兔源多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌多重PCR檢測方法的建立*

張 賀 陶坤盛 陳見興 王豪杰 陳洪巖 王玉娥 夏長友

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室實驗動物與比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團隊,哈爾濱 150069)

隨著生命科學(xué)研究的快速發(fā)展,實驗動物已經(jīng)成為科學(xué)研究中不可或缺的基礎(chǔ)支撐,而實驗兔作為最早使用的實驗動物之一,其需求量呈現(xiàn)持續(xù)上漲[1-2]。然而,在實驗兔集約化和規(guī)模化養(yǎng)殖的過程中,存在著病原菌感染的嚴(yán)重威脅,特別是近年來抗生素的限制性使用,使細(xì)菌性疾病帶來的威脅日趨嚴(yán)重,造成一定的經(jīng)濟損失[3]。兔源多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm),金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus,Sa)和肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,Kp)是引起兔較為嚴(yán)重的傳染病病原菌,其中Pm為革蘭陰性菌,巴氏桿菌科、巴氏桿菌屬,是一種重要的人畜共患病原體,能夠引起包括禽霍亂、豬肺疫和豬萎縮性鼻炎以及兔出血性敗血癥在內(nèi)的多種實驗動物疾病[4]。Sa為革蘭陽性菌,屬于葡萄球菌屬,無鞭毛不產(chǎn)生芽孢,人和畜禽均能感染,兔最為易感,可通過皮膚或黏膜傷口感染,常見癥狀為乳房炎、腳皮炎和皮下膿腫[5-6]。Kp為革蘭陰性菌,是腸桿菌科克雷伯氏菌屬中最為重要的一類病原菌,可引起兔的肺炎、腹瀉、呼吸道感染等,甚至引起敗血病[7-8]。3種病原菌易與其他細(xì)菌和病毒發(fā)生混合感染,加重疾病,通過臨床癥狀和剖檢病變難以準(zhǔn)確判定,因此需借助更為靈敏的方法檢測[9-10]。基因擴增技術(shù)是鑒定細(xì)菌最可靠的方法之一,然而我國目前僅有針對兔源巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的單重或雙重PCR檢測方法。因此,為實現(xiàn)對3種病原菌的同時快速檢測,建立一種兔源多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的多重PCR檢測方法顯得尤為重要。

本研究根據(jù)GenBank中登錄的Pmkmt1、Sanuc和Kpkh1基因序列保守區(qū)域,設(shè)計了3對特異性引物,首先確定多重PCR方法的最適退火溫度、最佳引物濃度,進(jìn)一步驗證該方法的特異性、敏感性、重復(fù)性,最后將該方法與已報道的檢測方法同時對臨床樣品的檢測結(jié)果進(jìn)行對比,表明本研究成功建立了一種能夠同時檢測Pm和Sa以及Kp的多重PCR方法,為兔源多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的鑒別檢測及分子流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料:兔源多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌產(chǎn)氣莢膜梭菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、空腸彎曲桿菌、奇異變形桿菌、禽致病性大腸桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、溶血性曼氏桿菌均由本實驗室分離并保存。89份疑似感染多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌的組織病料采集于不同實驗兔養(yǎng)殖基地。

1.1.2試劑與儀器:pMD18-T載體、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實驗室保存;2×TaqPCR StarMix【寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司】;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒【天根生化科技(北京)有限公司】;核酸蛋白測定儀 Nano-Drop(賽默飛世爾公司);Eppendorf Master-cycler PCR儀(北京佰鷗創(chuàng)投生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計與合成:根據(jù)GenBank中Pmkmt1基因、Sanuc基因和Kpkh1基因的保守序列,利用Oligo7.0軟件設(shè)計特異性引物序列,由睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成(表1),合成后的引物稀釋至10 μmol/L,并保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列

