氫氧化鈉-乳酸協同處理對貽貝殼角質層的凈化作用

柯志剛,陳進宇,相興偉,陳慧,周緒霞,金友定,戴央章,鄧尚貴,周小敏,丁玉庭,劉書來,8*

1(浙江工業大學 食品科學與工程學院,浙江 杭州,310014)2(浙江省深藍漁業資源高效開發利用重點實驗室,浙江 杭州,310014)3(國家遠洋水產品加工技術研發分中心(杭州),浙江 杭州,310014)4(海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心,大連工業大學,遼寧 大連,116034)5(嵊泗縣景晟貽貝產業發展有限公司,浙江 嵊泗,316000)6(浙江海洋大學 食品與藥學學院,浙江 舟山,316000)7(浙江興業集團有限公司,浙江 舟山,316000)8(寧海縣浙工大科學技術研究院,浙江 寧波,315600)

貽貝是一種常見的食用性貝類,其營養豐富,蛋白質含量高,且富含多種生理活性物質,具有抗菌、調節血壓、抗凝血等功能[1],在我國山東、遼寧、浙江等沿海省份大量養殖。我國目前對貽貝的利用主要局限于可食用的貝肉部分,對占總質量60%以上的貝殼卻很少涉及。未被利用的貝殼作為固體廢棄物丟棄在海邊,不但占用了土地資源,還會造成環境污染和部分沿海區域生態系統的嚴重退化[2]。貽貝殼的主要成分是CaCO3,作為海洋源CaCO3,其安全性優于礦石和動物骨源CaCO3,這是由于礦石源CaCO3常殘留有重金屬等有害成分,而動物骨源CaCO3品質易受畜禽疫情的影響[3]。

鈣是動物體內僅次于碳、氫、氧、氮的第5種重要元素,對維持生物體正常結構和功能有重要作用。以貝殼為鈣源,已制備出乳酸鈣、葡萄糖酸鈣、氨基酸螯合鈣等一系列補鈣產品[4-6]。貽貝殼由外及內可分為角質層、棱柱層、珍珠層[7]。角質層主要由硬質蛋白組成,其中含有大量天然黑色素[8]。棱柱層和珍珠層是CaCO3晶體,主要有方解石CaCO3和球霰石CaCO3[9],是貝殼的主要成分。黑色素溶解性差,不易分離,且因含有吲哚環、芳香環、氨基和烴基等官能團[10]而具有吸附性,使貽貝殼表面含有一定量的其他元素和重金屬[11]。這些成分不僅影響鈣補充劑制備效率,甚至會影響其品質和安全性。在已有以貝殼為鈣源制備各種鈣補充劑的相關研究中[12-13],均未對貝殼表面的角質層及黏連角質層的低純CaCO3進行脫除,因此產品品質存在一定的不確定性。

貽貝殼中的黑色素易溶于堿溶液[14],表面黏連有硬質蛋白的低純CaCO3可與酸反應生成可溶的鈣離子化合物[15]。鑒于此,本研究擬采用NaOH-乳酸溶液協同處理,以明暗度和質量損失率為指標,篩選出對貽貝殼表面角質層和黏連有角質層的低純CaCO3具有最佳凈化效果的條件。為減少所使用試劑對環境可能帶來的污染,本探究所選用的NaOH濃度較低(pH 9～13),且選用有機酸乳酸(pH 2～5)進行酸處理劑。對凈化后貽貝殼的微觀結構和表面殘留成分的化學組成進行分析,對其表面元素組成、表面鈣含量、重金屬含量等進行測定,綜合評判NaOH-乳酸協同處理對貽貝殼的凈化作用,為高品質貽貝殼源鈣補充劑的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貽貝殼,杭州朝暉六區農貿市場;NaOH(食品級),湖北鑫潤德化工有限公司;乳酸(食品級),上海鼎通生物工程有限公司;鹽酸(食品級),武漢三勤化工科技有限公司;KBr(光譜級),上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

