擴(kuò)張型心肌病動(dòng)物模型的建立與評(píng)估

張 冬 朱瑾彥 張 敏 李 彬

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京積水潭醫(yī)院,胸外科 北京 100037)(2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,國家心血管病中心,阜外醫(yī)院,心血管疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,心血管植入材料臨床前評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,北京 100037)

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM),是指以單側(cè)或雙側(cè)心腔擴(kuò)大、心肌收縮期功能減退、伴或不伴有充血性心力衰竭為主要特征的心肌病[1]。在我國發(fā)病率為13/10萬～84/10萬不等。迄今為止,病因不明[2-4]。其明顯的病理改變主要以心腔擴(kuò)張為主,可見室壁變薄,心肌纖維化加重并伴有癜痕形成。病理組織學(xué)表現(xiàn)為:心肌細(xì)胞的非特異性肥大、變性,特別是程度不同的纖維化等病變混合存在[5-7]。

本病的病程長(zhǎng)短不等,可表現(xiàn)為充血性心力衰竭,以往認(rèn)為癥狀出現(xiàn)后5年的存活率只有40%左右[8]。因?yàn)镈CM病因不明,預(yù)后較差,且目前除心臟移植,并無特異、有效的治療方法,故臨床上對(duì)于DCM的研究必要而迫切。為深入研究DCM的發(fā)生發(fā)展特點(diǎn),建立相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是一種十分有效的手段。為此,旨在探索建立DCM的犬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?并對(duì)其模型的有效性及穩(wěn)定性予以評(píng)估。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用成年比格犬10只(雌雄不限,體質(zhì)量10～20 kg), 購于北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司, 生產(chǎn)許可證號(hào)【SCXK(京)2015-0005】，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,使用許可證號(hào)【SYXK(京)2017-0015】。實(shí)驗(yàn)室溫度20～25 ℃,相對(duì)濕度50%～70%,換氣次數(shù)每小時(shí)8～10次,采用12 h/12 h晝夜間斷照明。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳標(biāo)編號(hào),自由攝食、飲水,實(shí)驗(yàn)方案通過阜外醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審查,倫理審批號(hào):0092-3-20-ZR(X)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:正常對(duì)照組(CTL組):4只;擴(kuò)張型心肌病模型組(DCM組):6只。

1.1.2主要儀器設(shè)備:麻醉機(jī)(ACM619,北京航天長(zhǎng)峰股份有限公司醫(yī)療器械分公司)、心電監(jiān)護(hù)儀(MP50)、彩色多普勒超聲心動(dòng)儀(IE33)(飛利浦公司)、ACT測(cè)量?jī)x及耗材(ACTⅡ,HEMOCHRON)、24 h動(dòng)態(tài)心電圖機(jī)(Reveal XT 9529)、植入式心電事件監(jiān)測(cè)器(ICM)(LNQ11,美敦力)、心臟電生理刺激儀(DF-5A,蘇州東方電子儀器廠)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑:異氟烷(山東科源制藥有限公司)、丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪注射液(北京賈森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司)、鹽酸利多卡因注射液(中國大冢制藥有限公司)、地高辛(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)、呋塞米(常州千紅生化制藥股份有眼公司)、注射用頭孢氨芐(華北制藥股份有限公司)、華法林(Orion)、氯化鉀注射液(中國大冢制藥有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1DCM動(dòng)物模型的建立:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉采取氣管插管及全身麻醉,麻醉試劑使用丙泊酚(4～12mg/kg)誘導(dǎo)麻醉和異氟烷(2%～4%)吸入維持麻醉。呼吸機(jī)輔助呼吸,潮氣量12 mL/kg,維持血氧飽和度100%。

動(dòng)物常規(guī)麻醉后,股動(dòng)脈穿刺,穿刺順利后置入5F鞘管,透視下將5F的Judkins導(dǎo)管置入左冠狀動(dòng)脈,在左主干注入阿霉素(多柔比星)。阿霉素溶解于20 mL 0.9%氯化鈉溶液中,每次的注射劑量為0.7 mg/kg。每周注射一次,連續(xù)注射5周。

正常對(duì)照組同樣進(jìn)行麻醉,麻醉后同樣置入導(dǎo)管,在相同位置注射等量不含阿霉素的0.9%氯化鈉溶液。每周注射一次,連續(xù)注射5周。成模標(biāo)準(zhǔn):LVEF<30%。

