犬嗅辨人肺癌敏感性和特異性研究*

高常青 陳志恒 李晶晶 周 曉

(1.中南大學湘雅醫院動物實驗中心,長沙 410008)(2.中南大學湘雅三醫院健康管理中心,長沙 410013)(3.湖南省腫瘤醫院,長沙 410031)

犬能夠嗅辨特殊人群或帶瘤患者不僅是一個有趣的醫學問題,更是一個關乎物種功能的生命科學問題,盡管不乏相關報道,但一直缺乏科學嚴謹的實驗設計,可信度受到質疑。基于此,從典型癌癥患者入手,科學、嚴謹地開展犬嗅辨能力測定,將有助于了解物種功能以及可能的早期癌癥預警協助診斷。

惡性腫瘤是目前危害人類健康的主要疾病和掠奪人類生命的頭號殺手,在2020年全球癌癥統計報告解讀中,肺癌是全球癌癥致死的首位原因,占癌癥致死總數的18%[1]。早診斷早治療可明顯改變肺癌患者的生存率[2],是治療惡性腫瘤并獲得良好預后的最重要手段。由于腫瘤早期基本上沒有明顯的癥狀和體征,所以目前大多數腫瘤確診時都已到了中晚期。目前篩查早期腫瘤的方法尚不完善。例如,用CT等影像學方法篩查肺癌,不僅經濟上不能承受,而且還會導致患者不必要的暴露于放射線。因此,建立一種新的既敏感又無創傷的篩查肺癌的方法是項極為緊迫的任務。

在傳統的動物實驗中,多是將藥物給與實驗動物,然后觀察比較實驗組與對照組動物的區別,或者通過轉基因等手段造模后再在動物體內實驗。但是,動物還有許多生物學功能沒有充分開發利用,本研究的目的是通過檢測經過訓練的犬嗅辨人類肺癌的敏感性和特異性,嘗試開發實驗動物新的用途,達到充分利用實驗動物生物學特性的目的。

1 對象和方法

1.1 參與對象

臨床病理確診為肺癌的患者25例,健康志愿者127例,作為實驗對照。經簽署知情同意書后,每人空腹抽血5毫升。收集的血樣靜置2 h后取血清凍存至-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1犬的訓練:比利時牧羊犬2只,一雄一雌,自2月齡開始訓練,飼養于中南大學實驗動物學部,環境溫度控制在20～26 ℃,濕度控制在40%～70%,采用12 h∶12 h晝夜間斷照明。犬自由飲食,每天戶外自由活動1 h以上。在犬0～3歲期間,實驗人員A用食物刺激法與響片訓練法進行嚴格訓練,使得嗅辨犬具有良好的服從性,隨后進行不同階段的嗅辨訓練。

1.2.2嗅認強化訓練:在空曠安靜且地面平坦的環境下,地面擺放形狀大小一致且分別編碼的嗅辨罐,嗅辨罐放置不同內容物(食物或玩具),實驗人員A引導犬進行逐一嗅認,讓犬養成自如的嗅認能力,犬每當嗅到一個目標物品時,給予響片刺激,并根據指令讓犬完成規定動作,給予食物獎勵。此過程需至少完成100次,且嗅辨準確性達到 90%以上,進行下一階段訓練。

1.2.3氣味鑒別訓練:在犬嗅認嗅源后,讓犬嗅認隨機擺放的鑒別罐,正確時響片標記。此過程需至少完成100次,嗅辨準確率達到90 %以上,進行下一階段訓練。

1.2.4單盲實驗訓練:每組設置6個嗅辨罐,其中1個為目標氣味罐(肺癌患者血液樣本),其余為陰性對照氣味罐(健康志愿者血液樣本),由實驗人員B隨機安排擺放位置并做好記錄,實驗人員A讓犬依次逐個嗅認鑒別罐,當犬對某一嗅辨罐發出示警行為時,實驗人員B給出正確與否示意,實驗人員A根據示意給予響片確認。此過程需至少完成100次,且嗅辨準確率達到 90%以上,進行下一階段實驗。