電熱鼓風干燥箱,上海一恒科學儀器有限公司;KQ-300DE超聲清洗設備,昆山清洗設備有限公司;DLH-250型高速多功能粉碎機,武義祺騰電器有限公司;Color Quest色差儀,美國HunterLab公司;PHS-E pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司;Prisma-E掃描電鏡,美國FEI公司;Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀,Thermo Nicolet公司;NexION 300X電感耦合等離子質譜儀,美國PerkinElmer公司;真空冷凍干燥機,北京四環起航科技有限公司;高速冷凍臺式離心機,美國Danaher Corporation公司。

1.3 貽貝殼的NaOH-乳酸凈化處理

將貽貝殼外表面刷洗干凈并去除內表面黏附的貝肉,將貝殼放入65 ℃干燥箱中烘干3 h,將烘干后貝殼用小錘敲打破碎成小塊(直徑約2～3 cm)。稱取破碎的貽貝殼25 g,向其中加入250 mL不同濃度(0.01 mmol/L、0.3 mmol/L、2.5 mmol/L、12.5 mmol/L、0.125 mol/L)的NaOH溶液(pH 9～13)浸泡處理24～72 h。在浸泡處理的第1小時和最后1小時分別進行超聲波協同處理,超聲波頻率40 kHz,功率300 W。處理后的貝殼用清水沖洗干凈并置入65 ℃干燥箱烘干3 h,為NaOH處理樣品。

稱取NaOH處理且干燥后的貽貝殼25 g,向其中加入250 mL不同濃度(700、7、0.07、7×10-4mmol/L)的乳酸溶液(pH 2～5)浸泡處理1～5 h。處理后的貝殼用清水沖洗并置于65 ℃干燥箱中烘干3 h。為敘述方便,本文將經NaOH溶液處理后再經乳酸溶液處理簡述為NaOH-乳酸處理。

1.4 貽貝殼明暗度L值的測定

用高速多功能粉碎機將未經處理、NaOH處理、NaOH-乳酸處理的貽貝殼進行粉碎,過80目篩,將篩下物置于105 ℃烘箱干燥至恒重,制備貽貝殼粉。將干燥后的貝殼粉置于PE自封袋中并壓緊,用色差儀對樣品的色澤進行測定。

1.5 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)和X-射線能譜分析儀(energy dispersive spectrometer,EDS)

分別選取未處理、NaOH處理和NaOH-乳酸處理的貽貝殼,在載物盤上黏附導電膠,取噴金處理后樣品黏附于導電膠上,使用吸耳球清除未黏附的粉末雜質。對樣品進行掃描電鏡觀察和EDS能譜分析。

1.6 傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)測定

取適量貽貝殼粉與KBr按質量比1∶100混合、研磨、壓片。對樣品進行FTIR測定,掃描范圍為4 000～400 cm-1,分辨率為4 cm-1。采用同樣方法對堿溶酸提的貽貝殼黑色素進行測定。黑色素的堿溶酸提流程為:用pH 13的NaOH溶液浸泡處理貽貝殼36 h(參照1.3節),取10 g脫落的角質層并向其中加入40 mL NaOH溶液(2 mol/L)浸泡處理4 h,10 000 r/min離心10 min,取上清液,用6 mol/L鹽酸溶液調節其pH至2.0后析出沉淀物,取沉淀物進行真空冷凍干燥(-40 ℃、≤5 Pa)處理12 h獲得黑色素。

1.7 重金屬檢測

參照VOICA等[16]的方法使用電感耦合等離子體質譜(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)對貽貝殼粉的金屬元素含量進行檢測。稱取0.5 g樣品并加入10 mL濃硝酸,室溫靜置1 h,隨后利用微波消解儀進行消解,前5 min升溫至120 ℃,恒溫處理5 min;5 min內升溫至150 ℃并恒溫處理10 min;然后5 min內升溫至190 ℃并恒溫處理20 min。冷卻后緩慢打開罐蓋排氣,用少量水沖洗內蓋,再將消解罐置于控溫電熱板上,于100 ℃加熱30 min。隨后用去離子水定容至25 mL備用。以不添加貝殼粉樣品、但經相同處理的溶液為空白對照。將空白溶液和試樣溶液分別注入電感耦合等離子體質譜儀中,設定射頻功率1 500 W,輔助氣和霧化氣的流速分別為1.2和1.03 L/min,等離子體流速為18 L/min,泵速為2.0 mL/min。測定待測元素和內標元素的信號響應值,根據標準曲線得到消解液中待測元素的濃度。