1.2.2超聲心動(dòng)圖檢查:末次注射4周后對(duì)全部分組動(dòng)物進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查。

動(dòng)物在麻醉狀態(tài)下,取胸骨旁長(zhǎng)軸切面, 在二維超聲引導(dǎo)下用M 型超聲進(jìn)行測(cè)量,計(jì)量資料連續(xù)測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期取平均值。測(cè)定指標(biāo)包括:左房?jī)?nèi)徑(LA)、左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑(LVESD)、室間隔厚度(IVSD)。每搏輸出量(SV)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)及左室短軸縮短率(FS)。

1.2.3血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定:動(dòng)物在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行血液動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)。采用多導(dǎo)生理記錄儀及心導(dǎo)管技術(shù)測(cè)量左室壓力曲線,測(cè)定左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升/下降速度(dp/dtmax)。每次測(cè)量均取連續(xù)10個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

1.2.4血液學(xué)檢測(cè):末次注射4周后對(duì)全部動(dòng)物抽6 mL靜脈血完成血常規(guī)、生化檢查、凝血及心臟相關(guān)檢查。

1.2.5心室重構(gòu)評(píng)價(jià)

1.2.5.1組織病理學(xué)纖維化程度檢測(cè):病理學(xué)檢查均為左心室心尖部同一位置處心肌結(jié)構(gòu)的對(duì)比,從而排除不同部位心肌結(jié)構(gòu)改變所帶來的影響;同時(shí)對(duì)同一位置處心肌結(jié)構(gòu)多點(diǎn)(>3)取材進(jìn)行病理切片檢查,進(jìn)而排除病理切片制片過程中的影響。

將動(dòng)物安樂死,取出心肌組織于4% 多聚甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,組織切片后行常規(guī)HE染色和Masson染色,于光鏡下觀察心肌組織纖維化及病理形態(tài)改變。應(yīng)用Image Pluse 5.1 計(jì)算機(jī)軟件分析檢測(cè)心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF),CVF 為心肌纖維化面積與心肌總面積比值。

1.2.5.2免疫組化檢測(cè)組織Collagen I/III水平:對(duì)組織內(nèi)的Collagen I/III進(jìn)行免疫組化檢測(cè),半定量測(cè)定。采用蛋白免疫印跡(Western blot)法:處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后取心肌組織標(biāo)本100 mg, 剪碎、離心,用BCA 法測(cè)定蛋白濃度,經(jīng)非連續(xù)梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上置于封閉液中,室溫溫育1 h,再加入一抗,Ⅰ型膠原蛋白抗體、Ⅲ型膠原蛋白抗體、4 ℃冰箱搖床上過夜,應(yīng)用洗液漂洗,再加入二抗,室溫?fù)u床上培育1 h,然后用洗液漂洗。最后將顯色劑加入硝酸纖維膜上,1 min 后放入暗室曝光。經(jīng)軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DCM動(dòng)物模型的建立

DCM動(dòng)物模型冠脈造影及藥物注射過程如圖1所示。

注:冠脈造影確定左冠狀動(dòng)脈開口位置,自左冠脈動(dòng)脈主干注射多柔比星(實(shí)驗(yàn)組)或者等量的0.9%氯化鈉溶液(對(duì)照組)

2.2 DCM動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2.1心臟超聲及血液動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果:如圖2所示,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組在建模后左房?jī)?nèi)徑(LA)、左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑(LVESD)、室間隔厚度(IVSD)均出現(xiàn)明顯增大(P<0.05);每搏輸出量(SV)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)、左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升/下降速度(dp/dtmax)均出現(xiàn)明顯降低(P<0.05),詳見表1。

表1 末次注射4周后心臟超聲檢測(cè)結(jié)果

注:A～C.對(duì)照組,D～F.模型組,與對(duì)照組相比,模型組左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)等出現(xiàn)明顯降低,左房?jī)?nèi)徑(LA)、左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑(LVESD)等出現(xiàn)明顯擴(kuò)大

2.2.2血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果:血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,除白細(xì)胞計(jì)數(shù)外,其余各項(xiàng)指標(biāo),DCM組建模后均出現(xiàn)明顯差異(P<0.05),詳見表2。

