足球菌協同發酵對低鹽固態醬油風味與品質的影響

王濤,胡光耀,方芳*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)2(江南大學 未來食品科學中心,江蘇 無錫,214122)3(食品合成生物技術教育部工程研究中心(江南大學),江蘇 無錫,214122)4(江蘇省食品合成生物技術工程研究中心(江南大學),江蘇 無錫,214122)

醬油是由大豆、小麥等原料通過米曲霉、酵母菌和細菌等微生物發酵而成,具有獨特風味和鮮美滋味的一種調味品。目前醬油的生產方法主要有高鹽稀態發酵法和低鹽固態發酵法2種。低鹽固態法發酵的醬油具有上色效果好和醬香突出的優點,但鮮味和風味較高鹽稀態法釀造的醬油存在差距[1-2]。

生產低鹽固態醬油的發酵溫度較高(45～55 ℃),發酵周期(20～30 d)較短。因此,低鹽固態醬油在顏色、品質和風味方面存在顏色容易發黑、氨基酸態氮含量相對較低、風味物質含量較低等有待改善的問題。前期研究通過優化原料組成和發酵工藝在改善低鹽固態醬油風味方面取得一定效果。例如選用小麥麩皮酶解進行發酵,醬油氨基酸態氮含量增加33.68%,4-乙基愈創木酚提高66.18%[3]。通過降低發酵溫度等優化發酵工藝的方式減少了高溫對酶活性和微生物生長代謝的不利影響,醬油氨基酸態氮含量提高了20%,醇類提高了10%[4]。醬油中風味物質的形成與米曲霉、酵母、乳酸菌等不同種類微生物之間相互作用存在一定關系[5-7]。通過發酵菌種的分離、選育、誘變等生物技術手段篩選出產酶能力強、抗逆性強、適用不同醬油釀造工藝的米曲霉,在一定程度上提高了原料利用率并改善了醬油風味[8]。真菌是醬油發酵過程中合成揮發性風味物質的重要微生物,不耐高溫、具有良好抗逆性的細菌是改善低鹽固態醬油品質的潛在功能微生物[9-11]。例如,芽孢桿菌和葡萄球菌可通過分泌蛋白酶和淀粉酶促進醬油發酵,也能代謝產生吡嗪類、酸類物質使醬油風味更加濃郁[12-13]。乳酸菌是參與發酵食品的常見微生物,它們被廣泛用于改善發酵食品的滋味與香氣[14-16]。足球菌(Pediococcus)是一類存在于酸奶、泡菜、醬油等發酵食品中的乳酸菌[17]。前期研究證實,將其用于制作香腸可降低硝酸鹽含量,并提高乙酸異戊酯、己酸異戊酯、乙酸己酯等風味物質含量;在驢奶發酵時添加足球菌,可提高酸奶的顏色指標和感官品質,并使乙醛含量增加,提升酸奶香氣[18-22]。食品發酵體系中存在的安全有益細菌是否也具有改善低鹽固態醬油風味與品質的作用還有待證實。

本研究將從醬醅中分離篩選可耐受低鹽固態發酵條件(較高溫度和鹽的脅迫)的功能細菌,通過考察添加功能細菌對低鹽固態醬油理化指標和品質與風味特性的影響,揭示功能微生物用于低鹽固態醬油發酵的可行性,為開展研究功能細菌協同發酵改善低鹽固態醬油的品質與風味提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本研究所用菌株如表1所示。

表1 本研究所用菌株

1.1.2 培養基

MRS(Man Rogosa Sharpe)培養基(g/L):尿素2,牛肉膏2.5,酵母膏2,檸檬酸三銨2,葡萄糖2,吐溫80 1 mL,乙酸鈉5,K2HPO42,MgSO40.2,MnSO40.05。

LB(Luria-Bertani)培養基(g/L):胰蛋白胨1.0,牛肉膏0.3,NaCl 0.5,pH 7.4。

1.2 儀器與設備

恒溫恒濕培養箱,常州首創儀器設備公司;PCR儀,美國伯樂公司;恒溫培養箱、恒溫搖床,上海躍進醫療器械廠;UVmini-1280分光光度計、GC-2010AF氣相色譜質譜聯用儀,日本島津公司;高效液相色譜儀,美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基

細菌分離篩選:取醬醅樣品(25 g)加入225 mL無菌生理鹽水,于37 ℃下220 r/min振蕩1 h。取100 μL液體梯度稀釋液涂布于含2 g/L山梨酸的MRS和LB固體培養基,37 ℃培養24 h。挑取單菌落劃線分離純化3次后用分離培養基培養至對數后期,然后保藏于-80 ℃。

