布魯氏菌抗體鑭系高敏熒光快速檢測試劑盒的研制

章 健，侯 巍，張朝輝，曲 伍，李 勁，尹 杰，郇 敏，王澤洲，*

（1.成都微瑞生物科技有限公司，四川 成都 611731；2.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041；3.四川省甘孜州動物疫病預防控制中心，四川 康定 626000；4.四川省涼山州動物疫病預防控制中心，四川 西昌 615000；5.浙江省桐廬縣農業農村局，浙江 桐廬 311500）

布魯氏菌病（簡稱布病）是由布魯氏桿菌引起的以生殖器官和黏膜發炎，流產、不育和多種組織局部病灶為特征的人畜共患慢性接觸性傳染病。在家畜中牛羊最常發生，豬次之，而且可傳染其他家畜和人，嚴重危害人類健康，同時給養殖業造成巨大的經濟損失［1-2］。疫苗免疫是控制動物布病的有效方法，目前常用的疫苗有豬型2 號苗，羊型5 號苗、A19 號苗。疫苗免疫后的抗體監測，是控制和凈化布病的主要措施之一。目前國內主要采用虎紅平板凝集試驗（RBPT）、試管凝集試驗（SAT）、ELISA、膠體金技術等檢測布病，這些方法各有優缺點，普遍適用于實驗室檢測。為了實現在基層和養殖場的快速即時檢測，本試驗應用鑭系元素作熒光標記物研制了一種布魯氏菌抗體高敏熒光免疫層析快速檢測試劑盒（Bru-LFICA）。

1 材料與方法

1.1 材料 布魯氏菌脂多糖抗原（LPS）、布魯氏菌脂多糖抗原（LPS）單克隆抗體，鑭系熒光納米微球和Wellray?WR-1608高敏熒光分析儀；兔抗雞IgY 抗體、雞IgY 抗體；吸水紙、樣品墊、硝酸纖維素膜，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），N-羥基琥珀亞胺，切條機和點膜噴金膜機，其他試劑均為國產分析純。牛、羊O型、A型口蹄疫陽性血清，布魯氏桿菌陽性血清及陰性血清均購自青島立見診斷發展中心，臨床血清樣品由筆者單位收集保存。

制備包被膜、脂多糖LPS 抗原標記微球、免疫競爭法建立等均參照說明書或按照相關要求操作［3-4］。

1.2 熒光免疫層析試紙條的組裝 在濕度小于30%，溫度20～25 ℃的環境下，把吸水紙、標記物墊和樣品墊按順序粘貼在聚氯乙烯底板上形成微反應體系，然后將其切割成0.5 cm寬，即成試紙條（圖1），將試紙條裝入卡殼中制成檢測卡，裝入鋁箔袋封存備用。

圖1 鑭系熒光免疫層析法結構示意圖

1.3 特異性試驗 試驗選用牛、羊O 型、A 型口蹄疫陽性血清進行布病抗體高敏熒光免疫層析檢測，同時設牛、羊布病陽性、陰性對照，以確定該試驗方法是否發生交叉反應。

1.4 敏感性試驗 將布病強陽性血清按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560 倍比稀釋，每個稀釋度平行做4 個重復，用建立的Bru-LFICA 檢測，同時進行虎紅平板凝集試驗，判斷其抗體效價。

1.5 重復性試驗

1.5.1 批內重復性試驗 在相同條件下選取12份布病抗體水平不同的血清，每份血清樣本平行做8個重復，用組裝的Bru-LFICA試劑盒檢測（批號為20170912），然后對檢測結果進行統計學分析。

1.5.2 批間重復性試驗 在相同條件下選取12份布病抗體水平不同的血清，分別用4 批Bru-LFICA 試劑盒檢測（批號分別為20170426、20170616、20171123、201780119），然后對檢測結果進行統計學分析。

1.6 試劑盒的組裝及穩定性試驗 Bru-LFICA試劑盒由熒光檢測儀、檢測卡、連接線組成。試劑盒置4 ℃保存，分別于保存后60、120、180、240、300、360、420、480、540 d 對布病陽性和陰性參考血清進行檢測，并對結果進行統計學分析。

1.7 比對試驗 選用221 份牛血清樣本進行試管凝集試驗，選用203 份牛血清樣本進行虎紅平板凝集試驗，選用31份陰、陽性牛血清和31份陰、陽性羊血清樣本進行布病間接ELISA 試驗，選用100份陰、陽性牛血清樣本進行美國ELISA檢測，同時用Bru-LFICA試劑盒檢測，比較其敏感性、特異性和符合率。

1.8 應用試驗 用本次研制的Bru-LFICA 試劑盒檢測各地市送檢的布病樣本1 736 份，了解布病血清抗體陽性率。

2 結果

2.1 測定條件的選擇 按照鑭系熒光免疫層析法的操作步驟，選擇標記比例為1∶25 的免疫微球；選擇樣本稀釋倍數為10 倍的加樣量；選擇檢測時間為加樣后15 min。