表2 末次注射4周后血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.3 心室重構(gòu)評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1組織病理學(xué)纖維化程度檢測(cè):如圖3所示,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的大體觀察:與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均出現(xiàn)了不同程度的心臟擴(kuò)大,部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)左心耳陳舊性血栓,左房出現(xiàn)明顯擴(kuò)張,心房肌菲薄,左心室內(nèi)壁出現(xiàn)部分纖維增生。

注:A.DCM組標(biāo)本大體觀;B.DCM組左心房:左房出現(xiàn)明顯擴(kuò)大,左房心肌菲薄;C.DCM組左心耳:左心耳出現(xiàn)陳舊性血栓;D.DCM組左心室:心室擴(kuò)大,出現(xiàn)部分纖維結(jié)構(gòu)樣增生

如圖4所示,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材后進(jìn)行常規(guī)HE染色和Masson染色:與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組可見明顯的結(jié)構(gòu)損傷,例如:心肌斷裂等結(jié)構(gòu)損傷。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組心肌纖維化程度明顯增加(P<0.05)。

注:A.對(duì)照組HE染色;B.實(shí)驗(yàn)組HE染色;C.對(duì)照組Masson染色;D.實(shí)驗(yàn)組Masson染色;E.與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)明顯的纖維化,*P<0.05

2.3.2免疫組化組織Collagen I/III結(jié)果:如圖5所示,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材后對(duì)心肌組織進(jìn)行Collagen I/III的定量檢測(cè),與對(duì)照組相比,DCM組心肌組織內(nèi)的Collagen I/III含量明顯升高,說明DCM組的心肌纖維化程度明顯升高(P<0.05)。

*P<0.05

3 討論

擴(kuò)張型心肌病,其病因較復(fù)雜,且目前臨床上仍缺少有效治療方法,患者愈后較差。因此建立理想的動(dòng)物模型,模擬人類 DCM 的病理變化及病情發(fā)展,對(duì)于DCM 的發(fā)病機(jī)制、治療效果等臨床研究非常重要。

擴(kuò)張型心肌病的建模方法較多,有通過轉(zhuǎn)基因的技術(shù)實(shí)現(xiàn)的,例如把cTnTR14IW基因克隆入心臟特異表達(dá)的 c-MHC 啟動(dòng)子下游,構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體[9];也有研究[10]用同種方法成功構(gòu)建cTnCi59轉(zhuǎn)基因小鼠模型。與cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠模型相比,該模型發(fā)病時(shí)間較晚,12月齡時(shí)才出現(xiàn)明顯表現(xiàn),且無猝死發(fā)生,故可作為老年發(fā)病的 DCM 模型;另外還可以通過自身免疫性缺陷來實(shí)現(xiàn),例如將7周齡 SPF 級(jí)雄性Lewis大鼠,隨機(jī)分為模型組和正常對(duì)照組。DCM組將10 mg/mL的豬心肌球蛋白與等體積的弗氏完全佐劑(含有結(jié)核分支桿菌H37Ral mg/mL)進(jìn)行充分乳化后,在實(shí)驗(yàn)第1天和第8天在大鼠左右后肢足墊皮下各注射上述乳化液0.1 mL。結(jié)果顯示:DCM組大鼠均出現(xiàn)足部潰瘍,且心腔擴(kuò)大,心室壁回聲增強(qiáng)、運(yùn)動(dòng)減弱,甚至出現(xiàn)矛盾運(yùn)動(dòng);心肌細(xì)胞變性、肥大,局灶性壞死,心肌間質(zhì)膠原纖維增生等DCM表現(xiàn)[11];還有利用柯薩奇病毒進(jìn)行的建模實(shí)驗(yàn),例如采用4周齡小鼠,腹腔內(nèi)注射0.1 mL 10-柯薩奇病毒,以后每4周腹腔內(nèi)重復(fù)接種,結(jié)果顯示:心臟彩色超聲心動(dòng)圖檢測(cè)病毒組小鼠心腔普遍擴(kuò)大,呈普大心型,心室壁活動(dòng)度明顯減弱。組織病理學(xué)特征與人類擴(kuò)張型心肌病的病理形態(tài)特征極為相似[12];還有利用呋喃唑酮建立DCM模型的方法將哺乳至2周齡的近交系SD 大鼠隨機(jī)分為呋喃唑酮組和對(duì)照組。將呋喃唑酮配成43 mg/mL的溶液,按0.3 mg/g體質(zhì)量,下胃管喂飼,每日1次,每周按體質(zhì)量調(diào)整用藥劑量,喂飼8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:DCM 模型不僅出現(xiàn)與人類相同的活體形態(tài)學(xué)改變、組織病理改變而且具有相同的神經(jīng)內(nèi)分泌變化[13]。