細菌種屬鑒定:采用上海生工生物公司細菌基因組提取試劑盒提取菌株的基因組DNA,并以此為模板用16S rRNA通用引物27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492 R(5′-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3′)進行PCR擴增。PCR產物送至天霖生物科技無錫有限公司測序,測序結果在NCBI進行BLAST比對,利用MEGA-X軟件構建菌株系統發育樹。

1.3.2 細菌耐受特性分析

耐溫特性分析[17]:將菌株以2%的接種量接種至MRS液體培養基,45 ℃靜置培養12 h或LB液體培養基45 ℃,220 r/min振蕩培養12 h。取1 mL菌液測定600 nm處吸光值。

耐鹽特性分析[17]:將菌株以2%的接種量接種至含8% NaCl的MRS液體培養基37 ℃靜置培養12 h或LB液體培養基37 ℃,220 r/min振蕩培養12 h。取1 mL菌液測定600 nm處吸光值。

1.3.3 低鹽固態醬油發酵

將蒸熟的(121 ℃,30 min)豆粕與面粉混勻[m(豆粕)∶m(面粉)=5∶1],以原料總質量的1.5‰接種A.oryzae滬釀3.042;濕度95%、30 ℃培養48 h制得成曲。將成曲與140 g/L的鹽水按1∶1質量比混合為醬醅,醬醅中鹽的終質量濃度為70～80 g/L。將醬醅(200 g)裝入250 mL燒杯中,輕壓至厚度為6 cm,用無碘食鹽覆蓋(厚度為3 cm)。起始發酵溫度為40 ℃,以1 ℃/d升溫至42 ℃,第3天升溫至45 ℃后發酵25 d。協同發酵是在發酵第0天接入P.acidilacticiWT1(終濃為108CFU/g)。在發酵第0、1、2、3、4、9、14、25天取樣置于-80 ℃保存。

1.3.4 醬醅微生物數量分析

取醬醅樣品(25 g)加入225 mL無菌生理鹽水,于37 ℃、220 r/min,振蕩1 h。取100 μL梯度稀釋液涂布于含2 g/L山梨酸的MRS和LB固體培養,37 ℃培養24 h后進行活菌計數[20]。Pediococcus數量分析采用菌落PCR計數的方法:挑取平板上的菌落至PCR管中,利用Pediococcus特異性引物[17]Pa-F(5′-CGAACTTCCGTTAATTGATTAT-3′)和 Pa-R(5′-ACCTTGCGGTCGTACTCC-3′)擴增。PCR體系為:DNA模板0.5 μL(50 ng/μL),Taq酶10 μL,上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L),ddH2O 8.5 μL;擴增條件:94 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,12 ℃ 10 min。產物進行凝膠電泳分析有目的條帶的即為Pediococcus。

1.3.5 醬醅理化指標分析

取5 g醬醅,加入45 mL無菌水超聲振蕩30 min,于6 000 r/min離心5 min取上清液進行理化分析。總酸和氨基酸態氮的測定采用滴定法,具體方法參考文獻[4]。

1.3.6 醬油顏色和風味物質含量分析

樣品處理:除去醬醅上層鹽封,加入與醬醅相同質量的100 ℃水,45 ℃恒溫浸泡12 h,6 000 r/min、30 min離心,取上清液按1∶1的體積比添加50 g/L的三氯乙酸,常溫避光處理30 min,用0.22 μm水系濾膜過濾,取濾液用于檢測。

顏色指數測定:取稀釋100倍的樣品1 mL分別測定460、510、610 nm處吸光值,色率、紅色指數和黃色指數計算如公式(1)～公式(3)所示[24]:

(1)

(2)

(3)

有機酸含量測定采用高效液相色譜法[12]。液相系統:島津20A,色譜柱:Aminex-HPX-87H (300 mm×7.8 mm,9 μm);流動相5 mmoL/L稀H2SO4,進樣體積10 μL,洗脫速度0.5 mL/min,洗脫時間30 min柱溫40 ℃,檢測器UV 210 nm。

游離氨基酸測定采用高效液相色譜法[17]。樣品采用鄰二甲苯(o-xylene,OPA)進行柱前衍生。液相系統:安捷倫1260,色譜柱ODS HYPERSIL(250 mm×4.6 mm,2.5 μm);流動相A相:無水乙酸鈉5 g,四氫呋喃5 mL,三乙胺200 μL,pH 7.2;流動相B相:無水乙酸鈉5 g,超純水200 mL,甲醇400 mL,乙腈400 mL,pH 7.2。進樣體積10 μL;洗脫速度1 mL/min;洗脫時間40 min;柱溫40 ℃;檢測器UV338 nm。