1.2.5雙盲實驗:采用雙盲法對犬的嗅辨準確性和特異性進行評價。實驗人員C將匹配好的6個塑料袋密封標本(1個肺癌樣本和5個健康志愿者樣本)置于桌上并做好記錄,用隨機數字重新編號設盲。實驗人員C將所有實驗組記錄信息保密,直到研究結束。實驗人員B在對實驗樣本信息不知情的情況下,將隨機編號的樣本分別放進嗅辨罐中,并排成一條直線,由實驗人員A示意犬依次嗅辨。當犬臥在某一罐前面即表明犬提示此罐中有陽性樣本,由實驗人員B記錄結果。整個雙盲實驗過程中,實驗人員A與實驗人員B對陽性樣本位置與編號均不知情。待所有實驗完成后,由實驗人員C將實驗人員B記錄的實驗結果與設盲前的記錄信息進行比較,計算出犬嗅辨的敏感性和特異性。敏感性超過90%的犬方可用于實驗。

1.3 統計學分析

只有當2只犬都示警的標本才考慮為陽性標本,單只犬示警則仍記為陰性標本。敏感性=犬正確識別的肺癌患者樣本數量/(犬正確識別的肺癌患者樣本數量+犬誤判為肺癌的健康志愿者樣本數量)。特異性=犬正確識別的健康志愿者樣本數量/(犬正確識別的健康志愿者樣本數量+犬識別為肺癌的健康志愿者數量)。敏感性和特異性及陽性預測值和陰性預測值用MedCalc 19計算。

2 結果

2.1 參與者人口學資料

2014年5月至2015年12月,有200名肺癌患者,平均年齡(54.18±1.50)歲;1 000名健康志愿者,平均年齡(56.00±1.59)歲,貢獻他們血液用于犬的訓練。2016年1月采集127名健康志愿者血液進行雙盲研究,平均年齡(55.10±1.44)歲,性別與肺癌患者匹配,經過5年的追蹤未發現他們當時患有任何腫瘤。同時間段內,采集25名自愿者參與本研究的晚期肺癌患者血液,患者平均年齡(56.78±1.65)歲,肺癌分類如表1。

表1 肺癌患者臨床資料分析

2.2 犬嗅辨雙盲實驗結果

25例肺癌患者全部嗅出,另有1名志愿者被2條嗅辨犬示警為陽性。經計算,犬嗅辨肺癌的敏感性為100%(95% CI:86.3%～100.0%);127名健康志愿者中126名準確嗅辨為陰性,特異性為99.2%(95% CI:95.7%～99.9%),陽性預測值(犬嗅辨為陽性的肺癌患者的比例)為96.2%(95% CI:78.0%～99.4%),陰性預測值(犬嗅辨為陰性的無肺癌參與者的比例)為100%,準確率99.3%。

3 討論

研究表明,犬的嗅覺系統的特殊構造決定了其具有嗅辨人類癌癥的潛能。與人類大約10 cm2的嗅覺上皮相比,犬的嗅覺上皮為170 cm2,是人類的17倍;犬的嗅覺受體超過2億,是人類的40倍。犬的嗅覺受體受到更豐富的神經支配,加上鼻子的特殊構造,極便于它分辨吸進的氣味[3]。本研究發現經過訓練的犬,的確能夠嗅辨肺癌,且準確率達99%以上。

國外自2004年開始系統研究犬嗅辨人類膀胱癌[4],近年陸續有報道用犬嗅辨人類疾病,如乳腺癌[5],宮頸癌[6]以及新冠病毒[7]等。本實驗室從2011年開始訓練犬嗅辨肺癌,經過多年努力,犬的工作性能已經穩定。本研究結果是訓練3年的犬檢測結果,與上述國外實驗室的研究結果接近。

多項研究證明,參與者吸煙與否對犬嗅辨沒有影響。近期有國內實驗人員研究了犬嗅辨肺癌的影響因素[8],發現吸煙對犬嗅辨的結果沒有顯著影響。作者采用口罩采集參與者呼出氣體,分別在病房環境和非病房環境采集樣本,研究采樣環境對結果的影響,發現與空白測試條件相比,醫院環境能影響犬的嗅辨。但與對照組相比,醫院環境對犬嗅辨沒有顯著影響。本研究采用血清作為鑒別介質,充分避免了環境因素的干擾。有研究[8]對照組的參與者都在30歲以內,Case-Control沒有配對,實驗沒有排除年齡、性別的影響。而本研究采用了年齡與性別配對,避免了相關因素的干擾,將實驗變量控制在了盡可能小的范圍。