DCM 造模方法多種多樣,但是以小動(dòng)物模型居多,大動(dòng)物模型建模周期較長(zhǎng),或者建模方法較復(fù)雜,均一性較差。目前國內(nèi)仍缺乏DCM大動(dòng)物模型建立與評(píng)估的相關(guān)報(bào)道。

有研究[14]將出生4周的雌性SD大鼠,隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組給予多柔比星腹腔內(nèi)注射,每周2 mg/kg ,連續(xù)8周。對(duì)照組腹腔內(nèi)注射與實(shí)驗(yàn)組等量的0.9%氯化鈉溶液,每周1次,連續(xù)8周。大鼠在用藥第9周時(shí)麻醉,進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查及心肌組織切片。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組3只大鼠出現(xiàn)心包積液,均有不同程度的心腔擴(kuò)張和射血分?jǐn)?shù)下降,心肌細(xì)胞變性、壞死,并有明顯心肌間質(zhì)纖維化。還有學(xué)者[15]采用短期3周大劑量腹腔注射多柔比星(15 mg/kg)的方法成功建立了 DCM 模型,但死亡率較高,發(fā)病較急,與DCM 慢性發(fā)展過程不相符合。利用多柔比星建立小動(dòng)物模型的報(bào)道較多,但是目前仍缺少DCM大動(dòng)物模型的建模經(jīng)驗(yàn)與方法[16-18]。

本實(shí)驗(yàn)旨在探索建立犬的DCM動(dòng)物模型,通過冠脈造影確定左冠狀動(dòng)脈主干開口,予以多次冠脈注射多柔比星,每周一次,連續(xù)注射5周,末次注射4周后予以取材評(píng)估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,DCM動(dòng)物模型組出現(xiàn)了明顯的全心擴(kuò)大,且心肌收縮力出現(xiàn)明顯的降低;血液學(xué)檢查顯示DCM動(dòng)物模型組內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)了紊亂,其肝、腎功能的各項(xiàng)指標(biāo)均出現(xiàn)了明顯的升高,血色素、血小板出現(xiàn)了明顯降低;動(dòng)物取材時(shí)發(fā)現(xiàn)其心臟出現(xiàn)擴(kuò)大,部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左心耳可見血栓,病理學(xué)檢測(cè)及Collagen I/III的定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),DCM動(dòng)物模型組出現(xiàn)了明顯的心肌纖維化,心室重構(gòu)較對(duì)照組明顯加重。

擴(kuò)張型心肌病動(dòng)物模型的建立常使用阿霉素藥物建模,既往研究中小動(dòng)物模型較多,如小鼠或者大鼠,大動(dòng)物模型建模較少,如犬或者豬。阿霉素具有毒性反應(yīng),其建立擴(kuò)張型心肌病的動(dòng)物模型會(huì)產(chǎn)生全身毒性反應(yīng),如肝、腎毒性損傷,所以在大動(dòng)物模型建立時(shí)我們選擇了冠脈給藥,藥物由冠脈注射,可以最大程度的降低全身反應(yīng)情況,加重心肌毒性反應(yīng),進(jìn)而完成擴(kuò)張型心肌病建模。但即便是冠脈給藥也會(huì)出現(xiàn)肝、腎毒性,其無法避免阿霉素的全身毒性反應(yīng)。目前在國內(nèi)外相關(guān)研究中,擴(kuò)張型心肌病小動(dòng)物模型冠脈給藥困難,所以仍選擇外周靜脈或者是腹腔內(nèi)注射給藥。本次建模選擇了阿霉素冠脈給藥途徑,其建模效果良好,成功建立擴(kuò)張型心肌病模型。因阿霉素冠脈給藥建模效果良好,故未再設(shè)立外周靜脈或者腹腔內(nèi)注射的建模模型組,后期我們將進(jìn)一步探究模型的相關(guān)建立方法,并進(jìn)一步對(duì)比分析其建模效果。

采用冠脈多次注射阿霉素(多柔比星)的方法建造DCM動(dòng)物模型,具有可行性及有效性,其周期較短、簡(jiǎn)單易行,并且更接近于人類 DCM 病理生理過程。