揮發性風味物質采用固相微萃取氣質聯用技術(solid phase microextraction-gas chromatography- mass spectrometry,SPME-GC-MS)進行測定[4]。取5 mL醬油樣品,添加2-辛醇(終質量濃度為100 μg/L)作為內標。萃取條件:醬油樣品(5 mL),50 ℃水浴30 min后,將萃取頭深入液面1 cm,吸附30 min,插入氣相色譜進樣口,240 ℃解吸15 min。氣相色譜條件:進樣口250 ℃,色譜柱TG-WAMS(60 m×250 μm×0.25 μm),載氣高純He,不分流進樣;梯度升溫程序為:45 ℃保持1 min,以每分鐘3 ℃升至130 ℃,以每分鐘6 ℃升至200 ℃,再以每分鐘8 ℃升至230 ℃恒溫10 min。質譜條件:電離源(EI),離子源溫度220 ℃,界面溫度250 ℃,離子源能量70 eV,電子掃描范圍為全掃描,通過NIST標準譜庫根據保留指數(retention index,RI)和相似指數(similarity index,SI)大于800對風味物質進行檢索鑒定,以內標2-辛醇的峰面積對化合物進行半定量分析。

1.3.7 感官評價

將10 mL發酵25 d的醬油置于25 mL品評杯中,由15名科研人員組成的評價小組對醬油色澤、香氣、滋味、狀態、總體接受程度進行評價。具體評價標準如表2所示。

表2 醬油感官評價標準[22]

1.3.8 統計學方法

采用SPSS 19.0、Excel、Origin 8.0軟件進行數據分析及可視化,數據以平均值±標準偏差表示,以P<0.05表示數據之間的顯著性差異,所有數據平行測定3次。

2 結果與分析

2.1 醬醅中細菌的分離與耐受能力比較

2.1.1 醬醅中細菌的分離與鑒定

從發酵醬醅中共分離得到6個屬(Bacillus、Pediococcus、Weissella、Staphylococcus、Enterococcus和Enterobacter)的18株細菌(圖1),包括Bacillusvelezensis、Bacilluspumilus、Bacillussubtilis、Bacillushalotolerans、Bacillusamyloliquefaciens5株芽孢桿菌;屬于Pediococcusacidilactici、Pediococcuspentosaceus、Weissellaparamesenteroides、Enterococcusdurans、Enterococcusfaecium5個種的9株乳酸菌;2株葡萄球菌StaphylococcussaprophyticusFSPT1和StaphylococcusepidermidrsBPT1;2株腸桿菌EnterobacterhormaecheiHS1和EnterobacterludwigiiLDWX1。

圖1 基于16S rRNA 序列構建的菌株的系統發育樹

2.1.2 醬醅細菌的耐溫和耐鹽能力比較

由于低鹽固態醬油發酵溫度較高,可在45 ℃和8%NaCl條件下生長良好的菌株更具有用于低鹽固態醬油發酵的潛力。因此,在應用菌株進行醬油發酵前考察了這些菌株在較高溫度和有鹽培養條件下的生長情況,結果如圖2所示。

a-45 ℃;b-8% NaCl

Pediococcus在45 ℃下的生長優于Weissella、Enterobacter、Enterococcus、Staphylococcus和Bacillus菌屬的菌株。其中P.acidilacticiWT1在45 ℃下生長最好,OD600達到2.44。培養基中添加8% NaCl對菌株的影響與45 ℃培養條件下的情況類似,Pediococcus的生長優于Weissella、Enterobacter、Enterococcus、Staphylococcus和Bacillus。其中P.acidilacticiWT1生長最好,OD600達到0.73。以上結果表明,P.acidilacticiWT1是所考察菌株中可在45 ℃、8% NaCl下生長最好的菌株,具有可參與低鹽固態醬油發酵的應用潛力。因此,本研究后續考察P.acidilacticiWT1協同發酵對低鹽固態醬油理化和品質的影響。

2.2 Pediococcus協同發酵對低鹽固態醬醅細菌數量的影響

為確定在發酵起始添加菌株是否可起到在低鹽固態醬油發酵過程強化Pediococcus的作用,本試驗研究了發酵過程醬醅中細菌總數和Pediococcus數量的變化。結果如圖3所示。

