人參皂苷Rg1對心肌纖維化模型小鼠TLR4/MyD88通路的影響*

陳昕, 杜琎, 高磊, 闞晨靜, 黃項鳴, 徐興聞, 朱軍, 楊平印, 石開虎**

(1.溧陽市中醫醫院 介入科, 江蘇 溧陽 213300; 2.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院 心胸外科, 江蘇 南京 210038; 3.南京中醫藥大學中醫學院 中西醫結合學院, 江蘇 南京 210038)

心肌纖維化是多種心臟疾病共同的病理過程,是心臟結構重構的重要環節之一。心肌細胞凋亡增加,心肌膠原蛋白分泌增多、膠原纖維不斷沉積、心肌組織發生不同程度的纖維化,久之心臟順應性降低、結構改變,從而引發心律不齊、心力衰竭等心臟疾病[1]。有研究指出,Toll樣受體4/髓樣分化因子88(toll like receptor 4/recombinant myeloid differentiation factor88,TLR4/MyD88)信號通路在延緩纖維化進程中有重要作用,其主要是通過調控心肌細胞凋亡達到干預心肌纖維化進程的目的[2]。中藥“人參”在臨床上參與很多心臟疾病的治療,而人參皂苷Rg1(ginsenoside rg1, GRg1)作為其主要效用成分,有強心、抗休克、對抗心律失常、減輕心肌缺血缺氧再灌注損傷、促進心肌血管再生等重要作用,臨床多用于治療心肌梗死、動脈粥樣硬化、心律失常等多種疾病[3]。申文宇等[4]研究指出,人參皂苷Rg1能夠調控內源性線粒體凋亡途徑,抑制細胞色素C(cytochrome C,Cyt-c)釋放,降低凋亡相關蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinases 3,caspase 3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cysteinyl aspartate specific proteinases 9,caspase 9)表達水平,減少大鼠心肌細胞凋亡、調節心律、保護心肌。關于人參皂苷Rg1是否通過TLR4/MyD88通路干預心肌纖維化的研究較少,本研究旨在探索人參皂苷Rg1通過調控TLR4/MyD88通路干預心肌細胞凋亡、影響心肌纖維化的機制,以期對臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 選用成年雄性C57BL/6J 小鼠30 只,由江蘇省中西醫結合醫院動物實驗中心提供。所有動物實驗符合實驗動物學習指南,無菌喂養,飲用水和飼料均經過高溫消毒,環境溫度約在24 ℃,濕度42%～48%。本實驗研究獲得江蘇省中西醫結合醫院倫理委員會批準[許可證號SYXK(蘇)2021-0025)]。

1.1.2主要試劑 人參皂苷Rg1藥物采購于南京草本源生物科技有限公司,TLR4(貨號 14358S)、Bax(貨號14796S)、MyD88(貨號4283S)、膠原蛋白1(collagen-I, COL-1,貨號 72026S)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA貨號19245S)、β-actin(貨號D191048)抗體購買于Cell Signaling公司,Bcl-2(貨號ab32124)、GAPDH(貨號 ab9485)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(貨號 ab97051)購買于abcam公司。

1.2 研究方法

1.2.1建模與給藥方案 取30只成年雄性C57BL/6J小鼠,隨機分為對照組、模型組和人參皂苷Rg1組,對照組皮下注射0.9%氯化鈉溶液,模型組皮下注射異丙腎上腺素(isoproterenol, ISO)5 mg/kg,治療組皮下注射ISO 5 mg/kg、同時予以人參皂苷Rg1 20 mg/kg灌胃,1次/d,連續干預14 d。給藥期間所有小鼠均正常飼養,自由飲水。

1.2.2觀察心肌組織病理學改變 建模結束后,用1%的戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射,取血;后打開胸腔,游離心臟、離斷主動脈,取出小鼠心臟用4%的福爾馬林溶液浸泡,脫水、石蠟包埋、切0.4 μm薄片、烤片、脫蠟、烘干,分別馬松染色(Masson)、蘇木精-伊紅染色法(HE)染液染色,電子顯微鏡下觀察。

