傳統農家醬產蛋白酶菌株的分離及其在豆漿的應用

鮑 捷 ，任曉蕾 ，郭寶松 ，梁會朋 ，林心萍 ，張素芳

（1. 大連工業大學國家海洋食品工程技術研究中心，大連 116034；2. 大連工業大學食品學院，大連 116034）

0 引 言

大豆是中國重要經濟作物，其中2020 年遼寧地區大豆產量可達3 008.1 kg/hm2[1]。大豆中富含的大豆蛋白不僅可以作為添加劑改善食品起泡性[2]、乳化性[3]等功能特性，還因其氨基酸組成與牛奶相近，除蛋氨酸略低外，其余必需氨基酸含量均較豐富，可作為動物蛋白的良好替代品[4]。與動物蛋白相比，大豆蛋白的吸收利用率較低，需經過水解成大豆多肽或氨基酸，才能提高其消化吸收效率[5]。此外，經過水解的大豆蛋白溶解性、穩定性等功能特性也明顯提高[6]。目前常用的大豆蛋白水解方法有酸法水解、堿法水解和酶法水解，其中酸堿水解法會對絲氨酸等氨基酸造成破壞，營養成分損失大[7]，還會伴隨不良副反應，不適用于食品加工。因此，常選用酶法水解獲取大豆多肽或氨基酸[8]，該方法廣泛應用于食品[9]、工業[10]等領域。

研究表明，商業蛋白酶對底物的要求較高且生物利用度低，水解后的大豆蛋白含有苦味，商業蛋白酶并不完全適用于大豆蛋白的水解和加工[11]，從大豆發酵產品篩選產蛋白酶微生物進行酶法發酵可有效解決這一問題。傳統農家醬是以大豆為主要原料的傳統發酵食品，距今已有2000 余年歷史，隨著自然馴化，其中菌株天然適合大豆食品的加工，其經由炒制、制磚、發酵、下醬等多個流程制得，具有濃郁豆香和獨特風味[12]。且因傳統農家醬常以家庭為單位進行釀造，所以根據發酵環境的不同，微生物種類豐富，包括曲霉屬（Aspergillus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等[13]。從傳統農家醬中篩選具有蛋白酶活性的菌株，對大豆蛋白適應性更強，可提高大豆蛋白的水解效率，增強人體對大豆蛋白的消化吸收，具有很高的利用價值和良好的挖掘潛力。

本文從東北傳統農家醬中篩選、分離出8 株產蛋白酶菌株，采用形態學和分子生物學方法進行菌株分類鑒定及抗生素敏感性、溶血性和吲哚試驗等安全性評價，并將8 株產蛋白酶菌株應用于豆漿處理。分析了菌株發酵處理前后的豆漿中可溶性肽、氨基態氮、水解度3 項指標的變化，探討了8 株產蛋白酶菌株對豆漿中大豆蛋白的水解效果。以期為大豆保健功能食品的開發提供潛在應用菌株及理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材 料

東北傳統農家醬，購自遼寧省撫順市；大豆，購自北大荒旗艦店。

1.1.2 試 劑

LB 培養基、哥倫比亞瓊脂培養基、脫纖維羊血、蛋白胨水，購自高科技工業園海博生物技術（青島）有限公司；引物27F、1492R，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Genview 瓊脂糖，購自Genview Scientific Inc.；茚三酮（化學純），購自大茂（天津）化學試劑廠；C8H5KO4、CuSO4、K2SO4、H2SO4、Na2CO3、NaOH、酚酞、甲醛溶液；福林酚試劑、酪蛋白等，購自索萊寶科技（北京）有限公司。大豆分離蛋白，購自源葉生物（上海）科技有限公司。藥敏紙片，購自比克曼（湖南）生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

