多次純化后,進行分子生物學鑒定。

分子生物學鑒定:采用試劑盒法提取基因組[17],以其為模板對目標菌株的26S rDNA D1/D2區基因序列進行PCR擴增。測序引物為NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。PCR擴增體系(25 μL):Taq-Mix酶12 μL,引物NL1和引物NL4各1 μL,模板1 μL,ddH2O 10 μL。PCR擴增程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環30次;72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠檢驗合格后送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將26S rDNA D1/D2區測序結果上傳NCBI數據庫中進行BLAST比對分析,待鑒定菌株和與其親緣關系最近的模式菌株的同源率大于99%,初步判定兩者為同一種。

1.5 畢赤酵母對4種乳酸菌的產酸抑制

將畢赤酵母菌株接種于YPD液體培養基中,于30 ℃預培養至菌體濃度OD600值為0.3,獲得畢赤酵母種子液。將從酒醅中原位篩選的植物乳桿菌、乳酸片球菌、橋乳桿菌、面包乳桿菌分別接種于MRS液體培養基中,于37 ℃預培養至OD600值達0.3。

將7.5 μL畢赤酵母種子液、畢赤酵母模式菌株(ATCC 6258)種子液分別與7.5 μL植物乳桿菌、乳酸片球菌、橋乳桿菌、面包乳桿菌種子液混合接種于1.5 mL高粱汁培養基中,37 ℃下靜置培養72 h,測定發酵終點的發酵液中乳酸含量及乳酸菌菌體量。試驗分組見表1。

表1 試驗分組

1.6 畢赤酵母與同型、異型乳酸菌混合發酵

將鑒定后所得的庫氏畢赤酵母菌株JP-Y08接種于YPD液體培養基中,于30 ℃預培養至菌體濃度約為109CFU/mL,獲得畢赤酵母種子液。制備食果糖乳桿菌(異型乳酸菌)、發酵乳桿菌(同型乳酸菌)種子液菌體濃度約為109CFU/mL。

(a)純種發酵:將畢赤酵母以2%接種量接種于液體培養基(終濃度約為106CFU/mL),按流程進行發酵。

(b)混合發酵將畢赤酵母和乳酸菌以:①10∶1(2%∶0.2%);②10∶10(2%∶2%);③1∶10(0.2%∶2%)接種于液體培養基,按流程進行發酵(圖1)。

圖1 試驗流程

1.7 畢赤酵母在白酒發酵過程中的降乳酸應用

為了驗證庫氏畢赤酵母JP-Y08菌株在發酵過程中對酒醅高酸、結塊、霉變等異常發酵狀態的改善情況,本試驗選擇前期輪次發酵程度不太理想的窖號進行實驗。

將畢赤酵母接種于高粱汁液體培養基中,30 ℃恒溫振蕩培養48 h,將獲得的培養液12 000 r/min離心10 min,棄上清液,獲得畢赤酵母的菌體細胞沉淀,用無菌水洗滌數次,并用血球計數板計算酵母菌液的濃度,調節菌體量為106CFU/g菌泥,備用。

實驗組:將畢赤酵母CGMCC No:14068菌劑按5%(質量百分比)的比例與制酒生產中已丟堆的糟醅(500±10) g混合均勻,疏松地裝于搪瓷缸中,并用紗布封口后,埋于制酒生產輪次堆積發酵階段酒醅中,于發酵堆深約50 cm處,設置3個平行。

對照組:將制酒生產中已丟堆的糟醅(500±10)g,疏松地裝于搪瓷缸中,并用紗布封口后,與實驗組同埋于制酒生產輪次堆積發酵階段酒醅中,于發酵堆子深約50 cm處,共設置3個平行。

窖內發酵階段,將上述實驗組和對照組同時轉移至窖內酒醅距窖面深約1.5 m處,窖內發酵結束,對酒醅的乳酸含量進行檢測,并觀察發酵感官情況。

1.8 數據處理與分析

利用SPSS 20.0分析不同組間差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

從醬香型酒醅中通過5次富集、篩選,初步分離得到具有乳酸耐受性,且穩定性較強的目標菌株45株,菌株編號分別為JP-Y01～JP-Y45。45株菌株的測序結果經BLAST比對發現,與庫德里阿茲威氏畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)NRRL Y-5396的26S rDNA基因序列相似度大于99%的菌株有21株,從中選擇抑制產乳酸效果最好的菌株JP-Y08進行后續研究。

2.2 畢赤酵母對乳酸菌的產酸抑制

由表2可知,畢赤酵母菌株JP-Y08與植物乳桿菌、乳酸片球菌、橋乳桿菌或面包乳桿菌混合發酵,可使混合發酵體系的乳酸含量下降64.0%～94.1%,而畢赤酵母模式菌株ATCC 6258的混合發酵體系乳酸含量僅下降25%～50%,產乳酸抑制效果遠低于本研究的菌株,且純乳酸菌發酵和與畢赤酵母混合發酵組別、添加JP-Y08與ATCC 6258組別之間乳酸含量差異均極顯著(P<0.01)。

