基于Nrf2/HO-1信號通路研究黛玉膏對肛瘺大鼠血管生成的影響*

郭 偉 閆麗霞 常少青 劉振麗

(1.保定市第二醫(yī)院 肛腸科,保定 071050)(2.河北省第七醫(yī)院 影像科,保定 073000)

肛瘺是指直腸或肛管與肛周皮膚相通所形成的異常通道,中醫(yī)稱為“肛漏”“痔漏”“穿腸漏”等,為常見肛腸疾病,患病率為8.6/105例[1]。肛瘺治療以手術(shù)為主,但術(shù)后存在疼痛劇烈、創(chuàng)面愈合緩慢等問題[2]。中醫(yī)藥外用在肛瘺治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢[3]。黛玉膏針對肛瘺濕熱郁結(jié)而致癰潰不愈的病機(jī)而設(shè),能夠收濕斂瘡、生肌止血,臨床研究表明其能縮短創(chuàng)面愈合時間,減輕術(shù)后并發(fā)癥,可能與提高創(chuàng)面血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平有關(guān)[4]。為進(jìn)一步明確其作用靶點(diǎn),本研究通過建立大鼠模型,深入探討其干預(yù)的信號通路,為臨床應(yīng)用提供新的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物:10周齡雄性SPF級SD大鼠(200±20)g共30只,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號【SCXK(京)2021-0011】,使用許可證號【SYXK(京)2017-0023】。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d,室溫(22±2)℃,采用12 h∶12 h晝夜間斷照明,自由飲食飲水。本實(shí)驗(yàn)已通過保定市第二醫(yī)院福利倫理審查,審查編號:IACUC-20210307-12。

1.1.2主要試劑和儀器:黛玉膏(由保定市第二醫(yī)院藥劑科加工制備,組成成分:煅爐甘石7.5 g,煅石膏107.5 g,赤石脂7.5 g,青黛50 g,滑石100 g,黃柏50 g,藥物混合充分研磨成粉,過100目篩2次,加入麻油調(diào)成膏劑備用);大鼠VEGF ELISA檢測試劑盒、大鼠血管VEGFR ELISA檢測試劑盒(上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司)、大鼠血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)ELISA檢測試劑盒(北京諾為生物技術(shù)有限公司)、大鼠表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)ELISA檢測試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β ELISA檢測試劑盒、大鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒、大鼠IL-10 ELISA檢測試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA檢測試劑盒(均碧云天生物技術(shù)研究所)、兔抗核因子2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroiD-2-related factor 2,Nrf2)一抗(ab137550)、兔抗血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)一抗(ab52947)、兔抗CD31一抗(ab182981)、兔抗β-actin一抗(ab8227),試劑購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

PeriFlux 5000型激光多普勒血流儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);5804R高速冷凍離心機(jī)(德國艾本德股份公司);奧林巴斯生物顯微鏡 OLYMPUS BX43(日本奧林巴斯株式會社);BioTek ELx808酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司);164505電泳系統(tǒng)、ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠肛瘺模型的建立及分組:采用綜合法構(gòu)建肛瘺術(shù)后創(chuàng)面大鼠模型[5-6],術(shù)前備皮,5% 戊巴比妥鈉(戊巴比妥40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,肛門部手術(shù)區(qū)備皮消毒,采用創(chuàng)傷制作器在脊柱旁側(cè)0.5 cm處切割直徑約為1.8 cm的圓形創(chuàng)口,且肌層傷口深度約為0.3 cm,止血后在創(chuàng)面上加糞液1 mL,固定(油紗、敷料、膠帶),48 h后去除覆蓋物,若見傷口有膿性分泌物與糞臭味出現(xiàn),表示造模成功。將成功建立的20只肛瘺術(shù)后創(chuàng)面大鼠,根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表,按大鼠體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組(n=10)及黛玉膏組(n=10);另選擇10只僅造成創(chuàng)口后不敷以糞液作為對照組。黛玉膏組大鼠使用藥物涂抹傷口,對照組和模型組以0.9%氯化鈉溶液擦洗,紗布包扎傷口,每天2次。造模成功后當(dāng)天開始治療,各組大鼠均連續(xù)干預(yù)14 d,后以過量麻醉藥注射處死,收集創(chuàng)面組織用以后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2創(chuàng)面愈合情況及局部血流監(jiān)測:于第3天藥物干預(yù)結(jié)束后,采用透明格子膠片測量局部創(chuàng)面面積,創(chuàng)面愈合率=【原始創(chuàng)面面積(術(shù)后3 d)-當(dāng)前創(chuàng)面面積藥物干預(yù)結(jié)束】/原始創(chuàng)面面積術(shù)后3 d×100%[7]。應(yīng)用激光多普勒血流儀,所有大鼠均記錄隨機(jī)3處創(chuàng)面血流情況,并經(jīng)Power Lab Chart數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)計(jì)算3處創(chuàng)面血流取均值進(jìn)行分析。