1.2.2單一PCR擴增:分別提取Pm、Sa和Kp的DNA 作為模板,進(jìn)行溫度梯度PCR擴增,反應(yīng)體系(20 μL):2×TaqPCR StarMix 10 μL,上、下游引物各1 μL(10 μmol/L),模板DNA 1 μL,ddH2O補足至20 μL;反應(yīng)程序為:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s、45～60 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s,35個循環(huán);72 ℃ 5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定:利用膠回收試劑盒分別回收1.1.2中擴增的目的條帶,克隆于pMD18-T載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-Pm、pMD-Sa和pMD-Kp,分別轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,選取陽性克隆菌由睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。將測序正確的陽性菌擴大培養(yǎng)后采用質(zhì)粒提取試劑盒分別提取質(zhì)粒pMD-Pm、pMD-Sa和pMD-Kp,用超微量核酸蛋白分析儀測定其濃度并換算為拷貝數(shù),分別作為多重PCR反應(yīng)的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4多重 PCR檢測方法的建立及優(yōu)化:將2.06×1011copies/μL的重組質(zhì)粒pMD-Pm、1.82×1010copies/μL的重組質(zhì)粒pMD-Sa和2.32×1010copies/μL的重組質(zhì)粒pMD-Kp等體積混合后作為模板,利用設(shè)計的3對特異性引物,采用控制變量法,確定各引物最適濃度。反應(yīng)體系(20 μL):2×TaqPCR StarMix10 μL,引物kmt1-F/kmt1-R、nuc-F/nuc-R和kh1-F/kh1-R 各1 μL(10 μmol/L),模板1 μL,用 ddH2O 補充至20 μL,同時以ddH2O代替模板作為陰性對照。進(jìn)一步采用溫度梯度PCR法確定適宜退火溫度(45～60 ℃),擴增程序為:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s、45～60 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s,共35個循環(huán);72 ℃ 5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5特異性實驗:提取Pm、Sa、Kp、兔源支氣管敗血波氏桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等12種病原的DNA并測定濃度,隨即將所有待檢DNA濃度調(diào)整為50 ng/μL后作為模板。同時設(shè)立以重組質(zhì)粒pMD-Pm、pMD-Sa和pMD-Kp混合物為模板的陽性對照及ddH2O陰性對照,利用優(yōu)化的多重PCR檢測方法,評估其特異性。

1.2.6敏感性實驗:將2.06×1011copies/μL的重組質(zhì)粒pMD-Pm、1.82×1010copies/μL的重組質(zhì)粒pMD-Sa和2.32×1010copies/μL的重組質(zhì)粒pMD-Kp,分別用ddH2O進(jìn)行10倍倍比稀釋(101～1010)且等體積混合后作為模板,利用優(yōu)化的多重PCR進(jìn)行檢測,驗證該方法的敏感性。

1.2.7重復(fù)性實驗:應(yīng)用建立的多重PCR進(jìn)行重復(fù)性實驗,批內(nèi)實驗:以pMD-Pm、pMD-Sa和pMD-Kp為模板進(jìn)行PCR擴增,每次實驗做3次重復(fù);批間實驗:分批提取質(zhì)粒pMD-Pm、pMD-Sa和pMD-Kp等體積混合后,在相同條件下分別進(jìn)行3次PCR擴增,以評估該方法的重復(fù)性和可靠性。

1.2.8臨床樣品檢測:將89份來自不同實驗動物兔養(yǎng)殖基地病死兔的肺樣品,按照1∶10 的體積比加入滅菌 PBS 進(jìn)行研磨,將研磨后的病料經(jīng)1 000 r/min 離心 5 min,取上清。按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取核酸;然后利用本實驗建立的多重 PCR 方法進(jìn)行檢測,同時參閱文獻(xiàn)根據(jù)已報道的檢測方法合成引物,進(jìn)行共同檢測并進(jìn)行比較[7,11-12],計算兩種檢測方法的復(fù)合率。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定

分別以kmt1-F/kmt1-R、nuc-F/nuc-R、kh1-F/kh1-R為引物,擴增Pm的kmt1基因、Sa的nuc基因以及Kp的kh1基因的部分片段,大小分別為335、547 和208 bp,與預(yù)期一致,將擴增片段克隆至pMD18-T載體,構(gòu)建的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-Pm、pMD-Sa、pMD-Kp。經(jīng)PCR和測序鑒定,結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。采用超微量核酸蛋白分析儀測定pMD-Pm、pMD-Sa和pMD-Kp重組質(zhì)粒濃度,分別為731.70、60.55和73.65 ng/μL,經(jīng)換算后其拷貝數(shù)分別為2.06×1011、1.82×1010和2.32×1010copies/μL,并將質(zhì)粒分裝存放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 單一及多重PCR檢測的建立