表2 不同培養體系發酵終點的乳酸含量

2.3 畢赤酵母與同型乳酸菌、異型乳酸菌混合發酵

由圖2可知,畢赤酵母與同型、異型乳酸菌混合發酵時,乳酸變化趨勢大致相同。

a-異型乳酸發酵;b-同型乳酸發酵

厭氧發酵結束時(圖2-a),異型乳酸菌純種發酵乳酸含量為1.27%,當與畢赤酵母混合發酵時,培養基中的乳酸含量為0.18%～0.68%;厭氧發酵結束時,同型乳酸菌純種發酵的乳酸含量為1.50%(圖2-b),與畢赤酵母混合發酵時,乳酸含量為0.37%～0.73%。整個發酵過程乳酸菌純種發酵乳酸含量在1.2%～1.5%,添加畢赤酵母的組別乳酸含量為0.04%～0.73%,混合發酵產生的乳酸明顯低于乳酸菌純種單獨發酵組別,且畢赤酵母接種量越高,乳酸含量越低;厭氧發酵結束時,同型乳酸發酵產生的乳酸大于異型乳酸發酵,該結果表明畢赤酵母對異型乳酸發酵的產乳酸抑制作用強于同型乳酸發酵。

厭氧發酵結束時,(圖3)異型乳酸菌純種發酵總醇含量峰面積1 g處理后為7.08,同型乳酸菌純種發酵為6.29,異型乳酸菌發酵產醇能力大于同型乳酸菌;添加畢赤酵母組別總醇含量均大于乳酸菌純種發酵。

a-異型乳酸發酵;b-同型乳酸發酵

2.4 畢赤酵母在白酒發酵過程中的降乳酸應用

在搪瓷缸中添加畢赤酵母的實驗組酒醅疏松、滋潤、色澤正常,而未添加畢赤酵母的原位對照組酒醅結塊、呈灰白色,有霉變跡象。因此,添加畢赤酵母能顯著改善酒醅的發酵狀態。

由表3可知,對照組酒醅中的乳酸含量為9.32 g/kg酒醅,乙酸含量為1.61 g/kg酒醅,添加畢赤酵母酒醅中的乳酸含量為3.26 g/kg酒醅,乙酸含量為0.78 g/kg酒醅,乳酸的下降率為64.9%,乙酸下降率為51.3%,與對照組相比,實驗組的乳酸和乙酸含量差異極顯著(P<0.05)。同時,實驗組酒醅中的乙醇含量為17.47 g/kg酒醅,與對照組相比,乙醇增加量約0.5 g/kg酒醅。因此,添加畢赤酵母不僅能降低發酵過程有機酸含量,且對乙醇產量無顯著影響。

表3 原位發酵組、PK添加組及乳酸和乙酸下降率

通過高通量測序進一步分析發酵酒醅的微生物結構,如圖4所示,添加畢赤酵母后的實驗組酒醅真菌群落以畢赤酵母(Pichia)、嗜熱子囊菌(Thermoascus)、釀酒酵母(Saccharomyces)和嗜熱真菌屬(Thermomyces)為主,與正常發酵班組酒醅的微生物結構是類似的。而未添加畢赤酵母及原位酒醅的真菌群落則以紅曲霉(Monascus)和接合酵母(Zygosaccharomyces)為主。由此可見,在醬香型白酒生產過程中,添加畢赤酵母微生態制劑可以顯著抑制絲狀真菌的過度繁殖。結合理化指標分析可知,添加畢赤酵母的組別與對照組的乙醇含量無顯著性差異,同時可以顯著減低乙酸和乳酸的含量,這對于維持白酒發酵菌群結構具有重要意義。

圖4 添加畢赤酵母(實驗組)、原位酒醅(對照組)酒醅微生物結構分析

3 結論與討論

本研究的畢赤酵母菌株與植物乳桿菌、乳酸片球菌、橋乳桿菌或面包乳桿菌混合發酵,可使混合發酵體系的乳酸含量下降64.0%～94.1%,而畢赤酵母模式菌株ATCC 6258的混合發酵體系乳酸含量僅下降25%～50%,產乳酸抑制效果遠低于本研究的菌株。畢赤酵母與同型、異型乳酸菌混合發酵時,產生的乳酸明顯低于乳酸菌純種單獨發酵組別,且畢赤酵母接種量越高,乳酸含量越低,畢赤酵母對異型乳酸發酵的產乳酸抑制作用強于同型乳酸發酵。畢赤酵母對發酵體系產乳酸抑制作用的原位驗證試驗表明,添加畢赤酵母可以顯著改善酒醅的發酵狀態,降低酒醅中有機酸的含量而不影響乙醇產量,這對于維持白酒發酵釀酒酵母菌群的增殖和穩定白酒產量具有重要意義,但畢赤酵母對發酵體系產乳酸抑制作用的機理尚不清楚,需后續進行更全面的文獻查閱,設計相關試驗進行更深入的研究。

因此,本研究的畢赤酵母菌株對發酵體系具有較強的產乳酸抑制作用,具備作為生物途徑降低發酵乳酸含量微生物菌種的潛力。若通過更大規模的生產試驗驗證,則可作為降乳酸強化菌劑的菌種資源應用于白酒生產,也為通過主動菌群干預解決白酒釀造過程中乳酸的過度積累導致產酒酵母菌群失調和產酒率低下等行業共性難題提供了研究基礎。