一株藏豬源奇異變形桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

楊佳欣，王遠微

（西南民族大學動物醫學四川省高等學校重點實驗室，四川 成都 610041）

奇異變形桿菌是一種條件性致病菌，當機體免疫力下降時會引起肺炎、尿路感染、腸炎等病癥，同時它又是引起人類食物中毒的病原之一。近年來由奇異變形桿菌引發的動物疾病越來越多，發病動物的日齡較小，臨床表現主要是腹瀉，耐過動物的生長發育也會嚴重受阻，給畜禽養殖業造成很大的損失。2023年3月16日，甘孜州某藏豬場的仔豬出現高體溫、低食欲、精神萎靡、喜臥地不愿活動、呼吸困難、拉稀等癥狀，送檢發病仔豬的腸道樣本到本實驗室進行檢測。筆者對臨床送檢的病料進行了細菌分離以及形態學、染色特性、生化特性及16S rDNA基因同源性分析等一系列鑒定，并作藥敏檢測，以期為發病養殖場防控該病提供治療依據。

1 材料與方法

1.1 病料樣本 臨床樣品采集自甘孜州某藏豬場發生腹瀉的斷奶仔豬的十二指腸。

1.2 主要試劑和儀器 LB 液體培養基、革蘭氏染液、腸桿菌科細菌生化鑒定管、SS培養基、藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司生產；細菌DNA提取試劑盒、PCR 聚合酶預混液，諾唯贊生物技術有限公司生產；核酸染料、DNA MarkerII、電泳緩沖液，全式金生物有限公司生產；電泳儀、照膠儀、PCR 儀，生物安全柜，電子天平，普通光學顯微鏡，高壓鍋和恒溫培養箱。

1.3 細菌的分離純化 用灼燒冷卻后的接種環無菌蘸取腸道樣本劃線接種TSA 培養基和SS 培養基，做好標記，37 ℃培養24 h后，從TSA培養基和SS培養基上選擇2～3個疑似菌落進行染色鏡檢。將鏡檢后的菌落接種到SS 培養基上獲得純培養物，將純化細菌接種到5 mL LB 液體培養基中擴繁，將擴繁后的純培養物保存于終濃度為20%的甘油中，-80 ℃凍存備用。

1.4 生化鑒定 將新鮮的分離菌接種于生化鑒定管中，觀察微量生化鑒定管的反應情況，結合生化編碼鑒定管說明書，對分離菌進行生化鑒定。

1.5 16S rDNA序列同源性分析 將分離菌接種于LB液體培養基中培養至對數期，使用DNA提取試劑盒提取分離菌的總DNA。用16S rDNA通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，1492R：5'-TACGCYTACCTTGTTACGACTT-3'）擴增分離細菌的16S rDNA基因片段。反應體系：DNA模板2 μL，2×Tan Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 6 μL，共20 μL。按照如下反應條件進行PCR 反應：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性60 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環30 次；最后72 ℃延伸10 min。配制1.2%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳（120 V電壓，100 mA電流），待PCR 產物充分分離時放入照膠儀上拍照。將符合預期大小的目的條帶送至上海生物工程技術服務有限公司測序。將測序獲得的序列與NCBI核酸序列數據庫進行同源性比對，鑒定屬種。

1.6 藥敏試驗 采用紙片擴散法進行藥敏試驗。將單克隆菌落取出制成菌液，在無菌條件下將菌液涂布于平板之上，靜置等待水分被吸收干凈后，將藥敏紙片分區放置于平板內，37 ℃恒溫培養24 h 后，測量每個藥敏片的抑菌圈直徑，根據產品說明書判斷細菌對藥物的敏感性。

2 結果

2.1 分離純化結果 從病料中分離到的細菌能很好地生長于SS瓊脂培養基上，形成邊緣略微透明、表面濕潤光滑、中央有黑色凸起的圓形、露珠狀菌落，直徑在0.5～1.0 mm（見圖1）。革蘭氏染色鏡檢結果如圖2所示，分離菌染色呈紅色，革蘭氏陰性，形狀為短桿和長桿，多數為短桿狀，無芽孢和莢膜。

圖1 SS培養基上的生長情況

圖2 革蘭氏染色特性（1 000×）

2.2 生化鑒定結果 選取SS培養基上的典型菌落進行生化試驗。分別與葡萄糖、山梨醇、枸櫞酸鹽、尿素、鳥氨酸脫羧酶、硫化氫反應呈陽性，與賴氨酸脫羧酶、乳糖、靛基質、甘露醇、七葉苷反應呈陰性，生化特征與《伯杰細菌鑒定手冊》中奇異變形桿菌的一致。