1.2.3HE染色:中性多聚甲醛固定創(chuàng)面組織,并用石蠟包埋,乙醇梯度脫水,二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片。將切片進(jìn)行粘片、烤片,脫蠟,梯度乙醇復(fù)水后進(jìn)行抗原修復(fù)。用CD31抗體染色(1∶300)。封片后光學(xué)顯微鏡下觀察陽性染色。

1.2.4ELISA操作步驟:取肛瘺創(chuàng)面組織勻漿檢測VEGF、VEGFR、EGF、PDGF、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平,嚴(yán)格按照說明書操作,將標(biāo)準(zhǔn)品按照說明書操作方法梯度稀釋后,另取待測樣品孔加樣50 μL并設(shè)空白孔,后于每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL(空白孔除外),封板膜封板并置37 ℃恒溫箱溫育60 min,每孔加滿洗滌液靜置15 s棄去,重復(fù)5次,先后加入顯色劑A、B各50 μL,37 ℃避光顯色15 min,加終止液 50 μL,450 nm 波長依序測量各孔的吸光度并進(jìn)行濃度計(jì)算。

1.2.5Western blot法檢測Nrf2及HO-1表達(dá)水平:采用Western blot法檢測創(chuàng)面組織Nrf2及HO-1蛋白水平。使用RIPA高效組織裂解液提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度并加入5×SDS蛋白上樣緩沖液(按1∶4的比例)煮沸后備用。每孔加入40 μg樣品或3 μL Marker進(jìn)行電泳,濃縮膠電壓90 V,20 min,分離膠電壓120 V,45 min,電泳后轉(zhuǎn)膜,3%BSA(體積分?jǐn)?shù)0.5%TBST)封閉1 h。孵育一抗,分別用Nrf2兔單克隆抗體(1∶1 500)、HO-1兔單克隆抗體(1∶1 500),β-actin兔單克隆抗體(1∶2 000),4 ℃孵育過夜,后以TBST洗3次。山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫下孵育1 h后,TBST洗3次,每次5 min。ECL曝光顯影,Image J圖像處理軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的創(chuàng)面愈合率比較

與對照組相比,模型組和黛玉膏組的創(chuàng)面愈合率顯著下降(P<0.05);與模型組相比,黛玉膏組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著升高(P<0.05);與對照組比較,模型組和黛玉膏組顯著下降,而黛玉膏組較模型組顯著升高(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠的創(chuàng)面恢復(fù)情況比較

2.2 各組大鼠創(chuàng)面CD31陽性率比較

CD31免疫組化染色結(jié)果顯示(圖1),與對照組比較,模型組肉芽組織CD31染色陽性面積顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,黛玉膏組大鼠肉芽組織,CD31染色陽性面積顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注:與對照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05

2.3 各組大鼠肉芽組織炎性因子水平比較

與對照組比較,模型組和黛玉膏組大鼠肉芽組織IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,黛玉膏組大鼠肉芽組織IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠肉芽組織炎性因子水平比較

2.4 各組大鼠肉芽組織血管生成調(diào)控因子水平

與對照組比較,模型組肉芽組織VEGF、VEGFR、EGF、PDGF水平均顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組和對照組相比,黛玉膏組大鼠肉芽組織VEGF、EGF、PDGF水平均顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,黛玉膏組大鼠肉芽組織VEGFR顯著增高(P<0.05),見表3。

表3 各組大鼠肉芽組織血管生成調(diào)控因子水平比較

2.5 各組大鼠創(chuàng)面組織Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)水平比較

與對照組相比,模型組的Nrf2、HO-1蛋白顯著降低(P<0.05);與模型組和對照組相比,黛玉膏組大鼠創(chuàng)面組織Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)水平均顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

注:與對照組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

3 討論

肛管直腸瘺,簡稱肛瘺,為肛管或直腸腔與肛門外皮膚相通的一種異常管道,中醫(yī)亦稱“痔漏”“漏瘡”“單漏”[8]。瘺最早見于《素問·生氣通天論篇》:“陷脈為瘺,留連肉腠”。《醫(yī)宗金鑒·外科心法要訣·痔瘡篇》釋曰“破潰而出膿血,黃水浸淫,淋漓久不止者,為漏”。肛瘺一般由內(nèi)口、瘺管和外口三部分組成,也有只有內(nèi)口或外口者[9]。內(nèi)口多為原發(fā)性,多數(shù)位于肛竇內(nèi)。外口是繼發(fā)的,在肛門周圍皮膚上,口不只一個[10]。其特征為瘺管內(nèi)口多位于肛竇內(nèi),管道穿過肛門直腸周同組織,外口位于肛周皮膚,經(jīng)常有膿性分泌物由外口流出,每因外口閉合而致局部腫痛,繼而在原外口處或附近重新潰破出膿,如此反復(fù)發(fā)作,經(jīng)久不愈[11]。中醫(yī)學(xué)將肛瘺的病因歸納為肛癰潰后、虛癆久咳、外感六淫、飲食不節(jié)、內(nèi)傷七情、痔久不愈、肛周氣血運(yùn)行不足,而致毒邪集聚,最終穿腸透穴,敗壞肌肉,消損骨髓,而為之瘺[12]。

