短鏈伯醇氧化酶的研究進展

王首豐,叢文杰,曹昕莼,陸婷,王明軒,周化嵐,張建國

(上海理工大學 健康科學與工程學院,上海,200093)

短鏈伯醇氧化酶(short-chain primary alcohol oxidase,SPAOX,EC 1.1.3.13)是一種依賴黃素腺嘌呤核苷酸(Flavin adenine dinucleotide,FAD)氧化短鏈伯醇(C1～C8)生成相應的醛和過氧化氫的氧化還原酶。SPAOX最早由JANSSEN等[1]于1968年從Basidiomycete(多孔菌科擔子菌)的菌絲體中分離出來。近年來,SPAOX在甲基營養(yǎng)型微生物等多種真核生物中被發(fā)現(xiàn)。而且,SPAOX已經(jīng)較為廣泛地應用于醇類分析、生物轉化等場景中。與SPAOX相關的研究逐漸得到眾多學者的關注,取得一定進展的同時具有廣泛的應用前景。本文對比了不同生物來源的SPAOX,闡述了其催化機制,總結了SPAOX性質的優(yōu)缺點,并對提高SPAOX穩(wěn)定性的研究進行了展望,以期為其進一步的應用奠定基礎。

1 SPAOX的來源和催化機制

SPAOX已經(jīng)在博乙丁假絲酵母(Candida boidinii)[2]、漢遜酵母(Hansenulapolymorpha[3]、Ogataeaangusta[4])、法夫駒形氏酵母(Komagataellaphaffii)[5-6]、畢赤酵母(Pichiasp.)[7]等甲基營養(yǎng)型酵母中發(fā)現(xiàn),也在土曲霉(Aspergillusterreus)[8-9]、黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)[10]等絲狀真菌中存在。利用軟件MEGA7[11]對SPAOX的基因進行進化樹分析(圖1),表明SPAOX有2個分支;其中上分支第一部分中的SPAOX主要來源于甲基營養(yǎng)型酵母菌、曲霉以及癌腫病菌(Lachnellulawillkommii)、特異青霉(Penicilliumchrysosporium)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)等真菌;上分支第二部分則來源于褐孢霉(Fulviafulva)、密粘褶菌(Gloeophyllumtrabeum)、朱紅栓菌(Trametescinnabarina)、牛樟芝(Taiwanofunguscamphoratus)、原毛平革菌(Phanerochaetesordida)等真菌。而下分支中的SPAOX主要來源于短梗霉(Aureobasidiumsp.)、擔子菌(Basidiomycete)、炭疽病菌(Colletotrichumchlorophyti)、裂褶菌(Schizophyllumcommune)、環(huán)紅酵母(Rhodotorulatoruloides)、炭角菌(Xylariomycetidaesp.)等真菌。兩個分支中微生物種類差異較大。例如,上分支中漢遜酵母、博乙丁假絲酵母、法夫駒形氏酵母等甲基營養(yǎng)型酵母菌中SPAOX序列的分支置信度達100。其他真菌類,例如青霉、曲霉、原毛平革菌、牛樟芝、擔子菌等的置信度則為13～99。