分別以kmt1-F/kmt1-R、nuc-F/nuc-R和kh1-F/kh1-R為引物,pMD-Pm/pMD-Sa/pMD-Kp為模板,采用溫度梯度PCR法進(jìn)行Pm、Sa和Kp的單一PCR擴增,結(jié)果顯示只有Pm、Sa和Kp能夠擴增出特異性條帶;陰性對照組無擴增條帶(圖1)。后將目的條帶切膠回收后測序,結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致,表明建立的多重PCR可以同時擴增Pm、Sa和Kp的目的條帶。

M:DL2000 DNAMarker;1.單一PCR擴增nuc基因保守區(qū);2.單一PCR擴增kmt1基因保守區(qū);3.kh1基因保守區(qū)單一PCR擴增;4.多重PCR擴增;5:水對照

2.3 多重PCR檢測方法的優(yōu)化

通過對退火溫度和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化,確定多重PCR的最佳反應(yīng)體系(20 μL):2×TaqPCR StarMix 10 μL,kmt1-F/kmt1-R各1 μL(10 μmol/L),nuc-F/nuc-R各1 μL(10 μmol/L),kh1-F/kh1-R各0.5 μL(10 μmol/L),模板pMD-Pm和pMD-Sa各1 μL,pMD-Kp 0.5 μL,ddH2O補足至20 μL;最佳反應(yīng)條件為:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s、54.5 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s,35個循環(huán);72 ℃ 35 s。結(jié)果表明,利用優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴增,可同時且清晰的擴增出約335、547 和208 bp的目的條帶(圖2)。

注:A.多重PCR退火溫度;M:DL2000 DNA Marker;1～8.退火溫度分別為45.0、46.0、48.0、50.8、54.5、57.5、59.1、60 ℃;B.選擇多種PCR引物濃度;M:DL2000 DNA Marker;1～3.Kp引物濃度為1 μmol/L, Pm和Sa引物濃度分別為1、0.75和0.5 μmol/L;4～6.Kp引物濃度為0.75 μmol/L,Pm和Sa引物濃度分別為1、0.75和0.5 μmol/L;7～9.Kp引物濃度為0.5 μmol/L, Pm和Sa引物濃度分別為1、0.75和0.5 μmol/L;

2.4 特異性實驗

利用已優(yōu)化的多重PCR方法,對各病原菌的DNA進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示:只有Pm的335 bp片段、Sa的547 bp片段和Kp的208 bp片段能擴增出目的條帶,而其他病原基因組以及陰性對照均無特異性條帶,表明該方法特異性強(圖3)。

注:M.DL2000 DNA Marker;1.金黃色葡萄球菌;2.兔源多殺性巴氏桿菌;3.肺炎克雷伯菌;4.產(chǎn)氣莢膜梭菌;5.鼠傷寒沙門菌;6.銅綠假單胞菌;7.肺炎鏈球菌;8.空腸彎曲桿菌;9.變形菌;10.禽致病性大腸桿菌;11.支氣管桿菌;12.溶血曼海姆癥;13.水

2.5 敏感性實驗

將2.06×1011copies/μL的重組質(zhì)粒pMD-Pm、1.82×1010copies/μL的重組質(zhì)粒pMD-Sa和2.32×1010copies/μL的重組質(zhì)粒pMD-Kp分別進(jìn)行等體積混合后10倍倍比稀釋作為模板。結(jié)果顯示,pMD-Pm的檢測下限是20.6 copies/μL,pMD-Sa 檢測下限是18.2 copies/μL,pMD-Kp 檢測下限是23.2 copies/μL(圖4),表明該方法敏感性較高。

注:M.DL 2000 bp Marker;1～8.分別為1×107～1×100 copies/μL的混合重組質(zhì)粒;9.水

2.6 重復(fù)性實驗

利用建立的多重PCR檢測方法進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性實驗,結(jié)果顯示該方法擴增條帶均一致(圖5),表明該多重PCR方法具有良好的重復(fù)性。