黛玉膏針對肛瘺的病機(jī)而設(shè),方由煅爐甘石、煅石膏、赤石脂、滑石、青黛、黃柏組成,其中煅爐甘石、煅石膏、滑石、赤石脂性平味甘,入肝、胃經(jīng),能夠收濕斂瘡,青黛、黃柏苦寒能夠清熱燥濕解毒;諸藥相合,共奏燥濕解毒、拔腐生新之功[4]。以往的臨床研究表明,黛玉膏外用能夠減輕肛瘺患者術(shù)后創(chuàng)面的疼痛,促進(jìn)創(chuàng)面愈合,其機(jī)制可能與增加創(chuàng)面 VEGF 表達(dá)、促進(jìn)創(chuàng)面血管生成和成纖維細(xì)胞聚集有關(guān)[4]。VEGF 對血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、擴(kuò)散、分化具有重要作用,是目前已知的作用最強(qiáng)的促血管生長因子,此外也能促進(jìn)肉芽生長,加速上皮化[13]。CD31表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞,血小板等,是標(biāo)記組織中血管的經(jīng)典指標(biāo)。研究通過建立大鼠肛瘺模型研究發(fā)現(xiàn),使用綜合法造模能成功建立肛瘺模型,而黛玉膏能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合、減輕創(chuàng)面病理損傷,抑制炎性因子表達(dá)而促進(jìn)血管生成相關(guān)因子的表達(dá),提高創(chuàng)傷部分血管數(shù)量和血流量。目前,關(guān)于黛玉膏發(fā)揮創(chuàng)面修復(fù)作用的基礎(chǔ)研究較少,但關(guān)于其組分的藥理作用已有報道。如煅石膏可以通過水通道蛋白(aquaporin,AQP)升高AQP1、AQP3的表達(dá),促進(jìn)急性軟組織損傷的修復(fù)[14];爐甘石可以促進(jìn)肉芽組織中的新生毛細(xì)血管生成,增加受損創(chuàng)面的血供,加速創(chuàng)面恢復(fù)[15];青黛能夠促進(jìn)皮損和黏膜創(chuàng)傷愈合,近期研究表明其能抑制皮損的炎性細(xì)胞浸潤[16];減輕網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明,黃柏中的有效成分能夠靶向炎性和血管新生通路相關(guān)分子治療創(chuàng)面損傷[17]。以上數(shù)據(jù)表明使用綜合法造模能成功建立肛瘺模型,而黛玉膏可能通過促進(jìn)創(chuàng)面局部的血液循環(huán)、抑制炎性反應(yīng)而加速肛瘺的好轉(zhuǎn)。

創(chuàng)面愈合過程中,肉芽的生長速度和質(zhì)量是愈合的關(guān)鍵[18]。為進(jìn)一步探索其促進(jìn)血管新生、增高血流量促進(jìn)愈合的機(jī)制,本研究進(jìn)一步檢測了Nrf2/HO-1信號通路的表達(dá)水平。Nrf2轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,在細(xì)胞面對不良環(huán)境刺激時可被激活[19]。激活后Nrf2與內(nèi)源性抑制因子 Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like ECH associated protein1,Keap1)結(jié)合,發(fā)生核轉(zhuǎn)位并與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)結(jié)合,調(diào)控下游基因表達(dá)[20]。其中HO-1的啟動子區(qū)富含ARE區(qū)域,是Nrf2下游最重要的基因之一[21]。HO-1是一種可將血紅素降解產(chǎn)生膽綠素、亞鐵離子和一氧化碳的水解酶,大量研究已經(jīng)報道了HO-1在創(chuàng)傷愈合、腫瘤以及其他疾病中是重要的調(diào)控血管新生的因子[22]。如HO敲除小鼠表現(xiàn)出皮膚傷口愈合障礙及血管新生減少[23];類似的,使用小分子化合物抑制HO-1/CO信號可以顯著降低血管新生水平[24]。另外,Nrf2/HO-1信號通路可以上調(diào)諸多血管新生因子的表達(dá),如EGF、VEGF和 PDGF[25]。最后,有文獻(xiàn)報道了Nrf2/HO-1與炎性因子的表達(dá)密切相關(guān)[26]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠創(chuàng)面組織的Nrf2及HO-1的水平較對照組顯著降低,而涂抹黛玉膏后,Nrf2及HO-1的水平升高,表明其可以激活Nrf2/HO-1通路從而發(fā)揮促進(jìn)血管新生的作用。

綜上,本研究結(jié)果表明,黛玉膏可以促進(jìn)肛瘺模型大鼠創(chuàng)面的愈合,促進(jìn)肉芽組織的血管新生,其機(jī)制可能與激活Nrf2/HO-1通路有關(guān)。但血管新生涉及多條信號通路,因此黛玉膏的藥理作用還有待進(jìn)一步研究。