圖1 短鏈伯醇氧化酶基因的進化樹

因為SPAOX在甲基營養(yǎng)型酵母中參與甲醇代謝,將甲醇氧化成甲醛和過氧化氫,所以很多關于SPAOX的研究以甲基營養(yǎng)型酵母中的SPAOX作為研究對象來開展[12-13]。甲基營養(yǎng)型酵母新生成的SPAOX依靠其過氧化物酶體靶向信號(peroxisome targeting signal,PTS),被運輸?shù)竭^氧化物酶體中發(fā)揮作用。SPAOX單亞基的分子質量約為65 k～80 kDa,SPAOX的活性功能體是含有8個FAD輔因子和8個亞基的同源八聚體,分子質量約500～700 kDa。SPAOX屬于葡萄糖-甲醇-膽堿(glucose-methanol-choline,GMC)家族氧化還原酶,由FAD結合域和底物結合域組成。GMC家族氧化還原酶的FAD結合域的氨基酸序列保守,而由于不同酶的最適底物不同,使得底物結合域的氨基酸序列差異較大[14]。因為GMC氧化還原酶的催化活性中心(組氨酸/組氨酸或組氨酸/天冬酰胺)高度保守,所以其催化機制相似[15]。SPAOX的催化過程分為還原半反應(還原FAD,以及醇類電子供體底物的氧化)和氧化半反應(FADH2被氧化形成H2O2)[16]。其中催化活性中心進行還原半反應,H567與醇底物結合并在催化過程中攜帶正電荷,由N616催化醇底物并穩(wěn)定醇鹽的負電荷[17]。結合口袋的W566和F98的芳香族側鏈限制了底物分子的可用空間,使其最適底物為短鏈伯醇[3,18]。還原半反應中底物的氫轉移到FAD的異四氧嘧啶上,FAD被還原成FADH2。另一部分氧化半反應的FAD結合域E38與FAD的腺嘌呤基團結合,N97與黃素連接環(huán)相互作用,FADH2被氧重新氧化成FAD,并釋放H2O2[5, 17]。不同于乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH,EC 1.1.1.1)在催化反應中不斷消耗輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸,SPAOX循環(huán)利用FAD是一大優(yōu)勢[19]。

表1總結了GMC氧化還原酶家族常見酶的單體分子質量、結構、底物結合口袋等性質。其中,只有SPAOX是八聚體,其他家族中的酶都是單體或二聚體。單體大小除了膽固醇氧化酶(cholesterol oxidase)為36 kDa相對較小,其他都在60 k～80 kDa附近。底物結合口袋中都有H/H或H/N作為底物催化活性中心,而限制底物分子可用空間的氨基酸有所不同。例如SPAOX中的F98在膽堿氧化酶(choline oxidase)中為S101,W566為V464,而F98在芳香醇氧化酶(aryl-alcohol oxidase)中為Y92,在膽固醇氧化酶中為G66,而絲氨酸、纈氨酸、甘氨酸等氨基酸的殘基都較小,使得這些氧化酶可催化諸如膽堿、膽固醇等較大醇類底物[5, 17]。

表1 GMC氧化還原酶家族結構的比較

SPAOX在過氧化物酶體中組裝成八聚體,得益于外界條件的影響,促使亞基相互接觸[17]。由于八聚體結構組裝較困難,因此SPAOX的穩(wěn)定性較差,容易受到環(huán)境的影響而降解。

2 SPAOX的性質

2.1 底物特異性

SPAOX的底物主要為甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇。隨著醇類底物碳鏈的增長,SPAOX的Km值逐漸變大,活力也逐漸下降(表2)。甲基營養(yǎng)型酵母中多形漢遜酵母(HansenulapolymorphaDL-1)SPAOX的Km值最小,為0.23 mmol/L。其他類型真菌中只有茯苓(Poriacontigua)SPAOX的Km為0.2 mmol/L,小于甲基營養(yǎng)型酵母SPAOX的Km值。而且,茯苓SPAOX的最大反應速率為12.8 μmol/(min·nmol),高于目前報道的其他SPAOX的最大反應速率[24]。對SPAOX進行突變可以改變其催化底物的性質。SPAOX對甲醇和乙醇表現(xiàn)出良好的催化活性,對其他底物的低活性限制了SPAOX的進一步應用。SPAOX的蛋白質工程改造使其適配多種底物,將拓寬SPAOX的應用范圍。DMYTRUK等[25]對多形漢遜酵母SPAOX進行突變,得到對甲醇Km值從0.62 mmol/L提高到1.1～2.48 mmol/L,拓寬了多形漢遜酵母SPAOX突變體的應用范圍。雖然大部分SPAOX也展現(xiàn)出較弱的氧化甲醛的活力(表2),但是KJELLANDER等[26]將畢赤酵母SPAOX固定到納米多孔氧化鋁膜后,固定化SPAOX對甲醛表現(xiàn)出與游離酶對甲醇的102%相對活力,說明固定化技術為保護SPAOX不受甲醛的損傷提供了有力保障。