產蛋白酶菌株篩選培養基：培養基組分A：瓊脂40.0，121 ℃滅菌15 min，趁熱加入至平皿（約至平皿高度的1/8），冷卻至室溫后放置牛津杯（內徑：6 mm，外徑：8 mm，高：10 mm）；培養基組分B：NaCl 20.0，胰蛋白胨 20.0，酵母浸粉 10.0，瓊脂40.0（固體培養基），pH 值為(7.0±0.1)，121 ℃滅菌15 min；培養基組分C：大豆分離蛋白 30.0，90℃滅菌5 min。培養基組分B、C 混合后冷卻至50℃左右，倒入放置好牛津杯的瓊脂平皿中，完全凝固后取出牛津杯；

溶血性驗證培養基：參照哥倫比亞瓊脂培養基產品說明書配置；

稀福林試劑：福林酚試劑10 mL、去離子水定容至20 mL。

1.2 儀器與設備

光學顯微鏡，德國徠卡顯微系統；PCR 儀，美國伯樂公司；水平電泳儀，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像儀，以色列DNR 公司；全自動凱氏定氮儀，歐萊博科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的篩選和分離純化

稱取豆醬樣品1 g，用5 mL 無菌水重懸，將懸液進行倍比稀釋，取10-5、10-6、10-7三個稀釋度液體各100 μL，均勻涂布于LB 固體培養基上，37 ℃靜置培養12 h，選擇菌落數小于300 的平板，挑取不同形態的單菌落，于LB 固體培養基劃線分離純化3 代，直至獲得純培養。挑取單菌落接種于LB 液體培養基中，200 r/min、37 ℃培養至OD600=0.6。取1.5 mL 菌液12 000 r/min 離心3 min，取上清10 μL 滴加于產蛋白酶菌株篩選培養基加樣孔內，置于37 ℃靜置培養，每4 h 觀察一次，挑取透明水解圈直徑最大的8 株菌，保藏備后續分析。

1.3.2 蛋白酶粗酶活的測定

將上述8 株菌培養至OD600=0.6，12 000 r/min 離心3 min，取上清參考國標SB/T 10 317-1999 中的福林法，測定菌株發酵上清液的堿性蛋白酶酶活[14]，蛋白酶活力單位規定為：以酪蛋白為底物，每分鐘催化生成1 μg 酪氨酸的酶量為一個活力單位（U）。公式如下：

式中X為樣品的酶活力，U/mL；A為樣品平行試驗的平均吸光度；K為吸光常數（K=97.59，實驗室測定值）；n為稀釋倍數。

1.3.3 菌株鑒定

1）形態學鑒定

對篩選到的8 株菌進行形態學和光學顯微鏡觀察，記錄菌落大小、形狀、質地、邊緣、光澤和顏色等形態特征，并采集顯微圖像。

2）分子生物學鑒定

菌株基因組提取方法參考文獻進行 [15] 。16S rDNA PCR 擴增采用通用引物27F 和1492R[16]。PCR 反應體系（50 μL）：2×Taq Master Mix 25 μL，上下游引物（20 μM）各1 μL，基因組模板（50 ng/μL）1 μL，滅菌水23 μL。PCR 反應條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，30 次循環，最后72 ℃延伸5 min。

取4 μL 的PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，條帶清晰符合預期大小的擴增產物送至測序公司測序。測序結果在美國國家生物信息中心（NCBI）數據庫中進行Blastn。基于比對結果進行分離菌株分類鑒定。

1.3.4 菌株安全性試驗

1）抗生素敏感性試驗

使用K-B 紙片法對芽孢桿菌的抗生素敏感性譜進行了表征[17]。凍存菌株用LB 固體培養基活化兩代后，挑單菌落接種于LB 液體培養基，37 ℃，200 r/min 培養至OD600=（0.6±0.1），取100 μL 菌液均勻涂布在LB 固體培養基上，液體吸收完全后將抗生素藥敏紙片貼于平板上，保持紙片間的距離不小于24 mm。靜置培養12 h 后測量并統計抑菌圈直徑，分析其是否耐藥。評價等級：耐藥R（≤5 mm），中度敏感MS（＜5～＜11 mm）或敏感S（≥11 mm），每組試驗3 個平行。