圖5 多重PCR的批內(nèi)(1～3)及批間(4～6)實驗

2.7 臨床樣品檢測

利用本實驗建立的多重PCR 方法與已報道文獻(xiàn)中單重PCR檢測方法中所使用的引物分別對 89 份疑似感染樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,Pm、Sa 和 Kp 的陽性率分別為62.92%、25.84%和 49.43%,Pm 與 Sa 混合感染陽性率為 37.08%,Pm 與Kp 混合感染陽性率為 19.10%,Sa 和 Kp 的陽性率分別為 16.85%,Pm、Sa 和 Kp 混合感染陽性率為 12.36%,與這3種病原已報道的PCR 檢測方法的檢測結(jié)果復(fù)合率為 100%。表明本研究建立的多重 PCR 方法準(zhǔn)確性高,臨床應(yīng)用性好(表2)。

表2 臨床樣品檢測結(jié)果(%)

3 討論

隨著生命科學(xué)在我國的快速發(fā)展,實驗兔的需求量日益增長,病原菌的傳播對其產(chǎn)生的危害進(jìn)一步得到重視。兔多殺性巴氏桿菌病、金黃色葡萄球菌病和肺炎克雷伯菌病是危害實驗兔最為嚴(yán)重的3種傳染病之一,對實驗兔的養(yǎng)殖造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失[13-14]。其中兔多殺性巴氏桿菌病和肺炎克雷伯菌病為條件性致病菌,能引起兔的呼吸道疾病和敗血病等,金黃色葡萄球菌病為引起兔敗血癥的主要病原菌,3種病原菌具有相似的臨床癥狀,很難通過病理剖檢和簡單的染色鏡檢來區(qū)分,并且易于其他病原菌發(fā)生混合感染和繼發(fā)感染,給實驗兔的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[15]。目前,雖然已經(jīng)有針對Pm、Sa和Kp的診斷方法,如參考文獻(xiàn)[16]建立的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)檢測Pm的方法,該方法雖然具有簡單易行、特異性高的優(yōu)點,但是假陽性率較高,并且易受污染。有研究[17-18]采用免疫學(xué)原理建立的ELISA方法進(jìn)行檢測Sa,雖然具有操作簡單,靈敏性好的特點,但是也不可避免地存在檢測費時,成本較高的缺陷。有研究[7,11-12]建立的分別針對Pm、Sa和Kp的實時熒光定量PCR的方法雖具有簡化步驟,交叉污染小的優(yōu)點,但同時也存在假陰性的局限性。另外,與普通PCR相比,該方法的實驗條件要求高,價格昂貴。相比之下,普通PCR具有操作簡單、價格便宜和實驗條件要求低的優(yōu)點,目前還沒有關(guān)于此3種病原菌的多重PCR檢測方法的報道,因此,建立一種操作便捷、特異性強、敏感性高、可實現(xiàn)同時檢測Pm、Sa和Kp的多重PCR檢測技術(shù)極為重要。

本研究針對Pmkmt1基因、Sanuc基因和Kpkh1基因保守區(qū)域設(shè)計并篩選出3對特異性引物,通過優(yōu)化反應(yīng)條件,建立了可以同時檢測Pm、Sa和Kp的多重PCR方法。該方法特異性強,僅對Pm、Sa和Kp有特異性擴增片段,而對兔源支氣管敗血波氏桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等9種病原體均無擴增條帶。并且其敏感性高,對pMD-Pm的檢測下限是20.6 copies/μL,pMD-Sa的檢測下限是18.2 copies/μL,pMD-Kp的檢測下限是23.2 copies/μL。此外,批內(nèi)和批間實驗結(jié)果均一致,表明本方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。通過對疑似感染Pm、Sa和Kp的樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示Pm、Sa和Kp陽性率分別為62.92%、25.84%和49.43%,Pm、Sa和Kp的混合感染陽性率為12.36%,與已報道的檢測方法符合率100%,表明本研究建立的多重PCR方法準(zhǔn)確性高,在臨床診斷中具有良好的應(yīng)用價值。

綜上所述,本研究針對Pm、Sa和Kp 3種嚴(yán)重危害實驗兔養(yǎng)殖建立的多重PCR方法特異性強、敏感性高、穩(wěn)定性好、效率高,可用于實驗兔的生產(chǎn)過程中疑似兔感染多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的快速鑒別診斷,為預(yù)防實驗兔的多殺性巴氏桿菌病、金黃色葡萄球菌病和肺炎克雷伯菌病提供有力的技術(shù)支持,具有廣闊的應(yīng)用前景。