表2 不同SPAOX的底物特異性比較

2.2 SPAOX活力

由于SPAOX的八聚體結構,易受到環(huán)境因素的影響,因此,很多學者對多種SPAOX的影響因素pH、溫度、化合物等進行考察。

2.2.1 環(huán)境的影響

表3匯總了pH和溫度分別對不同SPAOX活力的影響。SPAOX的最適pH可以低至5,也可以高達9。部分菌株來源的SPAOX具有相同的最適pH,例如Candida25-A和Komagataellapastoris的最適pH為7.5。Ogataeaangusta、Aspergillusterreus和PenicilliumpurpurescensAIU 063的最適pH為8.5。Phanerochaetechrysosporium、Pichiasp.、Phanerochaetechrysosporium和Ogataeathermomethanolica的最適pH為9。相比pH性質的較為相似性,不同SPAOX的最適溫度差異較大。例如Aspergillusochraceus[34]、Candidamethanosorbosa[27]、Thermoascusaurantiacus[30]、Ogataeaangusta[4]、Phanerochaetechrysosporium[10]、Ogataeathermomethanolica[28]的SPAOX均有較好的熱穩(wěn)定性,最適溫度為45～55 ℃左右;而其他SPAOX的最適溫度均為25～40 ℃左右。環(huán)境因素除了pH和溫度,靜水壓力也會影響SPAOX的活力[35-36]。高靜水壓力會穩(wěn)定SPAOX的熱失活,尤其是酶的不穩(wěn)定組分,使得結構更加穩(wěn)定。高靜水壓力可以使SPAOX在高溫下保持活性并獲得更快的反應速度。

表3 不同SPAOX性質的比較

2.2.2 化合物的影響

SPAOX溶液中有機、無機化合物、金屬離子等物質會影響SPAOX活性(表4、表5)。其中聯(lián)吡啶對SPAOX活性沒有顯著影響。羥基喹啉、氨基脲、Cu2+等因為羰基作用對SPAOX活性有一定的抑制[33]。羰基試劑諸如苯肼、羥胺以及肼等也對SPAOX活性有顯著抑制作用[32,34]。Cd2+、Hg2+等金屬離子對Candida、Ogataeapolymorpha、Paecilomycesvariotii的SPAOX活性有顯著抑制作用,而其他金屬離子對SPAOX活性無顯著影響[7,29-30,34,39-40]。這也使得金屬螯合劑乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、鄰菲咯啉對SPAOX活性也無顯著抑制作用[39]。疊氮化鈉是甲醇的可逆競爭性抑制劑,結合位點位于SPAOX的活性中心區(qū)域,與FAD作用,從而改變SPAOX二級結構[18]。此外,SPAOX在環(huán)丙酮中20 ℃、pH 7.5條件下孵育2 h后完全失去活性[41]。但是在隔絕氧氣情況下能有效抑制失活。由于SPAOX活性位點附近有巰基,因此,對氯苯甲酸汞(p-chloromercuribenzoate,PCMB)、Cu2+、Hg2+等對巰基有封閉作用的化合物對SPAOX有顯著抑制作用。這表明SPAOX中半胱氨酸殘基對于維持結構的作用必不可少[24,27,32]。此外,可以通過在Hg2+處理后的SPAOX中添加硫醇或在Cu2+處理后的SPAOX中添加EDTA進行去抑制[40]。過量的β-巰基乙酸可恢復由PCMB引起的失活,表明抑制由有機汞與巰基結合而引起[40]。因此,巰基的抑制作用是可逆競爭性抑制。

表4 化合物對SPAOX活力的影響

表5 金屬離子對SPAOX活力的影響

此外,碘乙酸可以使SPAOX可逆失活[40]。炔醇底物使SPAOX不可逆失活,炔醇氧化后產物醛的羥基再與SPAOX的活性中心發(fā)生親電結合,使底物醇不能與SPAOX結合,所以炔醇底物是自殺性底物[2]。此外,底物和產物對SPAOX的穩(wěn)定性也有影響。在沒有過氧化氫酶存在的情況下,SPAOX會被大量產生的過氧化氫可逆抑制[4]。過氧化氫將SPAOX活性中心的巰基可逆氧化。加入巰基乙醇或二硫蘇糖醇等還原劑可使SPAOX活性恢復[42]。