1.2.3免疫印跡試驗(WB)檢測凋亡相關通路蛋白的表達 取出凍存的心肌組織研磨,RIPA裂解液提取總蛋白,BCA檢測蛋白總量,用分離膠和濃縮膠進行分離蛋白后,將蛋白轉移到PVDF膜上,加入抗體TLR4(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)、COL-1(1∶1 000)、α-SMA(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000),山羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h,經ECL顯影后,使用軟件對PVDF膜蛋白條帶進行掃描分析,計算灰度值,GAPDH為內參。

1.2.4聚合酶鏈式反應(PCR)檢測TLR4、MyD88、兔抗人單克隆抗體(Bcl2-associated X, Bax)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)表達 引物由生工生物在線引物設計(表1),采用trizol(Invitrogen)提取心肌組織總RNA于A260 nm/A 280 nm≥1.8鑒定RNA純度。取2 μg總RNA為模板,參照TAKARA公司的試劑盒說明書進行逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。20 μL PCR反應體系,實時定量PCR擴增,以β-actin為內參照。反應結束后確認Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線,進行PCR定量時制作標準曲線等。

表1 PCR檢測引物序列

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 心肌組織學改變

HE染色結果顯示,對照組小鼠心肌細胞形態規則正常,細胞間排列順序整齊;ISO組中纖維化后的小鼠心肌細胞形態不規則,體積明顯增大,組織間水腫明顯,細胞排列紊亂;人參皂苷Rg1組小鼠心肌細胞排列稍規則,細胞體積稍有增大,細胞排列恢復正常。見圖1。Masson染色結果顯示,對照組中,心肌細胞形態正常、排列整齊,而ISO組中心肌細胞排列雜亂、大量膠原纖維聚集;人參皂苷Rg1組小鼠心肌細胞形態接近正常、排列尚齊,偶可見少量藍紫色聚集的膠原纖維聚集。見圖2。

對照組 ISO組 人參皂苷Rg1組

對照組 ISO組 人參皂苷Rg1組

2.2 凋亡相關通路蛋白的表達

WB結果表明,與對照組比較,ISO組小鼠心肌組織中α-SMA、COL-1纖維化蛋白表達明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05),提示造模成功;與ISO組比較,Rg1組小鼠心肌組織中COL-1、α-SMA的表達明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05),提示Rg1對心肌纖維化有干預作用。見圖3。與對照組比較,ISO組小鼠心肌組織中TLR4、MyD88、Bax蛋白表達明顯升高,Bcl-2表達降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與ISO組比較,Rg1組小鼠心肌組織中TLR4、MyD88、Bax的表達明顯降低,Bcl-2表達升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖3 各組COL1及α-SMA小鼠心肌纖維化相關蛋白表達

圖4 各組小鼠心肌組織中TLR4TLR4、MyD88、Bax及Bcl-2蛋白表達

2.3 TLR4、MyD88、Bcl-2、Bax的基因表達

PCR結果表明,與對照組比較,ISO組小鼠心肌組織中TLR4、MyD88、Bax的mRNA明顯升高,Bcl-2mRNA表達降低,差異有統計學意義(P<0.05);與ISO組比較,Rg1組小鼠心肌組織中TLR4、MyD88、Bax的mRNA明顯降低,Bcl-2mRNA表達升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組小鼠心肌組織中 TLR4、MyD88、Bcl-2及Bax的基因表達