2）溶血性試驗

為評價8 株菌的安全性，進行溶血性試驗[18]。溶血素可以將紅細胞破裂溶解，形成溶血環，許多細菌的致病性都與溶血特性相關。溶血性分為α溶血、β溶血與γ溶血，前兩者表現為有草綠色溶血環和完全透明溶血環，γ溶血無溶血環即不溶血。篩選出的8 株菌株在LB固體培養基上活化一代，挑單菌落劃線于溶血性驗證培養基中，在37 ℃靜置培養18 h，觀察是否溶血，以金黃色葡萄球菌ATCC 25 923 作為陽性對照。

3）吲哚試驗

大豆中富含色氨酸，產色氨酸酶的微生物能夠分解其中色氨酸產生吲哚，吲哚的產生通常伴隨不良氣味的產生，影響食品風味[19]。為進一步評價8 株菌的安全性，進行了吲哚試驗分析[20]。篩選出的8 株菌株LB 固體培養基上活化一代后，挑單菌落接種蛋白胨水生化反應管，置37 ℃靜置培養18 h，加入Kovacs 氏靛基質試劑8～10 滴，同時設空白對照試驗。觀察試驗結果，如有吲哚存在，呈現玫瑰紅色，判定為陽性反應；滴加試劑后不變色為陰性反應。

1.3.5 產蛋白酶菌株在豆漿中的應用

1）豆漿制作

取200 g 已浸泡10 h 的大豆，加水至1000 mL，豆漿機研磨破碎后，采用0.3 mm 篩過濾豆漿于100 mL 錐形瓶（每瓶裝50 mL 豆漿）中，121 ℃滅菌15 min。接種篩選獲得的產蛋白酶菌株，接種前活化兩代，調節菌液濃度至OD600值為0.6，1%接種量接種于豆漿，37 ℃、200 r/min 搖床培養18 h。

2）可溶性肽

標準曲線的繪制選用酪蛋白。取1 mL 發酵豆漿，按照JITPAKDEE 的方法[21]進行三氯乙酸（trichloroacetic acid solution，TCA）可溶性肽測定。

3）氨基態氮與水解度

參考徐鑫等[22]的方法測定發酵豆漿的氨基態氮。取發酵豆漿，以去離子水做空白對照，利用甲醛滴定法，記錄使用NaOH 標準溶液（0.1 mol/L）的毫升數。并帶入公式：

式中V為樣品滴定消耗氫氧化鈉體積，mL；V0為空白樣品消耗氫氧化鈉體積，mL；N為NaOH 標準溶液濃度，mol/L。

按《食品安全國家標準，食品中蛋白質的測定：GB 5 009.5-2016》凱氏定氮法進行蛋白質含量的測定，參考吳成[23]的方法進行水解度的測定。其中，W0=0.178，以未處理豆漿氨基氮含量計，W1以產蛋白酶菌株處理豆漿氨基氮含量計，W2為豆漿凱氏定氮得到，結果為2.01 g/100 mL。公式如下：

式中W0為未發酵豆漿中游離氨基酸的濃度，g/100 mL；W1為發酵豆漿中酶解出的游離氨基酸的濃度，g/100 mL；W2為底物濃度，g/mL。4） 感官評定

感官評定分為5 個維度，4 個等級，使用的描述詞匯及評分標準見表1。招募34 名食品專業研究生（11 名男生、23 名女生）組成感官評定小組。測試樣品被盛裝于透明一次性杯中，杯上無樣品名稱，僅有數字編號，品評順序隨機。評分時去掉最高分與最低分后取算數平均值。

表1 發酵豆漿感官評定描述及評分標準Table 1 Description and scoring criteria for sensory evaluation of fermented soymilk

2 結果與分析

2.1 豆醬中產蛋白酶菌株的分離與鑒定

2.1.1 菌落的形態學觀察結果

以東北傳統農家醬為原材料，通過蛋白酶活性篩選平板分離出24 株具有蛋白酶活性的菌株，取含蛋白酶的發酵上清滴加于產蛋白酶菌株篩選培養基。編號后用全自動菌落計數儀（法國）進行水解圈直徑測量，結果如圖1 所示，菌株BJ-2 水解圈最大，直徑為28.7 mm。