國外研究證明犬嗅辨早期和晚期腫瘤的能力是一致的[9]。因此,經過訓練后的犬有可能成為篩查早期腫瘤的敏感工具。也正因為如此,我們對對照組的參與者觀察5年后確定其在采樣時為健康志愿者才進行報道,這樣才最大可能的避免假陰性的發生(犬示某一志愿者為陽性,但當時的體檢為陰性,但實際上該志愿者為早期肺癌;如果沒有長期觀察,很可能判定犬嗅辨結果為錯誤)。

大量事實證明,腫瘤具有多種生物標志物[10],包括揮發性生物標志物[11]。如肌氨酸可作為犬嗅辨前列腺癌的標志物[12],患者的尿液含有揮發性有機化合物可用于診斷各種癌癥[13],而用于癌癥診斷的揮發性有機化合物通常由多種物質組成[14]。在醫療工作中,當某些晚期腫瘤患者走近我們時,我們就能感覺到某種特有的氣味,有經驗的工作人員由此能做出初步判斷。到目前為止,已有大量報道用頂空氣相色譜—質譜聯用(HS/GC-MS,Headspace/gas chromatography-mass spectrometry)或其他分析化學的方法能夠檢測出腫瘤患者體內所含的不同于正常人體內的成分。我國學者在2005年報導用HS/GC-MS測得肺癌患者血液中己醛(hexanal)和庚醛(heptanal)的含量明顯高于正常人[15],有報道[16]稱肺癌患者呼出氣體中的乙醇、醛、酮和烴(hydrocarbons)顯著高于正常人,而有研究[17]卻發現丙烷、二硫化碳、異丙醇等的含量在正常人與肺癌患者呼出氣體中含量有顯著差別。類似的工作在細胞水平也進行了研究。有研究[18]比較正常肺細胞與肺癌細胞A549培養液頂空氣體成分,發現肺癌組中二甲基琥珀酸等7項有機物成分比對照組顯著增高。此外也有研究表明,不管是新鮮血液還是分解的血液樣本,揮發性標志物均顯示出特定化合物的差異[19]。

犬具有對惡性腫瘤的辨認能力的證據最初來源于它對主人惡性黑色素瘤的預警[20]。接下來的實驗證明犬通過尿樣辨認膀胱癌的概率高于完全隨機的發生率[4]。進一步實驗表明通過嗅辨患者呼出氣體,犬能辨認肺癌、乳腺癌[6]及直腸癌[5],通過血漿能辨認卵巢癌[9]等。但是,這些研究都有一個共同不足,即對照組的參與者都沒有經過長期觀察,不知道采樣時他們是否患有腫瘤。為了克服此缺點,本研究在采樣及實驗后,還對正常對照人群進行了5年跟蹤觀察確定是否患有腫瘤。這樣設計雖然耗時較長,但結果更加可靠,在國內外未見報道。

實驗動物是指經過人工培育,遺傳背景清晰,微生物得到控制,用于檢疫和科學實驗等研究的動物[21]。本研究使用的嗅辨犬是由本實驗室培育,其遺傳背景清晰,飼養于實驗動物設施內,定期進行微生物檢測與驅蟲預防,用于疾病的鑒別,屬于實驗動物的范疇。傳統的利用實驗動物進行檢驗檢疫的方法,是將受試物飼喂或者接種于實驗動物,然后觀察比較實驗組和對照組動物的差別。本研究是利用實驗動物的生物學特性進行檢驗,拓展了實驗動物的應用范圍。本研究的局限性在于樣本量仍然偏小,主要原因是在年齡、性別配對的要求下,很難收集到大量的志愿者樣本。因此,本研究的結果有待大樣本量的檢驗。

總之,實驗動物的許多生物學特性尚未得到充分利用,實驗動物的功能有待進一步開發。本研究是對實驗動物應用的一個新的嘗試。同時,建立一種新的既敏感又無創傷的篩查肺癌的方法對于我國經濟社會具有重要的意義。而鑒定出肺癌揮發性標志物,對下一步訓練新犬篩查早期肺癌,或對將來通過儀器檢測揮發性標志物來篩查肺癌,都具有關鍵的作用。