圖3 發酵過程中細菌總數和足球菌數量的變化

未添加菌株的對照從發酵起始,總細菌數和Pediococcus的數量逐漸下降,細菌總數和Pediococcus數量分別在發酵第4天和第2天降至104CFU/g,到發酵中后期醬醅中已檢測不到活的細菌。添加P.acidilacticiWT1進行發酵的醬醅中,細菌總數和Pediococcus的數量到第9天時醬醅中總細菌數和Pediococcus不可計;在發酵第4天,P.acidilacticiWT1中的總細菌數為4.8×106CFU/g高于對照組2.38個數量級,Pediococcus的數量為4.5×106CFU/g高于對照組4.59個數量級。表明添加P.acidilacticiWT1能夠起到在低鹽固態發酵中強化該菌的作用。本研究通過強化P.acidilacticiWT1使得醬醅中細菌數量顯著高于對照,這可能與實際低鹽固態醬油發酵過程醬醅中微生物組成和數量存在一定差異。今后可在考察強化P.acidilacticiWT1對醬醅菌群影響的基礎上,深入揭示強化此菌對低鹽固態醬油發酵的影響。

2.3 P.acidilactici WT1 協同發酵對低鹽固態醬油理化特性的影響

2.3.1P.acidilacticiWT1協同發酵對醬油理化指標的影響

為了探究P.acidilacticiWT1對醬油品質的影響,試驗研究了該菌株對醬油理化特性的相關指標。由圖4可知,P.acidilacticiWT1協同發酵有利于醬油中氨基酸態氮含量的增加,發酵終點時達到1.74 g/100 g,比對照組高9.43%,醬醪體系中包括嗜鹽四聯球菌和魏斯氏菌等很多乳酸菌都具有寡肽酶活性。本研究通過Pediococcus協同發酵提高了醬油中氨基酸態氮含量,這可能與其具有蛋白酶活性有關[16]。添加P.acidilacticiWT1對醬油總酸的影響不顯著。

圖4 醬油發酵過程理化指標的變化

2.3.2P.acidilacticiWT1協同發酵對醬油中有機酸含量的影響

有機酸是醬油中的重要物質組成,其中非揮發性有機酸對醬油的風味有重要貢獻。例如琥珀酸及其鈉鹽能調節咸味同時具有加乘鮮味的作用[19],酒石酸是低鹽固態醬油中重要的呈味有機酸,可以提高醬油的醇厚感[23]。本研究發現P.acidilacticiWT1協同發酵的醬油中檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等有機酸含量均有顯著增加,有機酸總量為30.04 g/L,比對照高48.56%(圖5)。利用P.acidilacticiWT1協同發酵,醬油中琥珀酸含量增加71.87%,酒石酸增加4.38倍。這些有機酸的合成與積累一方面與乳酸菌代謝有關,例如Pediococcus可通過糖酵解(Embden-Meyerhof-Parnas,EMP)途徑積累檸檬酸、琥珀酸和蘋果酸,其中間代謝產物丙酮酸也可被還原生成乳酸或乙酸。另一方面,Pediococcus也可通過生長和代謝影響體系中其他微生物的代謝,合成或積累相關有機酸[16]。

圖5 醬油中有機酸含量的比較

2.3.3P.acidilacticiWT1協同發酵對醬油中色澤的影響

上色效果是低鹽固態法生產醬油的重要感官特性指標之一[4]。醬油上色效果主要通過色率表征醬油顏色的深淺,以及用紅色指數和黃色指數表征主要顏色的呈色情況[24]。如圖6所示,通過P.acidilacticiWT1協同發酵可使醬油顏色顯著加深,并可使色率增加21.36%;紅色指數和黃色指數絕對值分別提高0.36和0.32。這說明利用P.acidilacticiWT1協同發酵使低鹽固態醬油的色澤更加紅潤、透亮,對提升醬油的上色效果有顯著作用。這可能與發酵期間乳酸菌生長消耗了體系中的葡萄糖或戊糖,減少或減緩了美拉德反應,從而使醬油顏色趨于紅亮[24]。