圖1 傳統農家醬中菌株水解大豆分離蛋白水解圈Fig.1 Hydrolysis ring of strains in traditional farmhouse sauce to hydrolyze soy protein isolate

選擇其中水解圈直徑最大的8 株菌，進行了菌落形態觀察和顯微鏡檢，通過形態學觀察可知，8 株菌均呈乳白色，均不透明；6 株表面光滑且緣整齊，2 株表面粗糙且邊緣模糊；通過鏡檢可知，8 株菌均為短桿菌，且大多單個存在，具體的菌落形態學描述詳見表2。

表2 傳統農家醬中菌株形態學特征Table 2 Morphological characteristics of strains in traditional soybean paste

2.2 蛋白酶酶活的測定

從圖2 可以看到，菌株產蛋白酶酶活范圍為15.03～35.24 U/mL，其中菌株BJ-15 產量最高，菌株BJ-2 產量最低。菌株測量酶活時選取的是堿性蛋白酶的測定方法，蛋白酶根據活性部位、生理功能、水解條件等分類條件的不同種類極多，其中堿性蛋白酶對大豆蛋白的水解效果相比其他蛋白酶更好[24]，且幾乎所有產蛋白酶微生物都能產生堿性蛋白酶[25-26]，應用也更廣。芽孢桿菌所產蛋白酶可總結為兩類[27]，一種為只含有堿性蛋白酶的Carlsberg 型堿性蛋白酶；另一種為同時含有堿性蛋白酶和中性蛋白酶的Novo 型堿性蛋白酶。兩者相較，Carlsberg 型堿性蛋白酶底物專一性更廣泛，且更加穩定。此外，菌株在測量酶活時，應國標要求，選取的底物為酪蛋白，試驗結果表明菌株對酪蛋白也有水解能力，未來可對菌株所產蛋白酶的底物種類進一步研究，或將這些菌株應用于含酪蛋白的食品中。

圖2 傳統農家醬中菌株蛋白酶酶活Fig.2 Protease enzyme activity of strains in traditional soybean paste

2.3 菌株的分子學鑒定

提取8 株產蛋白酶菌株的基因組為模板，利用引物27F 和1492R 進行16S rDNA 片段擴增，PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，所有泳道均在1 500 bp 左右出現了一條清晰條帶。PCR 產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果在NCBI 上進行Blastn分析。

測序結果如表3 所示，8 株菌從屬層面來看，均為芽孢桿菌屬；從種層面看，可分為6 種，分別為漳州芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌、甲基營養芽孢桿菌和特基拉芽胞桿菌。枯草芽孢桿菌、漳州芽孢桿菌[28]廣泛應用于產堿性蛋白酶研究；貝萊斯芽孢桿菌[29]、暹羅芽孢桿菌[30]、特基拉芽胞桿菌[31]已報道具有抑菌活性，常用于農業或食品保鮮；另外甲基營養芽孢桿菌[32]還具有降解有害物質、保護治理環境的作用。董丹等[33]從發酵初期豆瓣醬中篩選出39 株芽孢桿菌，其中5 株產蛋白酶的芽孢桿菌分別為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和Sonorensis芽孢桿菌，本文篩選菌株與已報道的食源性產蛋白酶菌株在屬水平較為一致。

表3 傳統農家醬中產蛋白酶菌株16S rDNA 序列分析結果Table 3 Results of 16S rDNA sequence analysis of proteaseproducing strains in traditional soybean paste

2.4 安全性試驗

2.4.1 抗生素敏感性試驗

因為抗生素的濫用，菌株耐藥性逐漸提高，為避免超級細菌的產生，抗生素敏感試驗至關重要。前文篩選得到的8 株芽胞桿菌的抗生素敏感性如表4 所示。8 株芽孢桿菌對受試抗生素敏感性基本一致，表現為對慶大霉素、氨芐西林和青霉素中度敏感，對其他抗生素敏感。本實驗菌株均有抗生素敏感性，說明安全性均較高，可以用于后續研究。