2.3 SPAOX的穩(wěn)定性

SPAOX穩(wěn)定性的相關研究一直受到廣泛關注。將SPAOX儲存于4 ℃可保持活性數(shù)周至數(shù)月[8],儲存于-20或-80 ℃可保持活性數(shù)年[24]。雖然低溫保存對活性的影響較小,但反復凍融會使SPAOX快速失活[29]。Basidiomycota的SPAOX可在0.05 mol/L的磷酸緩沖液中保持至少5個月活性[1]。添加500 g/L蔗糖可使Pichiaputida的SPAOX的穩(wěn)定性提高10倍,在300～500 g/L蔗糖、-20或-80 ℃下SPAOX活性可保持數(shù)年[43]。固定化技術可顯著提高SPAOX的活性范圍,有利于酶保持穩(wěn)定性。ZHAO等[44]將SPAOX固定在靜電紡絲纖維上后,由于纖維表面的生物相容性和親水性使得最適溫度提高至50 ℃,最適pH范圍擴大至6.5～7.5,在40 ℃孵育2 h后SPAOX活性僅降低10%。CHUNG等[45]將SPAOX固定在活性纖維素載體上,SPAOX的最適溫度提高至65 ℃,在80 ℃仍有25%活性,pH范圍擴大至4～10,并在25 ℃下保持穩(wěn)定10周以上。KJELLANDER等[26]將SPAOX固定在多孔納米氧化鋁上后,室溫下反應50 h后仍能保持50%以上的活性。穩(wěn)定性在SPAOX作為傳感器元件中也發(fā)揮了重要作用,固定在含有聚中性紅(poly neutral red,PNR)介質的碳膜電極上的SPAOX作為傳感器,使用2周后傳感器的靈敏度下降0.8%,在pH 7、0.1 mol/L磷酸緩沖液中4 ℃保存6周后,傳感器的靈敏度僅下降12%[46]。

3 SPAOX的應用

SPAOX的底物廣泛、反應的不可逆性和輔因子循環(huán)使用的優(yōu)勢使得SPAOX已經(jīng)在多個方面成功應用。圖2從SPAOX的催化機制出發(fā)總結了SPAOX的主要應用場景,例如基于固定化SPAOX構建的生物反應器用于醇醛類物質分析檢測、醇醛物質的生物轉化、生物修復方面的醛類物質降解等。

圖2 SPAOX的應用

3.1 醇類物質的分析檢測

固定化的SPAOX常被用于食品中短鏈醇、醛的檢測。根據(jù)檢測技術分類,可分為光學方法和電化學方法。

光學分析方法基于SPAOX和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)耦合,氧化顯色物質發(fā)生顯色反應,進而測定吸光度的變化分析目的物的含量。例如SPAOX、HRP和顯色劑混合于兩層濾紙之間構成酒精檢測試紙,可以快速檢測血液或唾液乙醇,其檢測范圍達10～1 200 mg/L[47]。將二茂鐵包埋的SPAOX和包覆HRP的溶膠-凝膠殼聚糖膜逐層固定在多壁碳納米管(Multi-walled carbon nanotube,MWCNT)修飾的玻碳電極上,制成檢測乙醇的生物傳感器[48],其檢測范圍達5～3 000 μmol/L。此外,AHMAD等[49]報道了將SPAOX包埋在含有尼羅藍(Nile blue chromoionophore,NBCM)的聚丙烯酸酯薄膜上,用于甲醛檢測。其原理為SPAOX與甲醛反應的產物甲酸提供的氫離子與NBCM發(fā)生離子轉移反應,生成深藍色絡合物HNBCM+,進而通過吸光度的變化分析甲醛的含量,其檢測范圍達10-3～103mmol/L。基于顯色分析的方法操作簡單、高效,線性的準確度高,但存在重復性較差的缺點。

電化學分析基于溶解氧含量的測定。例如將SPAOX與納米金顆粒結合,氧化醇生成的H2O2將苯胺氧化聚合成聚苯胺(polyaniline,PANI),再將PANI包裹的SPAOX-AuNPs組裝在玻碳電極上,所制備的生物傳感器可用于醇的分析檢測,檢測范圍達10～4 700 μmmol/L[50]。此外,電化學分析方法也可以測定H2O2分解而產生的電流。例如,將SPAOX固定在以氯化高鐵血紅素和金納米粒子(CF-H-Au)修飾的碳微纖維而制備成納米酶,其對H2O2的親和力比溶液中的氯化血紅素高2.6倍,對乙醇的檢出限為5 μmol/L,檢測范圍達0.01～0.15 mmol/L[51]。HOODA等[52]將SPAOX共價固定在聚氯乙烯燒杯上,同時將HRP、Nafion、MWCNT、殼聚糖和金納米顆粒固定在電極上,檢測乙醇的范圍為0.01～42 mmol/L。采用電化學分析方法,檢測靈敏度高,重復性好,然而生物傳感器的搭建較為復雜。