2.3 16S rDNA 序列同源性分析結果 用細菌16S rDNA通用引物對分離菌的DNA進行PCR擴增，將擴增后的產物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在照膠儀下檢測，顯示擴增目的片段的大小約為1 500 bp，和預期一致，結果見圖3。從圖中結果可以看出細菌的16S rDNA 序列得到了有效擴增。將PCR 擴增產物送到上海生物工程技術服務有限公司進行基因測序，結果獲得片段大小為1 410 bp 的序列。把該測序結果與NCBI 核酸數據庫進行同源性比對，結果顯示分離菌與奇異變形桿菌16S rDNA基因的相似性為99%，確定該菌株為奇異變形桿菌。

圖3 PCR檢測結果

2.4 藥敏試驗結果 藥敏試驗結果詳見表1。該豬源奇異變形桿菌分離株對頭孢他啶、慶大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、氟苯尼考、氧氟沙星、麥迪霉素等藥物敏感，對鏈霉素、環丙沙星、頭孢哌酮中度敏感，而對青霉素、阿莫西林、頭孢曲松、頭孢氨芐、頭孢噻吩、頭孢呋辛、四環素、強力霉素、恩諾沙星、諾氟沙星、多粘菌素B、紅霉素、桿菌肽、磺胺異惡唑、復方新諾明、克林霉素、氨芐西林、卡那霉素、新霉素等19 種藥物耐藥。

表1 藥敏試驗結果 mm

3 討論

3.1 奇異變形桿菌的分離鑒定 奇異變形桿菌作為一種人畜共患病病原，不但造成養殖業的重大經濟損失，而且還嚴重威脅著人類的健康［1-3］。近年來，全國各地養豬場暴發奇異變形桿菌病的報道不斷攀升［4-8］。有些豬場奇異變形桿菌病病情反復，嚴重的可以導致80%以上的發病率和高達60%的病死率，給發病豬場帶來極大的經濟損失，因此該病已經引起了養殖場的高度重視［9-12］。奇異變形桿菌病的發病日齡、臨床癥狀、剖檢變化與沙門氏菌比較相似，因此臨床確認需要進行實驗室檢測輔助［13］。本研究從甘孜州某藏豬場臨床出現體溫升高、精神沉郁、腹瀉的病豬剖檢病料中分離獲得了一株革蘭氏陰性短桿菌，經鑒定該菌的培養特性和生化特性與奇異變形桿菌基本一致。

16S rDNA 序列同源性分析作為一種未知細菌的鑒定技術，已經被國際上諸多研究機構所認可，可以用該方法快速確認細菌的種屬，同源性在99%～100%之間即可認定為同種，同源性在97%～99%可認定為同屬［8］。從純化平板中挑取單個菌落制成菌懸液，用16S rDNA 通用引物進行PCR 擴增，獲得約1 500 bp 大小的目的條帶，對PCR 產物測序，所獲得的序列與NCBI 核酸數據庫比對，發現分離菌與奇異變形桿菌16S rDNA基因的相似性為99%，故可確定該分離菌為豬源奇異變形桿菌。

3.2 奇異變形桿菌病的臨床用藥 在細菌性疾病的治療上，目前最常采用且最有效的方法還是抗生素療法。奇異變形桿菌是革蘭氏陰性兼性厭氧菌，一般對氨基糖苷類、喹諾酮類及磺胺類藥物比較敏感［14］。但當前細菌耐藥性問題普遍存在，如果不進行敏感藥物的篩選，臨床用藥的治療效果都不太理想，因此非常有必要對分離菌株進行敏感藥物篩選。本次藥敏試驗結果表明，該奇異變形桿菌分離株只對慶大霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考、阿米卡星、氧氟沙星、頭孢他啶、麥迪霉素等藥物敏感，對鏈霉素、環丙沙星、頭孢哌酮中度敏感，而對青霉素等19 種藥物耐藥。

臨床上很多養殖戶通過大量添加抗生素來防治諸如奇異變形桿菌等細菌病，這些都導致奇異變形桿菌對抗生素的耐藥譜逐漸擴大。董萌萌等［4］報道，奇異變形桿菌對先鋒霉素IV、氨芐西林、先鋒霉素VI、新霉素、先鋒霉素V、四環素、美洛西林、強力霉素、卡那霉素等耐藥。葛強等［15］研究發現，奇異變形桿菌分離株對22種抗生素呈現不同程度的耐藥，對多西環素、四環素、磺胺甲惡唑、氨芐西林的耐藥率達100%，對頭孢噻肟、頭孢呋辛、亞胺培南、頭孢氨芐的耐藥率在57.1%以上。

本次藥敏試驗結果從一定程度上表明，該豬場在養殖過程中存在嚴重濫用抗生素的情況，對19 種藥物耐藥，用藥情況不樂觀。為了更好、更有效地防治該病，建議在采用藥物防治時，應先進行體外藥敏試驗，根據試驗結果針對性地選擇敏感藥物，從而有效防控該病。本研究為該豬場后續用藥提供了參考，在對豬源奇異變形桿菌病的治療過程中，可從7 種敏感抗生素中適當選擇用藥，同時考慮多種抗生素配合使用或輪換使用，避免長期使用同一種抗生素。