表4 傳統農家醬中產蛋白酶菌株耐藥性評價Table 4 Evaluation of drug resistance of protease-producing strains in traditional soybean paste

2.4.2 溶血性、吲哚試驗

試驗結果顯示，所分離的8 株菌在血平板上37 ℃培養18 h 時，均無溶血圈產生，說明8 株菌均不產溶血素；8 株菌在蛋白胨水生理生化管37 ℃培養18 h，加入Kovacs 氏靛基質試劑后，均無顏色變化，說明8 株菌均不會分解色氨酸產生吲哚。

2.5 產蛋白酶菌株在豆漿中的應用

2.5.1 可溶性肽

從圖3 得知，用選取的8 株芽孢桿菌處理后的豆漿可溶性肽含量范圍在170.4～200.9 μg/mL 之間，相較于未發酵豆漿增加了16.4%～37.2%。在確定可溶肽增加的基礎上，后續可以針對肽段的長度、種類等進行更深入的研究，或是通過與其他酶活性菌株混合發酵，進一步改善發酵豆漿品質。通過微生物分泌的各種酶，傳統發酵大豆制品中的蛋白質被水解成小肽，除了能方便吸收外，還能給豆漿增添保健效果，賦予獨特風味[34]。如一些菌株可以產生大豆血管緊張素轉化酶抑制肽，這種酶具有降壓潛力，在調節血壓方面具有重要作用[35]；一些菌株還可以產生抗氧化肽[36]，起到抗氧化效果。

圖3 產蛋白酶菌株處理后豆漿可溶性肽變化Fig.3 Changes of soluble peptides in soymilk after treatment by protease-producing strains

與蛋白酶酶活結合來看，部分菌株在篩選平板上水解圈大，蛋白酶活力高，但可溶性多肽含量較低，主要有兩點原因。第一，本文測定的蛋白酶酶活為堿性蛋白酶酶活，酶活測定緩沖液pH 值為10，但實際豆漿處理體系大約pH 值為6，兩者pH 值不一樣，所以蛋白酶酶活較高的菌株在pH 值為6 的豆漿中應用時，酶活并不一定最好。第二，蛋白酶的底物譜廣，但與不同底物的親和力不同。測定蛋白水解圈時底物是市售大豆分離蛋白（主成分是β-伴球蛋白和球蛋白），測定堿性蛋白酶酶活時所用底物是市售酪蛋白，但在實際豆漿發酵體系中，用的是大豆總蛋白，包括球蛋白[37]、清蛋白[38]等。底物不同，即使是同種酶，也會表現出不同的酶活差異。

2.5.2 豆漿氨基態氮及水解度測定

芽孢桿菌發酵豆漿時，蛋白質水解主要發生在對數生長期，與豆漿pH 值的變化、風味等有關。如圖4a 為不同產蛋白酶菌株處理后豆漿氨基態氮變化，圖4b 為不同產蛋白酶菌株處理后豆漿水解度變化，蛋白酶處理后，豆漿的氨基態氮和水解度顯著增加，效果最好的為菌株BJ-6 處理豆漿，氨基態氮上升了10.87%，水解度為23.49%。本節數據趨勢同樣與水解圈大小及蛋白酶活力不一致，原因與2.5.1 相似，且現有許多文獻的結果也有類似結果。王朋朋[39]篩選得到6 株產蛋白酶的曲霉，其中菌株A6、A8、A15、B3 的蛋白酶酶活分別為1 572.54、1 324.46、1 456.24、1 378.89 U/g，但氨基態氮含量分別為23.57、20.38、20.17、21.57 mg/g，可以看到其結論與本文類似，蛋白酶酶活與氨基態氮含量也無相關性。鄧維琴等[40]從豆瓣醬中篩選出17 株曲霉，其中菌株PCSM002 的蛋白酶酶活大于菌株PCSM001，但在實際應用中，PCSM001 發酵豆瓣醬的氨基態氮含量高于PCSM002 發酵豆瓣醬。