2.2 檢測結果的判讀 加樣后，由于層析作用液體向前移動，先后與包被在T 線和C 線上的抗體形成復合物，這時試紙條經熒光檢測設備掃描顯示出2 條熒光帶（圖2）。C 線熒光掃描值基本一致，T 線值隨加樣中抗體濃度的增加而降低。相應的檢測結果以濃度為橫坐標，阻斷率（1-T/T0）為縱坐標，經數據線性回歸處理后，擬合得出標準曲線（圖3）。當樣本為陰性時，布魯氏菌抗體濃度很低，T 線熒光值很高；當樣本為陽性時，布魯氏菌抗體濃度越高，T線熒光值越低，甚至檢測不出信號。無論是陽性還是陰性結果，C 線總能顯示熒光，如果C 線沒有熒光顯現，無論T 線有無，結果均判為無效。

圖2 熒光微球免疫層析技術檢測布魯氏菌抗體的掃描圖譜

圖3 熒光微球免疫層析技術檢測布魯氏菌抗體的標準曲線

2.3 特異性試驗 本試驗用牛、羊O 型、A 型口蹄疫陽性血清，經Bru-LFICA 檢測，結果得出阻斷率（1-T/T0）值均低于10%（表1），呈陰性反應；對牛、羊布魯氏菌陽性血清都呈陽性反應；對牛、羊布魯氏菌陰性血清都呈陰性反應。表明該方法與牛、羊O型、A型口蹄疫陽性血清不發生交叉反應，顯示出很好的特異性。

表1 特異性試驗結果

2.4 敏感性試驗 當布病強陽性血清稀釋至1∶640時，高敏熒光檢測仍為陽性，而虎紅平板凝集試驗只能檢測到1∶80 倍稀釋（表2）。證明該方法敏感性很好。

表2 敏感性試驗結果

2.5 重復性試驗 批內重復性試驗和批間重復性試驗的變異系數分別小于5%和10%。表明該方法具有良好的重復性。

2.6 試劑盒穩定性試驗 如表3 所示，Bru-LFICA試劑盒保存540 d后用于檢測陽性血清、陰性血清，其變異系數均小于10%，說明該診斷試劑盒保存18個月仍然穩定有效，進一步的穩定性試驗還在進行中。

表3 穩定性試驗結果

2.7 比對試驗

2.7.1 高敏熒光與虎紅平板、試管凝集試驗的比較 選用203份牛血清同時進行高敏熒光和虎紅平板凝集試驗，結果表明其敏感性為100.00%，特異性為80.80%，符合率為88.18%。且高敏熒光方法的敏感性更高，能夠檢出虎紅平板漏檢的陽性樣本。

選用221份牛血清同時進行高敏熒光和試管凝集試驗，結果表明其敏感性為100.00%，特異性為88.97%，符合率為93.21%。且高敏熒光方法能檢出試管凝集試驗漏檢的陽性樣本。

2.7.2 高敏熒光與中監所ELISA方法的比較 選用31 份牛血清同時用中監所牛布病間接ELISA與高敏熒光法檢測，結果表明其敏感性為100.00%，特異性為93.75%，符合率為96.77%。選用31 份羊血清同時用中監所羊布病間接ELISA與高敏熒光法檢測，結果表明其敏感性、特異性和符合率均為100.00%。

2.7.3 高敏熒光與美國ELISA 方法的比較 試驗選用100 份牛血清，同時用美國產ELISA 與高敏熒光法進行檢測，結果表明其敏感性為79.59%，特異性為94.12%，符合率為87.00%。

2.8 應用試驗

2.8.1 采集同一養羊場的血清，同時進行虎紅平板試驗、試管凝集試驗和高敏熒光法檢測，結果得出：虎紅平板試驗的陽性檢出率為53.72%，試管凝集試驗的陽性檢出率達到77.98%，高敏熒光法的陽性檢出率達到92.44%（表4）。

表4 三種方法檢測布魯氏菌陽性血清的檢出率比較

2.8.2 應用本次研制的Bru-LFICA 試劑盒檢測各地市送檢的1 736 份樣本，檢出血清抗體陽性134份，陽性率為7.72%。

3 討論

3.1 試管凝集試驗是我國法定的布病檢測方法，但操作繁瑣、費時、不適于大批量抗體檢測，也受人為主觀因素的影響［5］。ELISA是目前應用最廣、發展最快的免疫檢測技術，具有敏感性高、特異性強、人為因素影響相對較小，檢查微量、無輻射、高通量等優點，但需要比較完備的實驗設備，操作人員得具有一定的專業技術水平和經驗，檢測一批樣品的流程至少需要2～4 h，在基層獸醫站和養殖場的推廣應用受到了一定的限制［6］。PCR 方法通常用作抗原檢測，需要專門的實驗室、儀器設備和專業技術人員，且成本較高。

3.2 鑭系高敏熒光免疫層析方法（LFICA）是結合了時間分辨熒光免疫分析法和層析技術而建立起來的一種超微量快速免疫檢測技術，具有靈敏度高、特異性強、穩定性好、無污染，且測定范圍寬，試劑盒壽命長，操作簡單和無放射性等優點。本研究建立的Bru-LFICA，既具有膠體金免疫層析法（GICA）簡單、方便、快捷、適于基層等優點，又具有ELISA敏感、特異、微量等優點，通過專用設備檢查克服主觀臆斷，采用鑭系元素作熒光標記克服了產品質量不穩定的缺陷，檢測時間從2～4 h縮短到15～20 min，檢測不需要專業技術人員，檢測設備小巧便于攜帶，尤其適用于基層獸醫部門、養殖場和技術服務人員。