1.8 數據統計及分析

每組實驗平行進行3次,使用Origin 2017對數據進行分析,SPSS 26.0進行顯著性分析,P<0.05認為具有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 pH和浸泡時間對NaOH溶液脫除黑色素效果的影響

如圖1-a所示,未經NaOH處理的對照樣品明暗度為67.28,而經pH 9的NaOH溶液浸泡處理24 h后,其明暗度增加至82.26。若NaOH溶液pH為13,其明暗度則增加至84.06。在pH 10～13范圍內,樣品明暗度雖略有增加但并無顯著性差異(P>0.05),但黑色素的脫除效果卻有明顯差別。如圖1-a插圖所示,pH 12的NaOH溶液處理后貽貝殼表面仍有部分黑色素殘留,而pH 13的NaOH溶液處理后黑色素基本脫落。上述結果表明NaOH溶液pH對其脫除貽貝殼表面的黑色素有明顯影響,隨著溶液pH的升高,脫除作用增強。后續研究中選定的NaOH溶液pH為13。

a-pH對明暗度的影響(插圖分別為pH 12和13處理時貽貝的圖片);b-浸泡時間對明暗度的影響(pH=13)

如圖1-b所示,pH=13時,在0～72 h,隨著浸泡時間的延長,貽貝殼粉明暗度呈先上升后下降的趨勢。當浸泡時間為24、36 h時,貽貝殼粉明暗度由對照組的67.28分別增加至84.06、90.64。進一步延長浸泡時間至48、60、72 h,其明暗度則分別減小至88.61、87.43、89.28。長時間浸泡導致其明暗度減小的原因可能是長時間NaOH處理使得貽貝殼棱柱層暴露增加,結構愈加松散,孔隙率不斷上升,從而增加了其對溶解的黑色素的吸附作用[17]。因此,后續研究中選定的NaOH浸泡時間為36 h。

2.2 乳酸溶液pH和浸泡時間對脫除黏連有角質層的低純CaCO3的影響

由圖2-a可知,隨著乳酸溶液pH的降低,貽貝殼粉明暗度呈現上升趨勢。只經pH 13的NaOH浸泡處理36 h的貽貝殼粉明暗度為90.64,若再用pH2～5的乳酸溶液浸泡處理4 h后,其明暗度分別增加至94.03、93.95、93.02、92.36。雖然隨著pH升高,樣品間明暗度有一定程度減少,但并無顯著性差異(P>0.05)。如圖2-b所示。pH 2的乳酸溶液處理后樣品的質量損失率為9.78%,顯著高于pH 3～5的乳酸溶液處理的樣品(P<0.05)。綜上可知,乳酸處理能明顯進一步脫除貽貝殼表面黏連有角質層的低純CaCO3,溶液pH對其脫除效果有一定影響。后續研究中選取的乳酸pH為2。

a-乳酸溶液pH對貽貝殼粉明暗度的影響(浸泡處理4 h);b-乳酸溶液pH對貽貝殼質量損失率的影響(浸泡處理4 h);c-處理時間對貽貝殼粉明暗度的影響(乳酸pH 4);d-處理時間對貽貝殼質量損失率的影響(乳酸pH 4)

如圖2-c所示,對照組(pH 13的NaOH溶液浸泡36 h)貽貝殼粉的明暗度為90.64,經pH 2的乳酸浸泡處理1、2、3、4、5 h后,貽貝殼粉的明暗度分別增加至92.48、92.72、92.97、93.02、93.57,呈現上升趨勢,并無顯著性差異(P>0.05),但其質量損失率卻存在顯著性差異(P<0.05)。處理4和5 h的樣品質量損失率顯著高于處理3 h樣品。后續研究中選擇乳酸的浸泡處理時間為4 h。