圖4 產蛋白酶菌株處理后豆漿氨基態氮、水解度變化Fig.4 Changes of amino peptide nitrogen and protein hydrolysis degree of soymilk after treatment by protease-producing strains

蛋白水解度除與菌株所產蛋白酶的酶活有關外，還與菌株在豆漿中的生長速度、微生物產酶種類、豆漿的品質等有關[41]。例如：微生物發酵產蛋白酶，將蛋白水解為小肽和氨基酸的同時，微生物也會利用小肽和氨基酸進行生長繁殖，消耗水解產物；又或是微生物除產蛋白酶外，同時產生轉氨酶、脫羧酶等酶系，將氨基酸轉化為胺類化合物；而豆漿的品質則會影響豆漿中的蛋白含量，從而影響水解度。在發酵豆制品中，水解度是監測蛋白水解的重要參數，能夠反映蛋白質的變化情況、營養價值和功能特征。

2.5.3 感官評定

從組織狀態、色澤、氣味、口感和滋味5 個方面對不同菌株發酵的豆漿進行評價，結果見圖5。其中發酵后豆漿的組織狀態和色澤較發酵前均有所提高，但氣味，滋味下降。所有感官評定員反饋，豆漿發酵后豆腥味顯著減少，并有酸味生成，品嘗時入口略苦，但有回甘，類似豆汁口感。其中，豆漿的豆腥味主要源于脂肪氧化生成的醇、醛、酮類化合物[42]，經菌株處理后能有效降低這些具有異味的小分子化合物[43]。而入口略苦可能是因為蛋白質在水解過程中，隨著小分子多肽的生成，疏水性氨基酸殘基暴露，苦味的程度與疏水氨基酸含量有關，疏水氨基酸在多肽中含量越多，苦味越重[44]。而酸味的生成與回甘滋味可能與大豆蛋白水解后，游離氨基酸含量上升，風味物質的釋放有關[45-46]。

圖5 產蛋白酶菌株處理后豆漿感官評定結果Fig.5 Sensory evaluation of soymilk after treatment of proteaseproducing strains

總體來看，菌株BJ-2、BJ-20 為發酵劑的兩個發酵組評價較好。其中，BJ-2 發酵豆漿的組織狀態和色澤分別得分9.5 和8.3 分，BJ-20 發酵豆漿的組織狀態和色澤分別得分9.5 和8.0 分，較發酵前相比明顯改良。感官評定員反饋，兩種發酵豆漿的組織狀態均勻，未見懸浮顆粒物，且呈顯乳白色，略帶光澤。這可能是因為隨著水解度的提高，大豆分離蛋白的相對分子量逐漸減小，其平均粒徑、黏度、持水性降低，溶解性和持油性顯著提高[47]。

3 結 論

本文從東北傳統農家醬中篩選出產蛋白酶的菌株8 株，經鑒定后發現8 株菌均為芽孢桿菌。在確定其安全性后，利用8 株芽孢桿菌處理豆漿。發現相較處理前，豆漿處理后可溶性肽質量分數增加了16.4%～37.2%，處理效果最佳的豆漿氨基態氮含量上升了10.87%，水解度為23.49%。此外，這8 株菌還可有效改良豆漿口感，為豆漿賦予獨特風味。

本文為應用于豆類產品功能菌劑的開發打下基礎，還可作為潛在回添菌劑，應用于東北傳統農家醬工廠化生產。除此之外，本文還驗證了篩選菌株應用于豆漿時的酶解特性，確定菌株對豆漿的水解效果良好，為后續豆漿的營養改良提供了數據支持與理論依據，在未來也可針對蛋白、多肽、氨基酸進行更深入的研究，為豆漿的改良提供更多選擇與研究方向。