此外,還可以通過氣體壓力變化檢測氧氣。ZHANG等[53]將兩親性氣凝膠結合Pd @ Pt核殼納米顆粒,形成密封設備,乙醇經(jīng)SPAOX和過氧化氫酶得到終產物氧氣,通過便攜式壓力傳感器來定量乙醇含量,檢出限為0.5 mmol/L。該方法的樣品制備和檢測反應時間短,且不受醇類的干擾,也為乙醇檢測提供了一種新的信號轉導途徑。

3.2 醇醛物質的生物轉化

SPAOX可用于生產甲醛、H2O2、復雜有機物的中間產物[54]。例如,DIENYS等[55]將SPAOX固定在戊二醛活化后的大孔纖維素載體上,用于合成雜環(huán)化合物。SPAOX固定在納米多孔氧化鋁膜上,生產H2O2的生產效率遠高于葡萄糖氧化酶[26]。為了克服SPAOX穩(wěn)定性差的問題,MANGKORN等[56]將SPAOX固定在鋇鐵氧體磁性微粒(BaFe12O19)上不僅提高了SPAOX的熱穩(wěn)定性和催化效率,并且可以固定化SPAOX,在合成醛方面具有良好的工業(yè)應用前景。

3.3 環(huán)境修復

SPAOX固定于海藻酸鈣凝膠中,開發(fā)了用于檢測或生物修復空氣中甲醛的連續(xù)生物反應器,能清除90%以上甲醛[57]。DAS等[58]將SPAOX用于燃料電池,鏈接漆酶,從甲醇基質中發(fā)電,用于環(huán)境修復中。SPAOX以新穎的生物發(fā)電的方式用于環(huán)境修復中,開發(fā)了SPAOX更大的應用價值。

4 展望

SPAOX的結構和催化原理已經(jīng)明晰。SPAOX也被成功固定化和應用。但是相對較低的底物親和力和較差的穩(wěn)定性限制了SPAOX的應用。未來可以從3個方面克服SPAOX的不足,提高SPAOX在應用中的催化效率和便捷性:

(1)提高SPAOX對特定底物的親和力。SPAOX氨基酸序列的突變是提高其底物親和力的有效措施[25]。部分SPAOX由于來自特定物種或是經(jīng)過改造可以有不同的最適底物,如甘油[10]。著重研究SPAOX的序列及結構,尤其針對底物結合口袋,找到改變底物特異性的關鍵殘基,有利于改變底物結合口袋,控制SPAOX的最適底物,有助于檢測應用和特定化合物的生產。

(2)提高SPAOX的環(huán)境穩(wěn)定性。來自O.angusta、A.ochraceus、T.aurantiacusNBRC 31693的SPAOX有較好的pH和熱穩(wěn)定性[4,30,34]。對這些SPAOX的序列進行研究,有利于在后續(xù)進一步提高SPAOX的穩(wěn)定性,使SPAOX在實際檢測應用中的損耗更低,重復性更高。研究不同環(huán)境條件對SPAOX活性的影響,從氨基酸序列和蛋白質結構2方面分析環(huán)境對SPAOX影響的原因,找到更加合適的反應條件,提高SPAOX的反應速率,使其在生產應用中的生物轉化效率更高,產量更大。

(3)開發(fā)不同的定量方法,以及將生物轉化應用于更多領域。優(yōu)化傳統(tǒng)的光學或電化學分析檢測定量方法,并開發(fā)諸如氣體壓力檢測等非傳統(tǒng)的定量方法,使SPAOX可以在不同應用場景中對短鏈伯醇類物質進行檢測。SPAOX循環(huán)利用輔酶FAD的特點,可以在各種場景中隨時、長時間反應,使其不僅可以用于生產,還可用于環(huán)境修復、生物發(fā)電等更多領域,提高了SPAOX的應用價值。