3 討論

心肌纖維化是多種心臟疾病發生心臟結構重構的關鍵病理基礎,其發病機制復雜,目前認為心肌細胞外基質不斷沉積在心肌纖維化中起重要作用[5]。而心肌組織中膠原纖維不斷沉積,膠原比率失調、細胞排列紊亂是心肌纖維化的標志,其中含量最多的是COL-1[6],在心臟瘢痕組織中高表達。當膠原沉積增多,各型膠原比率失調和排列紊亂使心肌發生纖維化,并且纖維化發生會誘導更多的炎癥因子釋放,會進一步加重纖維化的過程[7-8]。大量基礎研究發現,TLR4/MyD88通路作為經典的信號通路能夠通過細胞凋亡、程序性壞死、焦亡等多種途徑,減輕心肌細胞的氧化應激反應、控制心肌細胞炎癥、減少細胞凋亡等途徑調控心肌纖維化發展[9-11]。因此通過有效手段干預心肌纖維化進程有望能夠用于臨床心臟疾病的治療。本實驗用COL-1以及α-SMA作為心肌纖維化的檢測指標,本次實驗研究發現,皮下注射異丙腎上腺素組的小鼠心肌組織中COL-1、α-SMA蛋白表達增加,說明心肌纖維化模型建立的成功,而通過人參皂苷Rg1干預后COL-1、α-SMA蛋白表達恢復到正常組水平,說明人參皂苷Rg1能夠減輕ISO誘導的心肌纖維化損傷。本實驗造模方法選用皮下注射ISO(5 mg/kg)建立小鼠心肌纖維化模型[5],HE染色結果顯示心肌細胞體積增大,排列紊亂,形態不規則,細胞間質不均勻增多,Masson染色模型組心肌纖維排列紊亂,結構破壞,組織增生嚴重,并伴有細胞壞死,瘢痕出現,均提示皮下注射異丙腎上腺素能夠建立心肌纖維化模型,人參皂苷Rg1干預后細胞體積變小,排列恢復一定次序均說明人參皂苷Rg1對ISO誘導的小鼠心肌纖維化有明顯的改善作用,能夠干預心肌纖維化進程。

Toll樣受體中的經典受體TLR4是一種膜蛋白受體,其主要是通過識別細菌脂多糖,結合可溶性穿梭蛋白LBP和LPS,繼而激活下游MyD88及NF-kB信號通路,激活機體免疫應答,炎癥因子IL-β、IL-8、TNF-α大量釋放,引起心肌損傷[12-15]。細胞凋亡存在于多種有心肌纖維化的心臟疾病中,有人認為多種病毒可以觸發細胞凋亡從而加快了心肌纖維化進程, 細胞凋亡可能是引起病毒性心肌炎向心肌病轉變的第3種機制[16]。我國古典醫籍《本草經》中談到人參具有“主五臟、安精神、定魂魄、止驚悸”的作用[17]。人參皂苷Rg1作為中藥人參的主要成分,有增強心肌收縮力,穩定心率,改善心肌代謝等功能。彭程飛等[18]通過動物實驗發現,人參皂苷Rg1能夠有效抑制大鼠急性心肌梗塞后的心肌纖維化發生。細胞凋亡途徑有兩種途徑,分為線粒體途徑和死亡受體途徑,細胞外途徑主要是死亡受體分子活化后,caspase酶原募集,凋亡酶體激活,pro-caspase8水解活化后,caspase8活化,激活下游caspase3,引起目標細胞發生凋亡;線粒體途徑是激活bcl-2、Bax、Bak等促凋亡細胞,引起細胞凋亡的發生[19-23]。Luo等[24]通過實驗研究發現,人參皂苷Rg1能夠干預TLR4通路,緩解LPS誘導的心肌損傷,恢復心肌部分功能。此外,研究發現,平滑肌肌動蛋白α-SMA在大部分平滑肌肌型細胞的肌成纖維細胞中表達較高,而心肌纖維化的主要標志之一[25]。本實驗在ISO組以及人參皂苷Rg1組中檢測了TLR4、MyD88的表達,與對照組比較ISO組中TLR4、MyD88的表達無論在RNA水平還是蛋白水平都明顯升高,而人參皂苷Rg1組較ISO組呈現出明顯下降,說明Rg1灌胃在ISO誘導的心肌纖維化模型中能降低TLR4、MyD88的表達。同時檢測凋亡相關指標,發現ISO組較對照組小鼠心肌組織中Bax的表達明顯升高,Bcl-2的表達則明顯降低;而人參皂苷Rg1組與ISO組比較,Bax表達明顯降低,Bcl-2的表達則升高明顯,也證實了人參皂苷Rg1能明顯改善心肌纖維化組織中的細胞凋亡水平。

綜上所述,人參皂苷Rg1可能通過抑制TLR4/MyD88信號通路活化,改善小鼠心肌組織中細胞凋亡水平,從而延緩心肌纖維化進程,發揮心臟保護作用。