圖6 醬油顏色指標的比較

2.4 P.acidilactici WT1協同發酵對醬油中游離氨基酸的影響

前期研究證實,Pediococcus可以合成用于水解原料生成氨基酸的氨肽酶和端肽酶[17]。如圖7所示,P.acidilacticiWT1協同發酵的醬油中氨基酸總量為21.59 g/L,較對照提高了18.43%。天冬氨酸和谷氨酸是醬油主要呈鮮物質[17]。P.acidilacticiWT1協同發酵的醬油中這2種鮮味氨基酸總量較對照提高了35.16%,甜味氨基酸(絲氨酸和丙氨酸)提高了13.44%,苦味氨基酸比例降低了3.28%。P.acidilacticiWT1協同發酵能顯著提高醬油中鮮味和甜味氨基酸含量,降低苦味氨基酸所占比例,從而有助于提高醬油的品質。

a-游離氨基酸總量;b-主要游離氨基酸含量比較

2.5 P.acidilactici WT1協同發酵對醬油揮發性風味物質的影響

醬油中的揮發性物質構成了醬油的主體風味,它的種類和含量與醬油風味密切相關。如圖8-a所示,共檢測到醇類、醛類、酮類、酯類、酚類和其他雜類共87種風味物質。添加P.acidilacticiWT1協同發酵醬油風味物質種類增加16種,揮發性風味物質總量為702.94 μg/L較對照組提高了19.95%;醇類、酮類和雜類分別提高了16.79%、17.52%和31.48%,而酯類和酚類則分別提高了90.53%和50.02%。然而總揮發性風味物質的含量提高并不能代表醬油的品質及風味的上升,我們對醬油中主要風味物質的變化進行了分析,如圖8-b所示,P.acidilacticiWT1協同發酵醬油中苯乙醇和異戊醇是主要的醇類風味物質,較對照提高16.83%和21.86%。苯乙醇和異戊醇是醬油中呈花香的重要風味物質,對醬油香氣有較大貢獻,能增加醬油滋味口感。

a-揮發性風味物質總量;b-主要揮發性風味物質比較

劉蕊[4]通過在低鹽固態醬油中強化Lactobacillus和Zygosaccharomycesrouxii,醬油中苯乙醇、異戊醇和1-辛烯-3-醇等主要風味物質含量顯著提升。P.acidilacticiWT1協同發酵醬油中主要酚類物質愈創木酚和苯酚,占總酚的89.13%,較對照提高了35.49%和50.64%;愈創木酚和苯酚是醬油煙熏香味的特征活性物質和主要貢獻者[15-16],強化Tetragenococcushalophilus可以顯著提高醬油的愈創木酚、4-乙基愈創木酚、異戊醇、1-辛烯-3-醇等醬油主要風味物質,進而提高醬油的風味及品質[12]。通過強化P.acidilacticiWT1能顯著增加低鹽固態醬油風味,特別是提高了醬油中主要揮發性風味物質。

2.6 醬油的感官分析

發酵結束時,醬油的感官雷達圖如圖9所示。P.acidilacticiWT1協同發酵醬油的體態無差別,滋味增加,色澤和香氣顯著提升,這表明通過添加P.acidilacticiWT1協同發酵使低鹽固態醬油滋味更加醇厚,色澤更加鮮亮,醬香更加濃郁,顯著提升了醬油品質,接受度提高。

圖9 醬油感官分析

3 結論

低鹽固態醬油是一個多種微生物參與的混菌發酵體系,其中米曲霉、酵母菌和乳酸菌是最主要的參與者。在發酵前期,乳酸菌快速生長繁殖,代謝產生酸類物質,降低醬醅pH,抑制雜菌生長的同時還產生風味物質,是醬油發酵的重要微生物。本研究篩選到1株在45 ℃,8% NaCl培養條件下耐受性良好的乳酸菌P.acidilacticiWT1,添加P.acidilacticiWT1,發酵第4天時醬醅中的總細菌數和Pediococcus顯著高于對照組2.38和4.59個數量級,表明添加P.acidilacticiWT可強化醬醅中的足球菌。采用P.acidilacticiWT1協同發酵,醬油中有機酸總量提高了48.56%,其中呈風味的琥珀酸增加了71.87%,酒石酸提高了5.43倍;鮮味氨基酸天冬氨酸含量提高了64.88%。P.acidilacticiWT1協同發酵,醬油的色率提高21.36%,紅色指數和黃色指數提高6.87%和4.42%,醬油更加紅潤、鮮亮,提高了醬油的上色效果。發酵過程中產生的醇、醛、酮、酯、酚等揮發性風味物質總量增加19.95%;醬油風味的重要貢獻者苯乙醇、異戊醇、愈創木酚和苯酚提高了16.83%、21.86%、35.49%和50.64%。本研究通過強化1株在低鹽固態醬油中能夠生長良好的Pediococcus,提高了醬油的品質及風味,為提高低鹽醬油品質及風味提供重要參考意義。