2.3 微觀結構表征

利用掃描電鏡對最佳凈化條件下NaOH和NaOH-乳酸處理的貽貝殼微觀結構進行了分析(見圖3)。結合FENG等[18]對貽貝殼礦物相的結構和晶體取向研究結果發現,未處理樣品因表面含有大量的有機質而呈致密、光滑形態[19];NaOH處理組樣品表面黑色素脫落,角質層出現明顯的斷裂;而經NaOH-乳酸處理后,與棱柱層黏連的角質層發生明顯脫落,柱狀棱柱層清晰可見。SEM分析結果表明,NaOH-乳酸協同處理可有效脫除貽貝殼表面的黑色素及黏連有角質層的低純CaCO3。

a-對照組(×2 000);b-NaOH處理組(×2 000);c-NaOH-乳酸處理組(×2 000);d-對照組(×5 000);e-NaOH處理組(×5 000);f-NaOH-乳酸處理組(×5 000)

2.4 FTIR分析

a-紅外光譜;b-1 000～2 000 cm-1內紅外光譜

2.5 表面元素分析

基于EDS的貽貝殼表面元素分析結果如圖5和表1所示。未處理的貽貝殼表面含有C、O、Na、Br、S、Cl、Ca等多種元素,其中C、O含量最高,其質量比分別達66.22%、27.96%,二者主要來自貽貝殼表面的角質層。Na、Br、S、Cl等主要來自角質層的吸附作用,其中Br元素含量較高,其質量分數為3.96%。雖然貽貝殼中含有大量的CaCO3,但由于角質層的包被,觀測到的Ca元素強度較低,其質量分數僅為0.39%。經NaOH處理后,C元素質量分數減小至27.63%,O、Ca元素質量分數則分別增加至40.95%、30.15%,而Br元素則未檢出。而經最佳凈化條件下NaOH-乳酸處理后,C元素質量分數進一步減小至12.80%,而O、Ca元素質量分數則分別增加至49.25%、37.58%,三者均接近純CaCO3中各元素質量比(C∶O∶Ca=12∶48∶40)。上述結果進一步表明,NaOH-乳酸處理可有效脫除貽貝殼表面角質層及其吸附的其他元素,從而提高貽貝殼中CaCO3純度。

表1 各處理組表面元素組成

a-未處理;b-NaOH處理;c-NaOH-乳酸處理

2.6 重金屬含量分析

海水及沉積物中含有鎘、鉛、銅和鋅等重金屬,而貝殼角質層中的有機質具有較強的吸附性能,可與重金屬結合形成重金屬-有機絡合物[24]。利用ICP-MS對最佳凈化條件下NaOH-乳酸處理的貽貝殼中4種重金屬進行了檢測,并與未經凈化處理的對照組進行比較,結果如表2所示。本研究所用貽貝殼含有一定量的Cu、Zn、Pb等元素,Cd未檢出。所檢出重金屬含量均未超過GB 2762—2022《食品安全國家標準 食品中污染物限量》的規定。經NaOH-乳酸凈化處理后,Zn、Pb含量有一定程度下降,分別由凈化前的5.86、0.80 mg/kg降低至4.79 mg/kg和未檢出。但Cu含量卻有少許增加,這可能與貽貝殼對不同離子的吸附部位相關。

表2 凈化前后貽貝殼中重金屬元素含量變化表 單位:mg/kg

3 結論

NaOH-乳酸協同處理可有效脫除貽貝殼表面的角質層,最佳凈化處理條件為:pH 13 NaOH溶液浸泡36 h,再經pH 2的乳酸溶液浸泡處理4 h。最佳處理條件下貽貝殼制備的粉末的明暗度由未處理組的67.28增加至93.02。SEM-EDS、FTIR及ICP-MS分析顯示,NaOH-乳酸協同處理有效脫除了貽貝殼表面的黑色素、黏連角質層的低純CaCO3及其吸附的Br、Zn、Pb等元素,凈化后貽貝殼中CaCO3純度顯著提高,各元素質量比接近CaCO3中元素的理論質量比。本研究結果可為貽貝殼源高品質鈣源補充劑的制備提供一定的借鑒和參考。